Yazarlar Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Sağlık yolun Enstitüleri bağımsızlık Ödülü (K99CA201603) kabul etmiş oluyorsunuz.

Bu protokol için kullanılan yenidoğan sıçan cardiomyocytes 2 bayat Sprague-Dawley fareler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Brigham ve kadın Hastanesi tarafından onaylanmış bir iyi kurulmuş yordamı56 takip dan izole edildi.
1. Bioprinter araçları
<ol>
	<li>(Örneğin, 27 G, 1 inç) daha küçük bir künt iğne çekirdek çift katmanlı, konsantrik mikrosıvısal yazdırma kafasını oluşturmak için kılıf (örneğin, 18 G, ½ inç) daha büyük bir künt iğne merkezi haline ekle; çekirdek iğne hafif çıkıntılı emin olun (~ 1 mm) dış kabuk (şekil 1A) daha uzun. Ama uygun boyutlarda gerekli mesafe tutucular geçici iç/dış iğne ucu ve konsantrik hizalama yardımcı olmak için varil iki taraf arasında gözükeceksin Eğer hizalama genellikle el ile ayarlanır. Varil epoksi yapıştırıcı ile kavşak mühür ve hizalama çubukları uygun olduğunda uç taraftan kaldırın.</li>
	<li>Başka bir iğne (23 G) Merkezi iğne ters yönde varil ekleyin.  Sonra dış iğne varil tarafında bir delik oluşturmak ve sızdırmazlık epoksi yapıştırıcı ile ardından deliğe boyutu eşleşen bir metal konektörünü takın.</li>
	<li>Alıcılar için bir çift kanallı şırınga pompa enjeksiyon bioink ve çapraz çözüm için kafasının tek tek, iki PVC borular bağlayın. Ekstruder poly(methyl methacrylate) (PMMA) yapılan bir plastik tutucu kullanarak bir bioprinter başkanı üzerine monte. Not: Bioprinter seçimi kullanılabilirliğine bağlıdır. Bizim durumumuzda, başarıyla bu kurulum birkaç piyasada bulunan bioprinters üzerinde test ettik. Ancak, bir x-y-z motorlu sahne sahiptir herhangi bir bioprinter bu mikrosıvısal yazdırma kafasını bütünleştirilmesi ilke olarak, etkinleştirmeniz gerekir.</li>
</ol>
2. Bioprinting Microfibrous vasküler yatağın
<ol>
	<li>Aljinat (4 w/v%, düşük viskozite), jelatin methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)57,58ve photoinitiator Irgacure 2959 karışımı kullanarak bioink yapmak (0.2 - 0.5 wt.%) 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl içinde çözünmüş] etan sülfonik asit (HEPES tampon, pH 7,4) içeren 10 vol.% fetal sığır serum (FBS).</li>
	<li>10 vol.% FBS crosslinking taşıyıcı sıvı olarak içeren HEPES tampon yapmak a eriyik 0,3 M CaCl2 .</li>
	<li>Bioprinting, hemen önce insan göbek damar endotel hücrelerden (HUVECs) tedavi 0,05 w/v% tripsin tarafından 5-10dk için kullanarak şişeler ayırmak ve bioink 5-10 × 106 hücre/mL bir konsantrasyon, hücrelerde resuspend. Süspansiyon homojen dağılımı sağlamak için yavaş yavaş 5-10 kat pipette.</li>
	<li>5 µL/mL aynı akış hızı bir çift kanallı şırınga pompa kullanarak bioink/crosslinking sıvı enjeksiyon başlatın. Akar onlar stabilize kadar 1 dakikaya kadar sürekli çalışmaya izin verilebilir. Daha sonra Yazdırma kafası hareket ifade hız yaklaşık 4 mm/s (şekil 1B) ile bioprinter kontrol ederek başlatın. Bu hızları iyi en iyi bioprinting emin olmak için her yeni ayarları ile ayarlama. Bioprinting işlemi genellikle oda sıcaklığında (21-25 ° C) yapılmış ama bu sıcaklık değişmiş olabilir. Bioprinting işleminin hızlı iyonik jelleşme aljinat bileşeni ve bir microfibrous İskele yapısı-İskele (şekil 1B) birikimi için izin vermelidir.</li>
	<li>İskele bioprinted sonra kimyasal jelleşme 20-30 s (şekil 1C) için daha fazla photocrosslinking GelMA bileşeni, yaklaşık 5-10 mW/cm2 UV ışık (360-480 nm) tarafından elde.</li>
	<li>Bioprinting ve çapraz yavaşça iskele fosfat tamponlu tuz aşırı CaCl2kaldırmak için (PBS) ile yıkayın. Kültür HUVECs yüklü microfibrous iskele endotel hücre büyüme orta (EGM) 16 gün için bir kuluçka-37 ° C ve 5 vol.% CO2 orta ile en az 2 günde değişti. Bir mikroskop altında HUVECs türleri Morfoloji kültür dönemde izlemek.</li>
</ol>
3. bozukluklarına doku oluşturma
<ol>
	<li>HUVECs Lümen benzeri yapıları (şekil 1D) oluşturmak için iskele microfibers çevrelerine geçiş, iskele almak ve yavaşça bir hidrofobik yüzey (örneğin, polymethylsiloxane [PDMS] bir levha) bir yüzeye yerleştirin. Bir parça steril filtre kağıdı dikkatle kapiller Kuvvetleri ile iskele interstisyel uzaydan gelen tüm Orta kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Hemen bir damla (yaklaşık 20-40 µL) orta 1-10 × 106 hücre/mL İskele yapısı-İskele (şekil 1E) tüm interstisyel alanı sızmak iskele üstüne yoğunluğu, süspansiyon bir ikincil hücre türü (örneğin, cardiomyocytes) ekleyin. Bu tür bir yapılandırma bir kuluçka (37 ° C, 5 vol.% CO2, % 95 bağıl nem) 0.5 - hücreleri bireysel microfibers bağlı kalmak izin vermek için 2 h için kuluçkaya. Damlacık boyutu fark yok buharlaşma görülmektedir emin olmak için bir süre içinde izlemek.</li>
	<li>Yavaşça iskele istenen bozukluklarına doku kurdu kadar herhangi bir yapışık olmayan hücreleri ve kültür yapısı ilgili ortamda kaldırmak için PBS banyo sallayarak yıkayın.</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

İnşaat koaksiyel kafasının doğru başarılı mikrosıvısal bioprinting her iki bioink aynı anda teslim çekirdek ve kılıf itibaren crosslinking ajan için izin vermek için kritik bir adımdır. Bu protokol için bir örnek yazdırma kafasını 27 G iğne çekirdek ve bir 18 G iğne kabuk olarak kullanılarak oluşturulmuş olsa da, kolayca farklı boyutlarda iğne kullanarak kombinasyonları çeşitli için uzatılabilir. Ancak, akışı miktarında değişiklik her aşamasında teslim, iğne boyutlarda değişiklik hem bioink ve çapraz (kişi tarafından ayarlanabilen bir çift kanallı bir yerine iki şırınga pompa kullanarak) ve potansiyel olarak Ayrıca tarafından bioprinter sonucunda oluşan birikim hızı akış hızı daha fazla optimizasyonu gerektirir.
Geçerli protokol parametrelerinde (iğne boyutları, debi ve birikim hızı) kombinasyonu, yaklaşık 150 µm için denge orta55yılında sonra şişmeye ifade hemen sonra yaklaşık 120 µm büyüklüğündeki bioprinted microfibers yol açtı. Microfibers katmanlar arasında boşluk olduğu böyle bir boyutu bioprinted yapıları katman kalınlığı da kabaca eşittir. Bioprinted microfibers çapını tüm üç parametreleri54,63bir fonksiyondur; Yazdırma kafasının çekirdek iğne ve bioink akış hızı boyutunu olumlu ilişkili mısınız microfibers çapı ile kılıf iğne, Debi crosslinking Aracısı ve birikim hızı boyutunu olumsuz yönde korelasyon ise microfibers çapı ile. Yazdırma kafasının ve/veya motorlu sahne hareketi üzerinde kontrol microfibrous iskele rasgele yapıları54,55ifade için izin verecek.
Ayrıca, bioink formülasyonu bioprinting de profil değişebilir. Örneğin, aljinat ve GelMA miktarı biraz göre belirli uygulamaları modülasyonlu ve ek malzemeler polietilen glikol-tetraacrylate (PEGTA) bioprinted microfibers40mekaniği artıran gibi bioink içine karıştırmak mümkündür. UV crosslinking de daha fazla katıştırılmış endotel hücreleri54davranışını etkileyebilir bioprinted microfibers ortasına mekanik özelliklerini belirler. Bu protokol için rapor parametreleri HUVECs için optimize. Ancak, endotel hücreleri her farklı türü için crosslinking parametreleri yeniden microfibers oluşumunda Lümen elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir ki, tahmin edilmektedir.
Orta hücre tipi bioprinted vasküler yatağın üzerine temel için iskele bir parça hidrofobik yüzey üzerine yerleştirin ve interstisyel alanda, scaffold çoğu orta kaldırıldığından emin olmak gereklidir. Bu hücre süspansiyon hemen infiltrasyonu microfibers yüzeyine bağlı hücre sayısını en üst düzeye çıkarma microfibrous yapıda damlacık serbest duran ve İskele tohum, ders sırasında şifreleme sağlar. Her ne kadar cardiomyocytes 5 × 106 hücre/mL, nispeten yüksek yoğunluğu geçerli protokolündeki miyokard doku oluşturmak için kullanılan, böyle yoğunluk keyfi olarak belirli doku türleriyle eşleştirmek üzere ayarlanabilir. Steril su doldurarak fark oksijen bir ortam sağlamak için önemlidir veya PBS (Yani, çevredeki kuyu veya PDMS levha çevreleyen alan), iskele çevresinde sağlanması tohum için orta az miktarda tohum döneminde buharlaşır değil.
Özetle, biz bozukluklarına dokulara uygun imalat için mikrosıvısal bioprinting detaylı bir protokol sağladı. Bu strateji, bir çekirdek-kılıf koaksiyel yazdırma kafasını bir hibrid bioink kılıf çekirdek ve crosslinking aracısından üzerinden eşzamanlı ekstrüzyon etkinleştirmek için kullanılır. Co-ekstrüzyon, üzerine bioink hemen bir katmanlı microfibrous iskele bioprinter hareketi tarafından programlanmış gibi şekillendirme kendi aljinat bileşeni için fiziksel crosslinking uğrar, kimyasal olarak tüm yapı ise photocrosslinked uzun vadeli istikrar sağlamak GelMA bileşeni için daha fazla. Endotel hücreleri bioprinting işlemi sırasında microfibers içinde kapsüllü çoğalırlar ve Lümen benzeri yapıları, iskele vasküler yatağa dönme varsayarak çevrelerine acilen yükseltmelidir. Orta hücre tipi tohum tarafından bir bozukluklarına doku yapısı daha sonra oluşturulabilir. Bu mikrosıvısal bioprinting strateji benzersizdir ve çeşitli doku tipleri gibi karaciğer, iskelet kas için elverişli bir konuma sahip genişletilebilir ve kanserlerin yanı sıra Miyokardiyum geçerli iletişim kuralı ' rasyonel istenen hücre tipleri birleşimi tarafından resimli ve bioprinted microfibrous İskele Kalıpları özel olarak tasarlanmış. Böyle bir yöntem ile üretilen bozukluklarına doku yapıları içinde vivo doku rejenerasyonu veya vitro doku modelleme için kullanılabilir.
Bu protokol için açıklanan mikrosıvısal bioprinting strateji ile ilgili bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, bioprinted microfibers çapını CaCl2 çözüm için verimli bir şekilde crosslink çekirdek aljinat bileşeninde hidrojel matris difüzyon engel nedeniyle birkaç yüz mikrometre sınırlıdır. Aşırı düşük fiziksel crosslinking yoğunluğu çok katmanlı yapısı kararsız hale getirir. İkinci olarak, fiziksel crosslinking Ajan CaCl2 çözüm daha kırılgan HUVECs, endotelyal progenitor hücreler gibi bazı endotel hücre türleri üzerinde olumsuz etkileri uygulamak. Endotel hücre tipleri daha geniş için böyle bir bioprinting yöntemini kullanarak fizibilite ek araştırmalar gerektirebilir. Üçüncü olarak, endotel hücreleri Lümen benzeri yapıları microfibers içinde oluşabilir iken, bu microfibers çekirdek perfüzyon etkinleştirmek için içi boş değildir. Bu nedenle, besin ve oksijen hala bioprinted iskele interstisyel alanda üzerinden olmak üzere sağlanmıştır. Kurban malzemeleri adaptasyon bioink64 photocrosslinkable bileşeni olarak teknoloji gelecekteki sürümlerinde bu sorunu çözebilir. Alternatif olarak, bioprinted içi boş microfibrous yapıları42,43,65,66,67,68 vasküler yatak olarak doğrudan perfüzyon bozukluklarına doku sağlamak için kullanılan oluşturur. Son, bioprinting klinik ölçekli dokuların hangi büyük olasılıkla yüksek işlem hacmi itibariyle genişletilmiş ölçek bioprinting ulaşmak için dizilmiş mikrosıvısal yazdırma kafalarını69 tasarımını dahil ederek ele alınabileceği zorlu, kalmış olabilir.

Doku Mühendisliği hedeflerini değiştirmek, geri yükleme veya bu yaralı veya hastalıklı insan vücudu1,2,3,4, sık sık istenen hücre tipleri, biyoaktif molekülleri5,6ve Biyomalzeme7,8,9,10bir birleşimi yoluyla çoğaltmak için kullanılan işlev doku yerine oluşturmak için. Daha yakın zamanlarda, doku Mühendisliği teknolojilerini de giderek ilaç geliştirme, değiştirme geleneksel aşırı Basitleştirilmiş düzlemsel hücre kültürleri11,12,13,14,15,16,17,18,19gibi uygulamalar için in vivo karşılıkları önemli işlevlerini taklit vitro doku ve organ modelleri oluşturmak için kabul edilmiş. Her iki durumda, yetenek karmaşık mikro mimarisi ve insan dokuların hiyerarşik yapısını özetlemek için mühendislik doku10işlevselliğini etkinleştirme önemlidir ve vaskülarizasyon alan20,21,22,23en büyük zorluklardan biri sunar beri özellikle, vasküler bir ağ mühendislik dokuların entegre etmek talebi yollarıdır.
Bugüne kadar çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir bu konuda başarı8değişik derecelerde ile mühendislik doku yapıları içine damar yapıları oluşturmak için bir girişim. Örneğin, kendinden montajlı endotel hücrelerinin mikrovasküler ağlar24üretimi için izin verir; Teslimat anjiogenik büyüme faktörlerinin sürekli neovaskülarizasyon25,26neden olmaktadır; Vasküler progenitör hücrelerin kullanın ve endotel hücre büyümesi ve derleme24,27perisitlerden kolaylaştırır; İskele özelliklerini tasarlama vaskülarizasyon28,29hassas modülasyon sağlar; ve vasküler katman30uygun manipülasyon için hücre sayfası teknolojisi sağlar. Yine de, bu stratejileri kez kan damarlarının bir mühendislik doku yapısı ve böylece sınırlı tekrarlanabilirlik içinde rasgele dağıtıma giden damarlara, kayma desenlendirme denetleme yeteneğine bağışlamak değil. Son birkaç yıl içinde bioprinting Teknolojileri karmaşık doku desenleri yüksek sadakat ve tekrarlanabilirlik bir otomatik veya yarı otomatik şekilde31,32,33yatırma benzersiz onların çok yönlülüğü nedeniyle böyle bir sorun çözüm doğru etkinleştirmenin bir sınıf olarak ortaya çıkmıştır. Kurban bioprinting34,35,36,37,38, katıştırılmış bioprinting39,40,41ve var içi boş yapı bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 tüm vasküler veya bozukluklarına doku oluşturma fizibilite gösterdi.
Alternatif olarak, microfibrous iskele imal etmek bir mikrosıvısal bioprinting strateji son zamanlarda geliştirilmiştir, nerede bir hibrid bioink aljinat beste ve jelatin methacryloyl (GelMA) eş merkezli bir yazdırma kafası ve Kalsiyum klorür (CaCl2) çözüm çekirdek aracılığıyla teslim edildi yazdırma kafasını54,55dış kılıf akış gerçekleştirildiği. Co-ekstrüzyon sonraki photocrosslinking çok katmanlı microfibrous iskele kalıcı istikrar sağlanmış iken mikrofiber oluşumu, etkinleştirmek için hemen fiziksel polietilenin aljinat bileşeni için izin iki akış. Not, endotel hücreleri bioprinted microfibers içinde kapsüllü çoğalırlar ve vasküler yatağın54,55taklit Lümen benzeri yapıları varsayarak microfibers çevrelerine karşı geçirmek için bulunamadı. Bu bioprinted endothelialized vasküler yatak daha sonra ile doldurulur ikincil hücre tipleri daha fazla bozukluklarına doku55oluşturmak için istenen. Bu iletişim kuralı böylece bozukluklarına dokuları doku Mühendisliği ve organoid modelleme potansiyel uygulamalar için uygun imalat sağlar konsantrik meme tasarım tarafından etkin böyle bir stratejinin mikrosıvısal bioprinting detaylı bir yordam sağlar.

<table><tbody><tr><td>Alginic acid sodium salt from brown algae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0682</td><td>BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder</td></tr><tr><td>Gelatin type A from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>Gel strength 300</td></tr><tr><td>Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4&#039;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896</td><td>98%</td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td>Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>BioXtra, &amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001</td><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)</td></tr><tr><td>GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td>GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)</td></tr><tr><td>Endothelial cell growth medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12430054</td><td>High glucose, HEPES</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Clear 0.5 kg Kit</td></tr><tr><td>UV curing lamp system</td><td>Excelitas Technologies</td><td>OmniCure S2000</td><td>Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor</td></tr></tbody></table>

microfluidic bioprinting for engineering vascularized tissues and organoids

Bozukluklarına doku mühendislik yapıları ve organoids tarihsel zorlu olmuştur. Burada bir iskele ile çok katmanlı hidrojel microfibers titreşimli görüntüyü oluşturmak için mikrosıvısal bioprinting dayalı bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Pürüzsüz elde etmek için bioprinting, çekirdek akışı ve kılıf akış tarafından taşınan crosslinking çözüm kalıptan çekilmiş bir bileşik bioink formülasyonu içeren bir çekirdek-kılıf mikrosıvısal yazdırma kafasını tasarlanmış ve bioprinter monte. Jelatin methacryloyl (GelMA) aljinat ile karıştırma tarafından varlığı anlık iyonik crosslinking uğrar bir polisakkarit seçin divalent iyonları, kalıcı istikrar elde etmek için GelMA bileşen ikincil bir photocrosslinking tarafından takip, bir microfibrous iskele bu bioprinting strateji kullanarak elde edilebilir. Önemlisi, bioprinted microfibers içinde kapsüllü endotel hücreleri damarlara kültür boyunca 16 gün benzeyen Lümen benzeri yapılar oluşturabilir. Endothelialized microfibrous iskele daha fazla vasküler yatak microfibers interstisyel uzaya ikincil hücre türünün sonraki tohumlama yoluyla bozukluklarına bir doku oluşturmak için kullanılabilir. Mikrosıvısal bioprinting uygun Mühendisliği, yüksek sadakat bozukluklarına dokuların Genelleştirilmiş bir strateji sağlar.

Mikrosıvısal bioprinting strateji microfibrous iskele düşük viskozite bioinks54,55kullanarak doğrudan ekstrüzyon bioprinting için sağlar. Şekil 2'A, bir iskele 6 × 6 × 6 mm bir boyutu ile gösterildiği gibi3 içeren &#62; microfibers 30 kat bioprinted 10 dk içinde olabilir. CaCl2 aljinat bileşeniyle hemen iyonik polietilenin mükemmel yapısal bütünlüğü için üstten görünüm ve yan görünüm rakamlar 2B ve 2 Ciçinde gösterildiği gösterildiği gibi bioprinted microfibrous iskele uzun vadeli istikrar sağlamış GelMA bileşenin sonraki fiziksel photocrosslinking sırasında bioprinting işlemi sırasında izin. Bu durumda, protokol alanında belirtilen bioprinting koşullar altında elde microfibers biraz artış fazla mesai ile şişme çapı yaklaşık 100-150 µm vardı.
Bioink, iyonik crosslinking ve photocrosslinking mikrosıvısal ekstrüzyon bioprinting bir işlemi, kapsüllenmiş HUVECs canlılık önemli ölçüde etkilemedi. Hücreleri nispeten yüksek bir canlılık korumak olabilir &#62; bu yordamları (Şekil 2D) tamamlanmasından sonra % 80'i. Bildirilen önceki54,55, HUVECs yavaş yavaş çoğalırlar ve gün 0 (Şekil 2E) başlangıçta rasgele dağılımından microfibers gün 16 mesaj-bioprinting kültür (Şekil 2F) Lümen benzeri yapılar varsaymak microfibers çevrelerine için göç. HUVECs için gözlenen davranış iç arabirim uygulamalı eğilim endotel hücrelerinin yanı sıra besin ve oksijen daha microfibers içinde onların iç55,59çevreleyen yüksek durumu nedeniyle büyük olasılıkla oldu.
Microfibrous İskele de doku mühendisliği için tek başına platform olarak davranabilir. Miyokardiyum doku örnek olarak kullanarak, Yenidoğan fare cardiomyocytes bir bioprinted iskele 5 × 106 hücre/mL yoğunluğu, interstisyel alana tohumlari ve içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (10 vol.% FBS takıma DMEM) kültürlü. Orta ilk 2-3 yenerek, cardiomyocytes yapmaya başlayana kadar gün her gün, sonra her 2-3 gün55,60,61,62tek ½ orta vardı aktarımının değiştirildi. Hücreleri spontan ve senkronize hücre kaynak ve İskele55yapılandırılmasına bağlı olarak 9-28 güne kadar dayak korumak olabilir. İskele üzerinde olgun cardiomyocytes da sarcomeric α-aktinin (şekil 3B) ve connexin-43 (şekil 3C) de dahil olmak üzere şekil 3' te, fonksiyonel kalp biyolojik confocal floresan görüntülerde resimli olarak güçlü ifade gösterdi.
Endotel hücreleri ve ikincil hücre tipi bir araya getiren bir bozukluklarına doku daha da inşa edilebilir. Yine, vasküler yatağın kültür kabaca 16 gün sonra bir bioprinted microfibrous iskele kurdu sonra Miyokardiyum örnek olarak kullanarak, Yenidoğan sıçan cardiomyocytes daha sonra iskele interstisyel uzaya numaralı seribaşı. Sonra kültür ve olgunlaşma ortak bir ortamda EGM:DMDM 1:1 birim rasyon oluşan, endothelialized bir miyokard doku spontan ve zaman uyumlu dayak55sergilenmesi oluşmuş. Albümdeki tek uçak confocal Floresan şekil 4 daha fazla hücre tipleri, esas olarak microfibers (şekil 4B) sınırları içinde mevcut HUVECs ve microfibers (şekil 4C) dış çevreleyen cardiomyocytes co-varlığı saptandı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig1.jpg"> 
Resim 1 : Bozukluklarına doku oluşturmak için mikrosıvısal Bioprinting strateji oluşturur. 
(A) Kompozit bioink ve CaCl2Co-ekstrüzyon için çekirdek-kılıf koaksiyel yazdırma kafası tasarımı. (B-E) Bozukluklarına mendil üretim prosedürü gösterilen şemalar oluşturun. Bu rakam izni referans55ile değiştirildi. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig2.jpg"> 
Resim 2 : Bioprinting Microfibrous vasküler yatağın. 
(A) bir bioprinted 30-katman microfibrous iskele gösterilen fotoğraf. (B, C) Üst ve yan bir bioprinted iskele gösterilen Filmler kez izlendi. (D) canlılık, bir bioprinted microfibrous iskele yüklü HUVECs. Yeşil ve kırmızı canlı ve ölü hücreler, sırasıyla gösterir. (E, F) Yeşil fuorescent protein (GFP) organizasyonu gösteren Floresans Filmler-HUVECs bioprinted microfibers 0 bir gün içinde ve gün 16 mesaj bioprinting, anılan sıraya göre. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Cardiomyocytes Bioprinted Microfibrous iskele üzerinde sonraki büyüme. (A) çekirdek, (B) sarcomeric α-aktinin, (C) connexin-43 ve (D) superimposition gösteren Floresans filmler. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig4.jpg"> 
Şekil 4 : İnşaat Endothelialized miyokard doku. (A) çekirdek, (B) GFP-HUVECs, (C) f-aktin hem HUVECs ve cardiomyocytes ve (D) superimposition gösteren Floresans filmler. D iç metin endothelialized miyokard doku bir alt-büyütme görüntüsünü gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55957/55957fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri kümesi. Bir örnek G-code bioprinting 6 × 6 mm2 kare kafes bitişik microfibers arasındaki 220 µm Aralık ile dosya.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids at JoVE.com

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

microfluidic-bioprinting-for-engineering-vascularized-tissues

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Video: Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Biyomühendislik

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium ile 3D Biyobaskıyı Geliştirme

Embedded Bioprinting of Tissue-like Structures Using &#954;-Carrageenan Sub-Microgel Medium

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic scaffolds. However, engineering a suitable gel suspension medium that balances precise bioink deposition with cell viability and function presents multiple challenges, particularly in achieving the desired viscoelastic properties. Here, a novel &#954;-carrageenan gel supporting bath is fabricated through an easy-to-operate mechanical grinding process, producing homogeneous sub-microscale particles. These sub-microgels exhibit typical Bingham flow behavior with small yield stress and rapid shear-thinning properties, which facilitate the smooth deposition of bioinks. Moreover, the reversible gel-sol transition and self-healing capabilities of the &#954;-carrageenan microgel network ensure the structural integrity of printed constructs, enabling the creation of complex, multi-layered tissue structures with defined architectural features. Post-printing, the &#954;-carrageenan sub-microgels can be easily removed by a simple phosphate-buffered saline wash. Further bioprinting with cell-laden bioinks demonstrates that cells within the biomimetic constructs have a high viability of 92% and quickly extend pseudopodia, as well as maintain robust proliferation, indicating the potential of this bioprinting strategy for tissue and organ fabrication. In summary, this novel &#954;-carrageenan sub-microgel medium emerges as a promising avenue for embedded bioprinting of exceptional quality, bearing profound implications for the in vitro development of engineered tissues and organs.

Yazar Spotlight: Yüksek Çözünürlüklü 3D Biyobaskı için Homojen κ-Carrageenan Alt Mikrojel Banyolarının Geliştirilmesi

This study introduces a novel &#954;-carrageenan sub-microgel suspension bath, displaying remarkable reversible jamming-unjamming transition properties. These attributes contribute to the construction of biomimetic tissues and organs in embedded 3D bioprinting. The successful printing of heart/esophageal-like tissues with high resolution and cell growth demonstrates high-quality bioprinting and tissue engineering applications.

κ-Carrageenan Sub-Microjel Ortamı Kullanılarak Doku Benzeri Yapıların Gömülü Biyobaskısı

Embedded three-dimensional (3D) bioprinting utilizing a granular hydrogel supporting bath has emerged as a critical technique for creating biomimetic ...

Mühendislik

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık

Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

κ-Carrageenan Sub-Microjel Ortamı Kullanılarak Doku Benzeri Yapıların Gömülü Biyobaskısı

κ-Carrageenan Sub-Microjel Ortamı Kullanılarak Doku Benzeri Yapıların Gömülü Biyobaskısı

κ-Carrageenan Sub-Microjel Ortamı Kullanılarak Doku Benzeri Yapıların Gömülü Biyobaskısı

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler