This work was supported by grants from the National Institutes of Health, including a microphysiological systems consortium grant from the National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), a Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Postdoctoral Fellowship (F32DK098905 for WJM) and pathway to independence award (DK095984 for AB) from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

Yerli Çözünür Kolajen Çözüm 1. Hazırlık <ol><li> Hazırlama ya da 1-3 mg / örneğin Piez ve arkadaşları tarafından rapor edildiği gibi standart ayırma protokollerini kullanarak ml. 15 de sıçan kuyrukları kolajen asitleştirildi çözünür, tip 200 mg satın </li><li> Modifiye edilen kollajen çözeltilerinin istenen son hacmine bağlı olarak, başlangıç ​​malzemesinin miktarını Scale. Yaklaşık çözünebilir doğal kolajen 200 mg, 3 mg / ml metile edilmiş 25-30 ml ve süksinillenmiş kolajen çözeltilerinin 25-30 ml her biri tercih. </li></ol> 2. Kolajen Metilasyon <ol><li> Buz soğukluğunda steril su ile mi, 0.5 mg / lik bir konsantrasyon yerli asitlendirildi (pH 2-3), kolajen çözeltisi, 100 mg seyreltilir ve jelleşmesini önlemek için buz üzerinde çözüm tutmak. </li><li> 1 N NaOH ile birkaç damla 9-10 kolajen çözeltisinin pH değeri ayarlamak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. Bulanık olma çözüm neden kollajen çökelti gözlemleyin. </li&gt; <li> 25 dakika boyunca 3000 x g&#39;de çöktürülmüş kollajen çözüm aşağı doğru döndürün. Berrak bir jel-benzeri çökelti tüplerin alt görünür olmalıdır. Aspire ve düzgün süpernatant sıvı atmayın. </li><li> 0.1 N HCI ile metanol içinde 200 ml çökelmiş kollajen yeniden süspanse edin ve metilasyon reaksiyonu 4 gün boyunca oda sıcaklığında karıştırma ile oluştuğu sağlar. Kollajen erimesi olmaz, ama çözüm bulutlu hale getirecek çok küçük görünür parçalar halinde parçalayın gerekir. </li><li> Metilasyon sonra santrifüj 25 dakika boyunca 3000 x g&#39;de çözüm metıle kollajen pelet. Aspire ve asitli metanol süpernatant atın. </li><li> Tekrar pipetleme ile yaklaşık 3 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyona vererek, steril PBS 25 ml metile edilmiş kolajen çözündürülür ve bir 60 um&#39;lik bir hücre süzgecinden çözelti filtre edin. 1 N NaOH ile 20 ul artışlarını kullanarak 7.3-7.4 çözeltinin pH ayarlayın. </li><li> Concentratio değerlendirinticari bir sıçan kolajen ELISA kiti ya da hidroksiprolin tahlil kiti kullanılarak çözümün n. 3 mg / steril PBS ile ml çözeltisi ile seyreltilir. </li><li> Dikkatli bir şekilde şişenin altındaki kloroform 3 ml katman, bir vidalı başlık ile cam bir şişe aktararak metillenmiş kolajen çözeltisi sterilize, şişe, 4 ° C, O / N ayarlayın ve daha sonra aseptik olarak kaldırıp saklamak için izin metıle kollajen olan üst kat. </li><li> 1 ay içinde kullanım için 4 ° C&#39;da, çözelti saklayın. </li></ol> 3. Kolajen Succinylation <ol><li> Buz soğukluğunda steril su ile mi, 0.5 mg / lik bir konsantrasyon yerli asitlendirildi (pH 2-3), kolajen çözeltisi, diğer 100 mg seyreltilir ve jelleşmesini önlemek için buz üzerinde çözüm tutmak. </li><li> 1 N NaOH ile birkaç damla 9-10 kolajen çözeltisinin pH değeri ayarlamak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. Kollajen bulanık olma çözüm neden çöktürmek gerekir. </li><li> Suc 40 mg çözülür(kolajen çözeltisinin hacmi inci 20/01) 10 ml aseton içinde cinic anhidrid (kolajen mg&#39;ı başına 0.4 mg) eklenir. Yavaş yavaş (yaklaşık 0.5 mi artışlarla) sürekli pH değerine karıştırılarak kolajen çözeltisi bu karışıma ekleyin. PH 9.0 yaklaşırken 1 N NaOH, 1 veya 2 damla eklenerek pH 9.0&#39;ın üzerinde muhafaza edin. </li><li> Aseton içinde süksinik anhidrit katan 120 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin. Süksinillenmiş kollajen erir olarak açık hale çözüm gözlemleyin. Periyodik olarak 9.0 üstünde kalmasını sağlamak için pH değeri kontrol edin. </li><li> 1 N HCI 20 ul artışlarla 4.0 çözeltinin pH ayarlayın. Süksinillenmiş kollajen çökeltiler gibi yine bulutlu çözüm gözlemleyin. </li><li> Succinylation sonra santrifüj 25 dakika boyunca 3000 x g&#39;de çözüm süksinillenmiş kollajen pelet. Aspire ve reaksiyona girmemiş süksinik anhidrit ile asidifiye süpernatant atın. </li><li> Succinylated kolajen çözülürsteril PBS, 25 ml, 60 mikron hücre süzgecinden çözeltisi tekrar pipetle ml / yaklaşık 3 mg&#39;lık bir konsantrasyonunu vermek ve filtre bölgesi. 1 N NaOH ile 20 ul artışlarını kullanarak 7.3-7.4 çözeltinin pH ayarlayın. </li><li> Ticari bir kollajen sıçan ELISA kiti ya da hidroksiprolin tahlil kiti kullanılarak çözeltinin konsantrasyonunu değerlendirin. 3 mg / steril PBS ile ml çözeltisi ile seyreltilir. </li><li> Dikkatli bir şekilde şişenin altındaki kloroform 3 ml katman, bir vidalı başlık ile cam bir şişe aktararak süksinillenmiş kolajen çözeltisi sterilize, şişe, 4 ° C, O / N ayarlayın ve daha sonra aseptik olarak kaldırıp saklamak için izin süksinillenmiş kollajen olan üst kat. </li><li> 1 ay içinde kullanım için 4 ° C&#39;da, çözelti saklayın. </li></ol> Kollajen Değişiklikler 4. Doğrulama <ol><li> Doğal olarak metile edilmiş ve süksinillenmiş kollajen çözeltilerin her birinden 1 mi örnekleri hazırlayın ve konsantre seyreltinHidrojen iyonu titrasyon için steril saf su ile 0,1 mg / ml arasında entration. Bundan başka, en azından 4 saat için her 10 kDa kesme membraneusing 3 çözeltisi değişiklikler ile suya karşı diyaliz ile tampon, en az 1000 kat seyreltilir. </li><li> NaOH ve HCl az miktarda 7.3 çözeltilerin pH ayarlayın. Doğal olarak metile edilmiş ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri için titrasyon eğrilerini oluşturmak için Tanford 16 tarafından tarif edildiği gibi rasgele bir referans olarak pH 7.3 kullanarak, örneğin her biri hidrojen iyon titrasyonu yapın. </li><li> Asit hacminin ilişkili H +, molekül başına elektron sayısına karşı eklenirler pH değişimine çizilir. Yüksek pH &quot;Amino&quot; sınıfı, nötr noktasına doğru süksinillenmiş kolajen bir kayma (amin gruplarının kaybı) göstermelidir ve düşük pH &quot;karboksil&quot; sınıfı için metile kollajen sola doğru bir kayma (karboksil gruplarının kaybı göstermelidir ) ve süksinillenmiş kollajen bir sağa kayışı (karboksil grubunda bir kazançs), doğal kolajen ile karşılaştırıldığında. </li><li> Standart protokoller 17,18 takiben, 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit (TNBA) kolorimetrik yöntem kullanılarak succinylation ile ikame nativ kollajen amino gruplarının% belirleyerek succinylation reaksiyonunun etkinliğini değerlendirmek. </li></ol> Mikroakışkan Cihazlar ve Hücre Yayımlamak 5. Fabrikasyon <ol><li> Standart yöntemler kullanılarak 9 mikroakışkan cihazları imal. 100 mikron boyunda 0,4-1,5 mm genişliğinde ve hücre büyümesi için uzun kanallar 1-10 mm mikroakışkan hücre kültürü oda oluşturmak için fotolitografi kullanarak tanımlanan silikon üzerinde SU-8 ustaları PDMS çoğaltma kalıp kullanın. </li><li> Cihaz ve bir bardak slayt yüzeyini okside plazma temizleyici kullanın ve sonra bağ birlikte basın. En az 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılarak sterilize aygıtı sonra steril PBS içinde 50 ug / ml fibronektin bölmeyi doldurup, 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li&gt; <li> Fenotipinde veya farklılaşma hali stabilizasyonu için kolajen jel gerektiren primer sıçan ya da insan hepatositleri gibi hücreler, cihazı Tohum. Bu cihaz başına 14 x 10 6 hücre / ml&#39;de tohumlanmıştır taze izole edilmiş fare primer hepatositlerinde 7,19 ya da ticari olarak temin edilebilir dondurulan primer insan hepatositleri 20 ul kullanımı. </li><li> Hücreler 4-6 saat takmak ve ardından serbest hücrelerin yıkayın ve büyüme ortamı ile kaplama medya yerine izin verin. Yayılma, tam hücre sağlamak ve hücrelerin konfluent tek tabaka oluşturmak için O / N inkübe edin. </li></ol> 6. katman-katman, bir kollajen depolanmasının <ol><li> Laminer akış, doku kültürü kaputu, cihaz başına her çözeltinin 10 uygulamalar için metil ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri, yeterli miktarda, yanı sıra ortam birkaç ml hazırlar. Buz üzerinde çözüm tutun. Biz cihaz başına katmanın başına kollajen 20 ul (10-15 kat, toplam cihaz hacmi) kullanın. </li><li> Olmakmetilatlanmış (Polikatyonik) çözümü ile çırçır, daha sonra 20 metillenmiş bir ul ve sahip cihazlar yıkama alternatif her uygulama arasında 1 dakika bekledikten kolajen çözümleri succinylated. Aygıtı yaklaşık 20 dakika sürer solüsyon başına 10 kez, toplam yıkayın. Hücreler medya olmadan süreyi en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın. </li><li> Yavaş yavaş büyüklüğüne bağlı olarak giriş / çıkışında biriken kollajen gözlemleyin. Sıvı Akış arttıkça direnci, medya ile bir veya iki kez aygıtı yıkayın ve sonra katmanlarını devam edin. </li><li> Tüm katmanları uygulandıktan sonra, taze medya ile iki kez cihazı durulayın ve inkübatör dönmek. Hücre tipine bağlı olarak, hepatositler geliştirilmiş polarizasyon gibi hücre dışı matris ile indüklenen morfolojik değişiklikler, bir kaç saat içinde görünür olmalıdır. </li><li> Kollajen matrisin mevcudiyetini doğrulamak için standart yöntemler kullanılarak 9 transmisyon elektron mikroskopisi için temsili cihazlar hazırlayınkültürlenmiş hücrelerin üzerine montajı. </li></ol> Hücre Fenotip ve Fonksiyon 7. Stabilizasyon <ol><li> Resim hücre tipi için standart yöntemler kullanılarak hücre morfolojisi, canlılık ve polaritesi. Hepatositlerde için, kollajen birikimi etkilerini göstermek için apikal polarizasyon faz mikroskobu, canlılığı için LIVE / DEAD boyama ve CMFDA boya kullanılarak 14 gün boyunca görüntüleri toplamak. </li><li> Hücre morfolojisi için, durulama, 20 ul PBS ve görüntüyü faz kontrast mikroskopisi kullanılarak cihazı enjekte PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca cihazı yıkayın. </li><li> Ölü / canlı boyama için, durulama, üretici talimatlarına göre hazırlanır DAPI ile ölü / canlı boyama çözeltisi 20 ul enjekte etmek için PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca aygıtı temizleme, 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir, durulama Cihaz tekrar 20 PBS ul ve görüntünün floresan mikroskobu kullanarak cihazı ile. </li><li> Safra Canaliculi boyama, imalatçının talimatları izlenerek, 37 ° C de 30 dakika inkübe hazırlanan DAPI ile 2 uM CMFDA boyama çözeltisi 20 ul enjekte etmek için durulama PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca aygıtı temizleme ile tekrar cihazı yıkayın 20 ul PBS ve görüntü floresan mikroskobu kullanarak cihazı. </li><li> Harcanan ortam toplamak ve hücre fonksiyonunu belirlemek için, kültür süresi boyunca uygun zaman noktalarında hücresel metabolik ürünlerini ölçmek. Hepatositler için, harcanan ortam içinde albumin ve üre miktarını ölçer. </li><li> Böyle değerlendirmek enzim aktivite düzeyleri, antikor boyama ya da RNA analiz gibi hücreler kendilerini, üzerinde son nokta fonksiyonel analizler gerçekleştirin. Hepatositlerde için, neden ve sitokrom P450 enzim faaliyetleri veya faz II konjugasyon enzim glutatyon S-transferaz ölçün. </li></ol>

<ol>
	<li>Pedersen, J. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+in+the+third+dimension.">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li><li>Glowacki, J., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+scaffolds+for+tissue+engineering.">Collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).</li><li>Vescio, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-like+drug+responses+of+human+tumors+growing+in+three-dimensional+gel-supported+primary+culture.">In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture.</a> PNAS. 84, 5029-5033 (1987).</li><li>Chandrasekaran, S., Guo, N. -. h., Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-adhesive+and+chemotactic+activities+of+thrombospondin-1+for+breast+carcinoma+cells+are+mediated+by+&#945;3&#946;1+integrin+and+regulated+by+insulin-like+growth+factor-1+and+CD98.">Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by &#945;3&#946;1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98.</a> J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).</li><li>Chen, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+differentiation+of+rhesus+monkey+embryonic+stem+cells+in+three&#8208;dimensional+culture+systems.">Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three&#8208;dimensional culture systems.</a> Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).</li><li>Whelan, M. C., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+I+initiates+endothelial+cell+morphogenesis+by+inducing+actin+polymerization+through+suppression+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+A.">Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A.</a> J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).</li><li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vitro+function+of+adult+hepatocytes+in+a+collagen+sandwich+configuration.">Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration.</a> Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).</li><li>Decher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuzzy+Nanoassemblies:+Toward+Layered+Polymeric+Multicomposites.">Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites.</a> Science. 277, 1232-1237 (1997).</li><li>McCarty, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ultrathin+collagen+nanolayer+assembly+for+3-D+microtissue+engineering:+Layer-by-layer+collagen+deposition+for+long-term+stable+microfluidic+hepatocyte+culture.">A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture.</a> TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).</li><li>Swierczewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+nanoscale+elastin-like+polypeptide+polyelectrolyte+multilayers.">Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers.</a> Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).</li><li>Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+in+vitro+liver+sinusoid+mimics+using+chitosan-hyaluronic+acid+polyelectrolyte+multilayers.">The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers.</a> Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).</li><li>Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+Multicellular+Organotypic+3D+Liver+Model+with+a+Detachable,+Nanoscale+Polymeric+Space+of+Disse.">Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse.</a> Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).</li><li>Kidambi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Co&#8208;Culture+of+Primary+Hepatocytes+and+Fibroblasts+Using+Polyelectrolyte+Multilayer+Templates.">Patterned Co&#8208;Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates.</a> Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).</li><li>Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+elastin-like+polypeptide-polyelectrolyte+complexes+to+control+hepatocyte+morphology+and+function+in+vitro.">The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro.</a> Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).</li><li>Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chromatographic+Separation+and+Amino+Acid+Composition+of+the+Subunits+of+Several+Collagens*.">The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*.</a> Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).</li><li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interpretation+of+hydrogen+ion+titration+curves+of+proteins.">The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins.</a> Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).</li><li>Cayot, P., Tainturier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantification+of+protein+amino+groups+by+the+trinitrobenzenesulfonic+acid+method:+a+reexamination.">The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination.</a> Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).</li><li>Kakade, M. L., Liener, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+available+lysine+in+proteins.">Determination of available lysine in proteins.</a> Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ultra ince saf kolajen düzenekleri değiştirilmiş kolajenlerin katman-katman birikimi ile şarj hücreleri veya malzeme yüzeylerinde yatırılabilir. Bu çalışmanın sonuçları, metilasyon ve yerli kolajen succinylation hücreleri (Şekil 2) ile ilgili ultra ince kollajen matris, derlemeleri yatırmak için katman-katman tekniği kullanılabilir (Şekil 1) ve diğer yüklü polikatyonik ve polianyonik kolajen çözümleri oluşturmak göstermektedir Malzeme yüzeyler. Böyle ultra ince matris tabakaları hepatositler (Şekil 3), kendi işlevi yanı sıra, mikroakışkan cihazlarda tohumlama sonra (Şekil 4) olarak hücrelerin morfolojisi, canlılığı ve kutuplaşma stabilize olabilir. Ultra ince tabakaların kollajen başarılı birikimi için, metil ve süksinillenmiş kolajenleri oluşturma modifikasyon reaksiyonları kritiktir. Karboksil grubu metilasyon reaksiyonu, uygun olmadığıKollajen metilasyon reaksiyonu LeChâtelier ilkesine dayanmaktadır ileri reaksiyonu tahrik etmek için asitleştirilmiş metanol içinde gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle, reaksiyon verimi artırmak için asidifiye metanol içinde çökelen kolajen erimeden önce pH çökeltme sonrası kollajen tüm fazla suyu çıkarmak çok önemlidir. Succinylation reaksiyonu için aseton içinde süksinik anhidrit eklenirken, 9 üzerinde, solüsyonun pH değerinin muhafaza önemlidir. PH ve sukkinik anhidrid aseton çözeltisinin yavaş yavaş ilave sürekli izlenmesi etkili bir reaksiyon sağlayan da yardımcı olabilir. Katman-katman birikimi sırasında, hücreler medya olmadan gitmek zamanı en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. 10 bilayers prosedürü sürece çoğu hücrelerin inkübatör dışına medya olmadan olması gerektiği gibi yaklaşık yaklaşık 20 dakika alır. Birden fazla 10 bilayers tevdi edilmesi gerekiyorsa, Colla arasında 3-4 saat için bir kuluçka makinesi içinde medya hücreleri dinlenmegen depolanmaları hücrelerin sağlığını sağlamak. Diğer uçta, çok az katmanları, hücre morfolojisi sağlanmasında etkili olmayacaktır. 10 katmanları yaptı ise bizim testlerde, 3 kat, hücre morfolojisi korumak vermedi. Birçok değişiklikler sorunlarını gidermek için prosedürlere yapılabilir. Sorunlarının ortaya çıkması durumunda zaman ve metilasyon reaksiyonu sıcaklığı değişebilir. Örneğin, 4 ° C&#39;ye kadar, reaksiyon sıcaklığı azaltmak ve verimliliğini artırabilir 7 gün süresi uzar. Ayrıca, pH ekstraksiyonu sırasında polimerizasyon derecesine bağlı olarak, kolajen, bazen tam olarak metilasyon reaksiyonu esnasında asidifiye metanol içinde çözülür. Bu durumda, reaksiyon, bir sonraki adım sırasında topak böylece kollajen çökeltmek için tamamlandıktan sonra 9-10 pH değerine getirmek için 10 M NaOH ilave edin. Mikroakışkan cihazlarda katman-katman birikimi uygularken, küçük kanallar veya limanlar cl olabilirCihaz akışkan direncinde bir artış ile gösterilen kollagenle ogged. Taze medya aygıtı Flushing birikme devam etmek için izin, herhangi tıkanıklıkları ortadan kaldırmak gerekir. Burada açıklandığı gibi katman-katman kollajen manuel birikim mikroakışkan cihazların ölçekleme ve otomasyon açısından bir kısıtlama budur. Bununla birlikte, bu teknik, bir teknik otomatik ve bir seferde cihaz diziler hazırlamak için kullanılabilir valf ve pompa içeren standart mikroakışkan donanım ile uyumludur. Plâka kültürünün kullanım için bu tekniğin bir diğer sınırlaması, doğal kolajen nispeten büyük miktarda gerektirmesidir. Mikroakışkan uygulama için, metil ve süksinillenmiş kolajenlerin hacimleri birçok cihazlarda ultra-ince kollajen katmanları oluşturmak için de kullanılabilir. Standart doku plakası kültürü ile, diğer taraftan, kaplama çukurlara gerekli hacimleri de artan ebadı ile daha fazla açısından dezavantajlıdır. Bu katmanlı-ultra ince kollajen matris tabakalarının biriktirilmesi için by-katman tekniği diğer bir alternatif ya da fonksiyonel modifikasyonları kullanılarak, hem de İnce matris düzenekleri tarafından ayrılan hücrelerin çoklu katmanlar oluşturarak geliştirilebilir. Metilasyon ve succinylation nispeten basit bir amino asit yan zinciri modifikasyon reaksiyonları burada kullanılmasına rağmen, alternatif ya da ek reaksiyonlar yerine fonksiyonalize kolajenleri oluşturmak için kullanılabilir. Işlevselleştirilmiş yan zincirler de toplam net pozitif ve negatif yüklerle birlikte proteinleri verir, ancak bu işlevselleştirme çeşitli uygulamalar için de faydalı olabilir.

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult. 
One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.1 Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.2 Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells3,45, microvascular endothelial cells6, and hepatocytes7, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.
To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique8 with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.9
Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes10 to cover hepatocytes in plate culture11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

<table><tbody><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>R%D Systems</td><td>3440-100-01</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>succinic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>succinylation reagent</td></tr><tr><td>anhydrous methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>methylation reagent</td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>pH precipitation reagent</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>pH precipitation reagent</td></tr><tr><td>rat collagen type I ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>option for detecting collagen content</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>option for detecting collagen content</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>option for detecting collagen content</td></tr></tbody></table>

layer-by-layer collagen deposition in microfluidic devices for microtissue stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Yerli kollajen tabakası-katman birikimi kullanmak için polikatyonik ve polianyonik kollajen çözümleri oluşturmak için metilasyon ve succinylation kullanılarak değiştirilebilir. Succinylation sukkinil grupları ile nativ kollajen ε-amino grupları değiştirir ve metilasyon, bir metil grubu (Şekil 1A) ile saf kollajenine karboksil gruplarını değiştirir. Kollajen proteini amino asit yan zincirlerine Bu modifikasyonlar çözeltiler pH titrasyon eğrilerini değiştirebilir. Metilasyon, amino grupları üzerinde hiçbir etkisi yoktur ve karboksil gruplarının sayısını azaltır Succinylation doğal kolajen (Şekil 1B) ile karşılaştırıldığında, amino gruplarının sayısını azaltır ve karboksil gruplarının sayısı artar. Bu modifikasyonlar, kollajen moleküllerinin yük özelliklerini değiştirebilir. Succinylation pozitif yüklü gruplarını çıkarır ve negatif yüklü gruplar ile değiştirir, ve metilasyon negatif yüklü gruplarını çıkarır (Şekil 1C &lt;/ strong&gt;). Metil ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri (COL Lbl) katmanı-katman depozisyon gibi hücreleri (Şekil 2A) gibi yüklü yüzeylerin üzerine bir ultra-ince kolajen matris düzeneğini oluşturur. Mikroakışkan bir cihaz (Şekil 2B) olan fibronektin kaplı cam üzerine ekildi birincil hepatositler, böyle bir saf kolajen matris takımının (Şekil 2C) ile kaplanabilir. Hücreler üzerindeki 10 iki katmanlı birikimi, yaklaşık 140 nm&#39;de (Şekil 2B) &#39;in bir kollajen tabaka kalınlığını oluşturur. COL LBL tekniği kullanılarak yatırılan ultra ince kollajen montaj tabakası mikroakışkan cihazlarda 14 gün boyunca birincil hepatositlerde dengeler. Bir üst matris kapaksız Hepatositler kendi farklılaşmış fenotip, sözleşme kaybeder ve zaman (Şek. 3A-C) üzerinde mikroakışkan cihazların yüzeyini kaldırın. Bunun aksine, hepatositler bir ultra-ince kolajen düzenindeki maintai kaplı14 gün (Şekil 3D-F) üzerinden n kendi farklılaşmış morfolojisi ve polarizasyon. Hücrelerin yaşama kabiliyeti% 90&#39;dan daha büyük (Şekil 3G-I) muhafaza edilmiştir. Buna ek olarak, COL lbl ile tedavi hepatositlerin polarizasyon apikal safra kanalikül ağı (Şekil 3J-L) gelişimini gösteren, zamanla arttı. Hücre canlılığı, morfoloji ve polarizasyon ek olarak, COL Lbl tekniği kurtarır ve levhalar hücreleri için standart tekniklere benzer seviyelerde primer hepatositlerinde işlevini stabilize eder. Hepatositler tarafından albümin salgılama hemen sonra kaplama düşüktür, ve hücreler, bir matris muhafazaya polarize sağlanmadıkça düşüktür. COL LBL tedavisi (Şekil 4A) stabilize önce 8-10 gün içinde hepatositler artışlar albümin salgılanması sonra. Üre üretimi hücre tohumlama hemen sonra yüksek olduğu ve n, hücrelerde zaman içinde azalırbir matris ile kaplanmış ot, üre üretim COL lbl (Şekil 4B) ile kararlı hale getirilmiş hepatositlerde 8-10 gün sonra dengeler. Sitokrom P450 (CYP) stimuliye yanıt olarak enzim sentezleme hepatositlerin bir uzman fonksiyonudur. 3-metilkolantren yanıt olarak hepatositlerde CYP1A1 indüksiyonu geri kazanılmış ve COL Lbl tedavisi (Şekil 4C) ile 14 güne kadar stabilize edildi. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig1.jpg" /> Şekil 1. Sıçan kuyruğu kollajen çözümleri kimyasal olumlu net oluşturmak için modifiye edilmiş veya net negatif polimer çözümler ücret. (A), sırasıyla, karboksil ve ε-amino gruplarını, succinylation ve metilasyon reaksiyonu şematik gösterimleri. Col sonra çözelti, pH değerini değiştiren için gerekli H + iyonları göreli sayıda değişimleri gösteren (B) Hidrojen titrasyon eğrisi türevlerilagen değişiklik. (C) net ücretleri yerli kollajen normalize olarak H + vardiya hesaplanan modifiye kollajen çözümleri (B) (ortalama ± SD). MC: kollajeni metillenmiş. SC: succinylated kollajen. AA: amino asit kalıntıları. Yeniden baskı 9 izni ile. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53078/53078fig2.jpg" /> Modifiye edilen kollajen çözümleri Şekil 2. katman-katman bırakma hepatositlerin üstünde bir ultra-ince kollajen matris düzeneği hazırlandı. (A) microdevice üzerinde fibronektin numaralı seribaşı ve metil ve süksinillenmiş kollajen çözümleri alternatif ile kuluçkaya hepatositlerin şematik gösterimi. Temsilcinin TEM kesitleri (grup başına incelenen 20 hücre) conkontrolü (B) ve COL kültür 2 günden sonra (C) hepatositleri Lbl işlemden geçirildi. Oklar: LBL kollajen tabakası. Ölçek çubuğu:. TEM görüntüleri (n = 4 cihazlardan 20 hücrelerinden) ölçülen hücre başına 2 mikron (D) COL LBL tabakası kalınlığı (ortalama ± SD). 9&#39;dan Modifiye. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53078/53078fig3.jpg" /> Şekil 3. COL LBL tekniği Hepatositler hiçbir üst mikrocihazlardaki katmanın (negatif kontrol) sözleşme. Kültürde 14 gün boyunca mikrocihazlardaki hepatosit morfolojisi, canlılığı ve kutuplaşmayı muhafaza ve yüzey zamanla (A-C) kaldırın. Değiştirilmiş kolajenlerin Lbl biriktirme hepatosit morfolojisi (D-F) viab korurility 14 gün boyunca mikrocihazlarda (G-I). CMFDA polarize olmayan hepatositler (J) sitoplazması içinde kalan bir jenerik hücresi belirleyicisidir. Zamanla, safra kanalikül geliştirme zamanı (L) üzerinden hücrelerin etrafında geliştirmek kanaliküler alanlarda (K) floroforun atılımı tarafından görülebilir. Görüntü ölçek çubuğu: 100 mikron. Ankastre ölçek çubuğu: 50 mikron. 9&#39;dan Modifiye. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig4.jpg" /> Şekil 4. COL Lbl mikroakışkan cihazlar 14 gün boyunca, hepatosit albümini ve üre bölümleri ve CYP aktivitesi stabilize eder. COL lbl hepatositlerde (A) Albümin salınımı düşük başladı ve zamanla artmıştır u, COL LBL hepatositler tarafından gün 10 (B) Üre salgılanmasının bir plato ulaşan ntil günde 2 düşük oldu 10. (C) Gün de CYP1A aktivitesinin uyarılmasını bir plato ulaşıncaya kadar zamanla azalmış, ancak önemli ölçüde 7. günde artmış Gün 14. Ortalama ± SEM aracılığıyla muhafaza edilmiştir seviyesi; COL LBL: hepatositler LBL kollajen birikimi sonra kültürlü; NoTop: hayır üst matris tabakası ile kültürlü hepatositler; n = 6-8 cihazlar. 9&#39;dan Modifiye. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization at JoVE.com

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

layer-layer-collagen-deposition-microfluidic-devices-for-microtissue

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Video: Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Biyomühendislik

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Uzun Menzilli Fiber Hizalamalı Mikromühendislik 3D Kollajen Hidrojelleri

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...