Name: layer-by-layer collagen deposition in microfluidic devices for microtissue stabilization
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization at JoVE.com

This work was supported by grants from the National Institutes of Health, including a microphysiological systems consortium grant from the National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), a Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Postdoctoral Fellowship (F32DK098905 for WJM) and pathway to independence award (DK095984 for AB) from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1. Preparazione della soluzione nativa Solubile Collagene <ol><li> Preparare o acquistare 200 mg di acidificato, solubile, collagene di tipo I da code di ratto a 1-3 mg / ml utilizzando i protocolli di isolamento standard, come riportato da Piez et al. 15 </li><li> Scalare la quantità di materiale di partenza in base al volume finale desiderato soluzioni collagene modificati. Circa fare 25-30 ml di metilato e 25-30 ml di soluzione di collagene succinilate, ciascuno a 3 mg / ml, da 200 mg di collagene nativo solubile. </li></ol> 2. Collagene metilazione <ol><li> Diluire 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione. </li><li> Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Osservare il precipitato collagene, causando la soluzione per diventare torbida. </li&gt; <li> Spin giù la soluzione di collagene precipitato a 3.000 g per 25 min. Un chiaro, precipitato gelatinoso dovrebbe essere visibile nel fondo delle provette. Aspirare e smaltire il liquido surnatante. </li><li> Risospendere il precipitato collagene in 200 ml di metanolo con HCl 0,1 N e lasciare che la reazione di metilazione di verifica con agitazione a temperatura ambiente per 4 giorni. Il collagene non si dissolvono, ma dovrebbe rompersi in pezzi molto piccoli visibili che renderanno la soluzione torbida. </li><li> Dopo la metilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene denaturato. Aspirare e smaltire il surnatante metanolo acidificato. </li><li> Sciogliere il collagene metilata in 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH. </li><li> Valutare la concentration della soluzione con un commerciale collagene topo kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile. </li><li> Sterilizzare la soluzione di collagene denaturato trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene denaturato. </li><li> Conservare la soluzione a 4 ° C per l&#39;uso entro 1 mese. </li></ol> 3. Il collagene succinilazione <ol><li> Diluire l&#39;altra 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione. </li><li> Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Il collagene non precipitare, provocando la soluzione per diventare torbida. </li><li> Sciogliere 40 mg di succinico anidride (0,4 mg per mg di collagene) in 10 ml di acetone (1/20 il volume della soluzione di collagene). Lentamente (in circa 0,5 ml incrementi) aggiungere il composto alla soluzione di collagene sotto agitazione mentre continuo monitoraggio del pH. Mantenere il pH superiori a 9,0 aggiungendo 1 o 2 gocce di NaOH 1 N come il pH si avvicina 9,0. </li><li> Continua agitazione a temperatura ambiente per 120 minuti dopo l&#39;aggiunta di tutti i anidride succinica in acetone. Osservare la soluzione a diventare chiaro come il collagene succinilata dissolve. Controllare periodicamente il pH per garantire che rimanga sopra 9,0. </li><li> Regolare il pH della soluzione a 4,0 con 20 microlitri di 1 incrementi N HCl. Osservare la soluzione torbida di nuovo, come il collagene succinilata precipita. </li><li> Dopo la succinilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene succinilata. Aspirare e smaltire il surnatante acidificato con reagito anidride succinica. </li><li> Sciogliere il collagene succinilatain 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH. </li><li> Valutare la concentrazione della soluzione con un commerciale topo collagene kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile. </li><li> Sterilizzare la soluzione di collagene succinilata trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene succinilata. </li><li> Conservare la soluzione a 4 ° C per l&#39;uso entro 1 mese. </li></ol> 4. Verifica del collagene Modifiche <ol><li> Preparare 1 ml campioni da ciascuna delle soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilate e diluire ad una concentration di 0,1 mg / ml con acqua pura sterile per ioni idrogeno titolazione. Diluire ulteriormente il buffer almeno 1.000 volte con la dialisi contro acqua attraverso un taglio di 10 kDa membraneusing 3 soluzione cambia per almeno 4 ore ciascuna. </li><li> Aggiustare il pH delle soluzioni a 7.3 con piccole quantità di NaOH e HCl. Utilizzando pH 7,3 come riferimento arbitraria, eseguire ione idrogeno titolazione su ciascuno dei campioni come descritto da Tanford 16 per creare curve di titolazione per le soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilata. </li><li> Tracciare la variazione di pH per volume di acido aggiunto rispetto al numero di ioni per molecola H + bound. La gamma &quot;amino&quot; alto pH dovrebbe mostrare un cambiamento nel collagene succinilata verso il punto neutro (perdita di gruppi amminici), e il basso pH range &quot;carbossile&quot; dovrebbe mostrare uno spostamento verso sinistra del collagene denaturato (perdita di gruppi carbossilici ) e uno spostamento verso destra della collagene succinilata (un guadagno in gruppo carbossilicos), rispetto al collagene nativo. </li><li> Valutare l&#39;efficacia della reazione succinilazione determinando la% di gruppi amminici in collagene nativo sostituito da succinilazione utilizzando acido 2,4,6-trinitrobenzensulfonico (TNBA) metodo colorimetrico, seguendo protocolli standard 17,18. </li></ol> 5. Realizzazione di dispositivi Microfluidic e il seeding cellulare <ol><li> Realizzare dispositivi microfluidici utilizzando metodi standard di 9. Utilizzare replica stampaggio di PDMS da SU-8 master sul silicio definita utilizzando fotolitografia per creare microfluidica camere di coltura cellulare con 100 micron di altezza, 0,4-1,5 mm e 1-10 mm di lunghezza canali per la crescita delle cellule. </li><li> Utilizzare un detergente plasma per ossidare le superfici del dispositivo e un vetrino, quindi premere insieme al legame. Dopo la sterilizzazione del dispositivo per esposizione a luce UV per almeno 30 minuti, riempire la camera con 50 ug / ml di fibronectina in PBS sterile e incubare a 37 ° C per 45 min. </li&gt; <li> Inizializzare il dispositivo con le cellule, come ratto primaria o epatociti umani, che richiedono un gel di collagene per la stabilizzazione del fenotipo o stato di differenziazione. Usiamo 20 l di appena isolate di ratto primario epatociti 7,19 o disponibili in commercio crioconservati epatociti umani primari seminati a 14 × 10 6 cellule / ml al dispositivo. </li><li> Permettono alle cellule di allegare per 4-6 ore, e poi lavare le cellule non attaccati e sostituiscono i terreni in piastra con i media di crescita. Incubare O / N a garantire cella piena diffusione e creare un monostrato confluente di cellule. </li></ol> 6. strato per strato deposizione di collagene <ol><li> In una cappa coltura tissutale flusso laminare, preparare volumi sufficienti di soluzioni collagene denaturato e succinilate per 10 applicazioni di ciascuna soluzione per dispositivo, nonché alcuni ml di media. Mantenere le soluzioni su ghiaccio. Usiamo 20 l (10-15 volte il volume totale del dispositivo) di collagene per strato per dispositivo. </li><li> Esseresgranatura con la soluzione di metilato (policationico), si alternano gli scarichi dei dispositivi con 20 ml di metilato e poi succinilata soluzioni di collagene, in attesa 1 minuto tra ogni applicazione. Lavare il dispositivo per un totale di 10 volte al di soluzione, che dovrebbe durare circa 20 minuti. Lavorare velocemente per minimizzare la quantità di tempo le cellule sono prive di mezzi. </li><li> Osservare collagene lentamente accumularsi in ingresso / uscita in funzione della sua dimensione. Se la resistenza al flusso fluido aumenta, a filo il dispositivo una o due volte con i media, e poi continuare stratificazione. </li><li> Dopo aver applicato tutti gli strati, sciacquare il dispositivo due volte con mezzi freschi e ritornare alla incubatore. A seconda del tipo di cellula, i cambiamenti morfologici extracellulare dalla matrice, ad esempio maggiore polarizzazione in epatociti, dovrebbero essere visibili entro poche ore. </li><li> Preparare dispositivi rappresentativi per microscopia elettronica a trasmissione utilizzando metodi standard 9 per verificare la presenza di una matrice di collagenemontaggio sulla parte superiore delle cellule in coltura. </li></ol> 7. Stabilizzazione del fenotipo delle cellule e funzione <ol><li> Immagine la morfologia cellulare, la vitalità, e la polarità utilizzando metodi standard per il tipo di cella. Per epatociti, raccogliere le immagini più di 14 giorni utilizzando la microscopia di fase, LIVE / colorazione MORTO per la vitalità, e CMFDA tintura per la polarizzazione apicale per dimostrare gli effetti della deposizione di collagene. </li><li> Per morfologia cellulare, lavare il dispositivo attraverso l&#39;ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di PBS, e l&#39;immagine del dispositivo tramite microscopio a contrasto di fase. </li><li> Per LIVE / colorazione MORTO, lavare il dispositivo attraverso l&#39;ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per lavare, iniettare 20 ml di soluzione colorante LIVE / MORTO con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il Dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l&#39;immagine del dispositivo tramite microscopia a fluorescenza. </li><li> Per bile canalicolorazione culi, lavare il dispositivo attraverso l&#39;ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di 2 soluzione colorante mM CMFDA con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l&#39;immagine del dispositivo usando la microscopia a fluorescenza. </li><li> Raccogliere i media spesi e misurare prodotti metabolici cellulari in appositi punti di tempo per tutta la durata della cultura per determinare la funzione delle cellule. Per epatociti, misurare la quantità di albumina e urea nei media spesi. </li><li> Effettuare analisi funzionali endpoint sulle cellule stesse, come la valutazione dei livelli degli enzimi di attività, colorazione degli anticorpi, o analisi di RNA. Per epatociti, indurre e misurare le attività enzimatici del citocromo P450 o di fase II coniugazione enzima glutatione S-transferasi. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ultrasottili assiemi collagene puro possono essere depositati su cellule caricate o superfici dei materiali utilizzando deposizione layer-by-layer di collageni modificati. I risultati di questo studio dimostrano che la metilazione e succinilazione di collagene nativo creare soluzioni collagene policationici e polianionici (Figura 1) che può essere utilizzato con la tecnica layer-by-layer depositare assiemi matrice di collagene ultrasottili sulle cellule (Figura 2) o altro addebitate superfici di materiali. Tali strati ultrasottili matrice possono stabilizzare la morfologia, la vitalità e la polarizzazione delle cellule, come epatociti (figura 3), dopo la semina in dispositivi microfluidici, così come la loro funzione (Figura 4). Per il successo di collagene deposizione di strati ultrasottili, le reazioni di modifica che creano il collagene denaturato e succinilati sono critici. Poiché la reazione di metilazione gruppo carbossilico non è favorevole, lacollagene reazione di metilazione deve essere eseguita in metanolo acidificato a provocare la reazione in avanti, sulla base di principio di Le Chatelier. Pertanto, è importante rimuovere tutta l&#39;acqua in eccesso dal collagene dopo la precipitazione pH prima sciogliendo il collagene precipitato in metanolo acidificato per aumentare l&#39;efficienza di reazione. Per la reazione succinilazione, mantenendo il pH della soluzione sopra 9 durante l&#39;aggiunta della anidride succinica in acetone è critica. Monitoraggio continuo del pH e lenta aggiunta della soluzione di anidride succinica acetone sono utili per assicurare una reazione efficace. Durante la deposizione layer-by-layer, è fondamentale ridurre al minimo il tempo che le cellule andare senza supporto. La procedura per 10 doppi strati dura circa 20 minuti, che è circa il più a lungo maggior parte delle cellule dovrebbero lasciare al di fuori dei media dell&#39;incubatrice. Se più di 10 doppi strati devono essere depositate, riposo le cellule in media in un incubatore per 3-4 ore tra colladeposizioni gen per garantire la salute delle cellule. All&#39;altro estremo, anche alcuni strati non saranno efficaci nel mantenere la morfologia cellulare. Nel nostro test, 3 strati non hanno mantenuto la morfologia cellulare, mentre 10 strati hanno fatto. Diverse possono essere apportate modifiche alle procedure per risolvere i problemi. Il tempo e la temperatura della reazione di metilazione possono essere variati in caso di problemi. Ad esempio, diminuendo la temperatura di reazione a 4 ° C e aumentando il tempo di 7 giorni può aumentare l&#39;efficienza. Inoltre, a seconda della misura della polimerizzazione durante l&#39;estrazione pH, il collagene talvolta dissolve completamente in metanolo acidificato durante la reazione di metilazione. In questo caso, aggiungere 10 M NaOH per portare il pH fino a 9-10 dopo che la reazione è completata per precipitare il collagene in modo che possa essere pellettizzato nella fase successiva. Durante l&#39;applicazione la deposizione strato per strato in dispositivi microfluidici, piccoli canali o porte possono diventare clogged con collagene, indicato da un aumento nel dispositivo fluidico resistenza. Lavaggio del dispositivo con mezzi freschi dovrebbe rimuovere eventuali blocchi, consentendo la deposizione per continuare. La deposizione manuale del collagene layer-by-layer come qui descritto è una limitazione in termini di scala e automazione di dispositivi microfluidici. Tuttavia, questa tecnica è compatibile con l&#39;hardware microfluidico standard, tra valvole e pompe che potrebbero essere utilizzati per automatizzare la tecnica e preparare array di dispositivi contemporaneamente. Un altro limite di questa tecnica per l&#39;uso in coltura in piastra è che richiede una quantità relativamente grande di collagene nativo. Per l&#39;applicazione microfluidica, i volumi di collagene denaturato e succinilate possono essere usati per creare strati di collagene ultrasottili in molti dispositivi. Con piastra di coltura tissutale di serie, invece, i volumi richiesti per pozzi cappotto diventare più proibitivi all&#39;aumentare dimensioni ben. Questo Layer-tecnica per strato per la deposizione di strati ultrasottili matrice collagene potrebbe essere ulteriormente sviluppata utilizzando modifiche alternative o funzionali, nonché creando più strati di cellule separate dalle assemblee matrice sottili. Sebbene le reazioni di modificazione catena laterale di aminoacidi relativamente semplici di metilazione e succinilazione stati usati qui, reazioni alternative o aggiuntive possono essere utilizzati invece per creare collageni funzionalizzati. Le catene laterali funzionalizzati devono comunque producono proteine ​​con cariche positive e negative complessive nette, ma tale funzionalizzazione può essere utile per una varietà di applicazioni.

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult. 
One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.1 Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.2 Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells3,45, microvascular endothelial cells6, and hepatocytes7, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.
To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique8 with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.9
Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes10 to cover hepatocytes in plate culture11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

<table><tbody><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>R%D Systems</td><td>3440-100-01</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>succinic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>succinylation reagent</td></tr><tr><td>anhydrous methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>methylation reagent</td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>pH precipitation reagent</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>pH precipitation reagent</td></tr><tr><td>rat collagen type I ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>option for detecting collagen content</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>option for detecting collagen content</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>option for detecting collagen content</td></tr></tbody></table>

layer-by-layer collagen deposition in microfluidic devices for microtissue stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Collagene nativo può essere modificato con metilazione e succinilazione per creare soluzioni di collagene policationici e polianionici per l&#39;uso in strato per strato di deposizione. Succinilazione modifica i gruppi ε-amino di collagene nativo con gruppi succinil e metilazione modifica i gruppi carbossilici di collagene nativo con un gruppo metilico (Figura 1A). Queste modifiche alle catene laterali di aminoacidi della proteina collagene alterano le curve di titolazione del pH per le soluzioni. Succinilazione riduce il numero di gruppi amminici e aumenta il numero di gruppi carbossilici, mentre metilazione ha alcun effetto sui gruppi amminici e riduce il numero di gruppi carbossilici, rispetto al collagene nativo (Figura 1B). Queste modifiche alterano le caratteristiche di carica delle molecole di collagene. Succinilazione rimuove i gruppi a carica positiva e li sostituisce con i gruppi a carica negativa, e la metilazione rimuove i gruppi carichi negativamente (Figura 1C &lt;/ strong&gt;). Deposizione layer-by-layer delle soluzioni collagene metilati e succinilate (COL LBL) crea un gruppo a matrice ultrasottile collagene su superfici cariche, come le cellule (Figura 2A). Epatociti primari seminate su vetro fibronectina rivestite all&#39;interno di un dispositivo microfluidico (Figura 2B) possono essere rivestiti con un tale gruppo a matrice puramente collagene (Figura 2C). Deposizione di 10 bistrati sulle cellule crea uno spessore dello strato di collagene di circa 140 nm (Figura 2D). Lo strato ultrasottile assemblea collagene depositato con la tecnica COL LBL stabilizza epatociti primari per oltre 14 giorni in dispositivi microfluidici. Gli epatociti senza copertura matrice superiore perdono la loro fenotipo differenziato, contratto, e sollevare la superficie di dispositivi microfluidici nel tempo (Fig. 3A-C). Al contrario, gli epatociti coperti con un ultrasottile collagene assemblaggio manutenzione sun loro morfologia differenziata e polarizzazione oltre 14 giorni (Figura 3D-F). La vitalità delle cellule è stata mantenuta a più del 90% (Figura 3G-I). Inoltre, la polarizzazione degli epatociti trattati con COL LBL aumentata nel tempo, mostrando sviluppo di una rete canalicolare apicale biliare (Figura 3J-L). Oltre alla vitalità cellulare, la morfologia e la polarizzazione, la tecnica COL LBL recupera e stabilizza la funzione di epatociti primari a livelli simili a tecniche standard per le celle a piastre. La secrezione di albumina da epatociti è basso immediatamente dopo la placcatura, e rimane basso a meno che le cellule sono indotte a polarizzare attraverso un rivestimento a matrice. Dopo il trattamento COL LBL, la secrezione di albumina dagli epatociti aumenta nel 8-10 giorni prima di stabilizzarsi (figura 4A). La produzione di urea è elevata immediatamente dopo la semina delle cellule e diminuisce nel tempo in cellule nOT coperto con una matrice, la produzione di urea stabilizza dopo 8-10 giorni in epatociti stabilizzati con COL LBL (Figura 4B). Citocromo P450 (CYP) espressione degli enzimi in risposta a stimoli è una funzione specializzata di epatociti. L&#39;induzione di CYP1A1 in epatociti in risposta a 3-metilcolantrene stato recuperato e stabilizzata fino a 14 giorni dal trattamento COL LBL (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig1.jpg" /> Figura 1. Rat soluzioni coda di collagene sono stati modificati chimicamente per creare positivamente rete o rete caricate negativamente soluzioni polimeriche. (A) le rappresentazioni schematiche delle reazioni di metilazione succinilazione e che modificano gruppi carbossilici e ε-amino, rispettivamente. (B) di idrogeno titolazione derivati ​​curve mostrano spostamenti relativi numeri di ioni H + necessari per alterare pH della soluzione dopo colmodifica lagen. (C) Gli oneri netti (media ± SD) delle soluzioni di collagene modificati calcolate dal H + si sposta a (B) normalizzati al collagene nativo. MC: metilato collagene. SC: collagene succinilata. AA: residui amminoacidici. Ristampa con il permesso di 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig2.jpg" /> Figura 2. deposizione strato per strato di soluzioni collagene modificati creato un gruppo a matrice di collagene ultrasottile sopra degli epatociti. (A) Rappresentazione schematica di epatociti seminate su fibronectina su microdispositivi e incubati con alternanza di soluzioni di collagene denaturato e succinilati. TEM sezioni di rappresentante (20 cellule esaminati per gruppo) della truffacontrollo (B) e COL LBL-trattati (C) epatociti dopo 2 giorni di coltura. Frecce: LBL strato di collagene. Scala bar:. 2 micron spessore (D) COL LBL (media ± DS) per cella misurata da immagini TEM (n = 20 celle da 4 dispositivi). Modificato da 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig3.jpg" /> Figura 3. La tecnica COL LBL mantenuto epatociti morfologia, la vitalità, e la polarizzazione in microdispositivi oltre 14 giorni nella cultura. Gli epatociti senza strato superiore in microdispositivi (controllo negativo) del contratto e sollevare la superficie nel tempo (A-C). LBL deposizione di collagene modificati mantiene epatociti morfologia (D-F) e viabilità (G-I) in microdispositivi superiori a 14 giorni. CMFDA è un marcatore generica cella che rimane nel citoplasma degli epatociti non polarizzato (J). Nel corso del tempo, lo sviluppo di canalicoli biliari può essere visto dalla escrezione del fluoroforo in spazi canalicolari (K) che si sviluppano attorno alle cellule nel tempo (L). Immagine barra della scala: 100 micron. Inserto barra della scala: 50 micron. Modificato da 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura4" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig4.jpg" /> Figura 4. COL LBL stabilizza epatociti albumina e le sezioni di urea e l&#39;attività CYP oltre 14 giorni in dispositivi microfluidici. (A) Albumina secrezione da epatociti in COL LBL iniziato basso e aumenta con il tempo uino raggiunge un plateau a giorno 10. (B) la secrezione di urea dagli epatociti COL LBL diminuita con il tempo fino a raggiungere un plateau a giorno 10. (C) L&#39;induzione dell&#39;attività CYP1A è stata bassa in giorno 2, ma notevolmente aumentato al giorno 7, un livello che è stato mantenuto attraverso giorno 14. Media ± SEM; COL LBL: epatociti colto dopo LBL deposizione di collagene; NoTop: epatociti in coltura senza strato di matrice superiore; n = 6-8 dispositivi. Modificato da 9. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Views.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

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Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Ricerca

Bioingegneria

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotipiche Collagene I test: una piattaforma malleabile per valutare Comportamento cella in un 3-dimensionale Contesto

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Una piattaforma microfluidica per stimolare i condrociti con la compressione dinamica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...