This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

Bütün hayvan prosedürleri Columbia Üniversitesi IACUC ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için geçerli kurallar tarafından kabul edildi izledi. Not: RNaz içermeyen veya DEPC ile muamele edilmiş su içinde ISH işlemleri için kullanılan tüm tamponları hazırlayın. ISH tamamlanmıştır fakat tampon de otoklavlanmış çifte damıtılmış su içinde hazırlanır ve / veya filtreleme ile sterilize edilir önerilmektedir sonra bu öneri kesinlikle gerekli değildir. 1. İmmünohistokimya Ardından Situ Hibridizasyon Yetişkin Fare Beyin kullanarak Floresan in Kolinerjik Aksonlar için Atf4 mRNA Yerleşen (FISH) tespiti <ol><li> Paraformaldehid sabit dondurulmuş beyin dilimleri için örnek hazırlama <ol><li> Aşağıdaki Örneğin, sabit bir dondurulmuş bir fare beyinlerinden dilimleri hazırlamak. <ol><li> Kısaca, ketamin anestezi 9 aylık fareler kurban (100 mg kg -1 vücut ağırlığı) ve xylazine (10 mg kg -1 vücut weigHT), PBS içinde% 4 paraformaldehit transcardial infüzyonu (pH 7.4) eklenmiştir. </li><li> 4 o C&#39;de 24 saat süreyle% 4 paraformaldehid beyin ve post-fix kaldır </li><li> Tespit edildikten sonra, 4 O ° C&#39;de 24 saat süre ile, PBS (pH 7.4) içinde numuneleri% 30 sukroz içinde üç PBS içinde süreleri ve cryoprotect yıkama </li><li> Ekim göm beyinler bir kriyostat üzerinde, 20 mikron seri bölümünde, bileşik donma ve poli-D-lizin tedavi mikroskop lamı üzerine monte edin. -20 O C&#39;de kullanıma kadar beyin dilimleri tutun. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile dondurucu ve kuru hava ile ilgili paraformaldehid ile tespit edilmiş olan beyin dilimleri çıkarın. </li><li> 1x PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Bir çeker ocak içinde, yeniden düzeltme beyin oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid ile 20 dakika keser. NOT: DİKKAT: 4% paraformaldehit toksiktir ve uygun güvenlik protokolleri takip ederek ve atılmalıdır. </li><li> 1x PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Beyin dilimleri dehydrate. <ol><li> % 50,% 75 ve% 100 Hazırlamaetanol çözümleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 50 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 75 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca,% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, taze,% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. Not: Alternatif olarak, slaytlar 1 aya kadar C o -20% 100 etanol içinde saklanabilir. </li></ol></li></ol></li><li> FISH tahlil ısı kaynaklı antijen / RNA maskesinin kaldırıldı ile immunohistokimyasal izledi <ol><li> Başlamadan önce gerekli tüm malzemeyi hazırlayın: <ol><li> 40 o C hibridizasyon fırın ısıtın ve nemlendirilmiş bir ortam yaratmak için fırında damıtılmış su ihtiva eden bir tepsiye yerleştirin. </li><li> Bir slayt kutusu alın ve içine slayt kutusu nemlendirmek için distile suda ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin. Hibridizasyon fırında slayt kutusu yerleştirin. </li><li> Buzdolabı probları (negatif ve hedef problar her ikisi de) çıkarın ve 10 dakika için hibridizasyon fırında ısıtın. Sondalar dow soğumaya bırakınoda sıcaklığında n. </li><li> Oda sıcaklığında (Floresan Multiplex Reaktif Kiti dahil) büyütme reaktifleri AMP 1-4 dengelenmesi. </li><li> Antijen alma çözeltisi hazırlayın: 10 mM sodyum sitrat (pH 6),% 0.05 Tween 20 Not: Çözelti süresiz oda sıcaklığında saklanabilir ve gelecekteki boyanması için de kullanılabilir. </li><li> RNaz ücretsiz veya DEPC arıtılmış su içinde (Floresan Multiplex Reaktif Kiti dahil) 50x stok solüsyonu seyreltilmesi 1x yıkama tamponu hazırlayın. Not: 1 x yıkama tamponu 1 ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir ve ileride boyanması için de kullanılabilir. 50x yıkama tamponu hızlandırabilir olabilir. Bu durumda, 1 x çözeltisinin hazırlanması önce 10 dakika boyunca 40 C &#39;de, ısı 50x yıkama tamponu. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca,% 100 etanol ve kuru hava slaytları çıkarın. </li><li> Antijen alma çözeltisi 50 ml ihtiva eden bir coplin kavanoz hazırlayın. Antijen alma çözeltisi içinde slaytlar daldırın ve mikrodalga fırında 10 dakika süreyle kaynatın. NOT: Alternatif bir yerde 100 mm yatay slaytlaralma çözeltinin 100 ml içeren çap yuvarlak cam tabak. <ol><li> Distile su ile 1 L beher doldurun ve mikrodalga yerleştirin. NOT: maskesinin kaldırıldı yaparken su ısı &quot;tampon&quot; olacaktır. </li><li> Mikrodalga içindeki antijen alma çözeltisi içinde slaytlar yerleştirin. Kaynatın 5 dakika boyunca yüksek güçte kayar. Numuneler kaynar durduruldu hemen sonra, ısı ekstra 5 dakika boyunca yüksek güçte tekrar kayar. </li><li> RT&#39;de slaytlar serinleyin. NOT: KRİTİK ADIM: kaynar süresi ve prosedür mikrodalga özelliklerine bağlı olarak, kullanıcı tarafından belirlenmelidir. hızlı yüksek derecede kaynama özellikli Çözelti buharlaştırma şansını başlar. Bu durumda, numuneler iki kez 10 dakikalık bir toplam olduğunu ortaya çıkarması zaman tamamlamak için daha kısa zaman periyotları için kaynatılır önerilir. Isıtma, orta ya da düşük güçte gerçekleştirilir Aksine, maskesinin düşürülmesi, 10 dakika boyunca bir kez yapılabilir. Ancak, eğer örnekleri continuousl kaynatın yokYaklaşık 10 dakikalık bir toplam Y bu tespit edilecek olan hedef RNA ve protein hem de kısmi maskesinin düşürülmesi neden olabilir. </li></ol></li><li> Yıkama 1x PBS ile üç kez kayar. </li><li> Arka plan boyama değerlendirmek için kullanılan beyin kesitleri ayarlanmış dapB prob 3 damla (~ 100 | il) - 2 ekleyin. Not: dapB prob seti bakteriyel gen hedef ve herhangi memeli RNA tanıması gerekir. </li><li> Ilgi RNA tespit etmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış hedefleme prob 3 damla - 2 ekleyin. Not: Bir prob seti artıklarını 20 hedef - Atf4 mRNA bu örnekte kullanılan fare 1.381. </li><li> Parafilm Kapak slaytlar, prob buharlaşmayı önlemek hibridizasyon fırının içindeki nemlendirilmiş slayt kutusuna koyun ve 2 saat boyunca 40 o C&#39;de onları inkübe. Not: İsteğe bağlı: Ek beyin kesitleri fare Polr2A hedef alan bir prob seti ile hibridize ve pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. </li><li> Yıkama slides iki kez oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile yıkandı. </li><li> 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 1-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 2-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 3-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 4-FL 3 damla, koyun, parafilm slaytlar kapakSlayt kutusu ve hibridizasyon fırınında 15 dakika boyunca 40 o C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yıkama 1x PBS ile 2 dakika süre ile 1 x yıkama tamponu oda sıcaklığında iki kez, iki kez kayar. </li><li> Ekle 100 - slaytlara 3 mg / ml BSA, 100 mM glisin ve% 0.25 Triton X-100, PBS içinde (pH 7.4) içeren bir bloklama solüsyonu (tam dilimleri kapak ya da yeterli hacim) 200 ul, parafilm ile kapak ve Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> , Slaytlara çözeltisi (1/100) engelleme seyreltilmiş bir anti-ChAT antikorun 200 ul parafilm ile kapak ve 4 O ° C&#39;de 2 gün süreyle inkübe - 100 ekleme Beyin dilimleri kurumasına yok emin olun. Gerekirse, 24 saat inkübasyon sonrası beyin dilimleri anti-ChAT antikor çözüm yeniden uygulayın. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde üç kez kayar. </li><li> Ekle 100 - Uygun Alexa-konjuge sekonder antikor, 200 ul (., Örneğin, bu özel örnekte, Alexa-594 eşek anti-keçi) slaytlara, parafilm ile inkubasyon ile kapakoda sıcaklığında 1 saat için yedi. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde üç kez kayar. </li><li> Yıkama damıtılmış su ile bir kez kayar. </li><li> Montaj DAPI içeren montaj ortamı ile kayar. </li><li> Bir floresan mikroskop altında beyin dilimleri gözünüzde canlandırın. </li></ol></li></ol> Luxol Hızlı Mavi ve Cresyl Violet counterstaining Ardından Situ Hibridizasyon (CISH) kromojenik kullanılarak İnsan Beyninin Samples Aksonlar için Atf4 mRNA Yerleşen 2. Algılama <ol><li> Formalin ile sabitlenmiş, parafin gömülmüş insan beyninin örnekleri için örnek hazırlama <ol><li> 1 saat 60 o C&#39;de kuru fırında pişirin dilimleri. </li><li> Bir çeker ocak içinde Deparaffinize beyin kesitleri. NOT: DİKKAT: reaktifler toksik ve ele alınması gerekir ve uygun güvenlik yönergeleri izleyerek atılır <ol><li> 10 dakika boyunca iki kez ksilen alternatif temizleme ajanı slaytlar bırakın. </li><li> 1 dakika boyunca iki kez% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> Birir-kuru dilimler oda sıcaklığında 5 dakika. Not: Alternatif numuneler RT O&#39;da kurutulmuş olabilir / N ancak 24 saat içinde kullanılmalıdır. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobenzidin (DAB) ısı kaynaklı ve proteaz kaynaklı RNA maskesinin kaldırıldı kullanarak luxol hızlı mavi ve mor leke cresyl ardından kromojenik ISH tahlil tabanlı <ol><li> Başlamadan önce gerekli malzemeleri hazırlayın: <ol><li> 40 o C hibridizasyon fırın ısıtın ve nemlendirilmiş bir ortam yaratmak için distile su içeren bir tepsiye yerleştirin. </li><li> Bir slayt kutusu alın ve içine slayt kutusu nemlendirmek için distile suda ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin. Hibridizasyon fırında slayt kutusu yerleştirin. </li><li> RNaz ücretsiz veya DEPC arıtılmış su içinde (CISH Reaktif Kiti dahil) 10x stok solüsyonu seyreltilmesi ile 1x ön muamele 2 hazırlayın. Ön-muamele sıcak bir plaka üzerinde gerçekleştirilirse, ön-muamele, eğer (çanağı ve sıcak plaka arasındaki temas yüzeyini büyütmek için, 100 mm çapında bir cam tabak için bir ön işlem çözeltisinden 100 ml ilave1.2.3 belirtildiği gibi, bir mikrodalga fırın içinde gerçekleştirildiğinde, bir coplin kavanozu) yerine kullanılabilir. 100 o C Isı çözümü ve örnekleri batış önce artık 30 dakika daha kaynayan tutmak. </li><li> Isı negatif ve pozitif sondalar 10 40 o C&#39;de dakika ve oda sıcaklığında soğumasını. </li><li> Oda sıcaklığında (CISH Reaktif Kiti dahil) büyütme reaktifleri AMP 1-6 dengelenmesi. </li><li> Damıtılmış su (CISH Reaktif Kiti dahil) 50x stok solüsyonu seyreltilmesi 1x yıkama tamponu hazırlayın. Not: 1 x yıkama tamponu 1 ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir ve ileride boyanması için de kullanılabilir. </li></ol></li><li> Her beyin dilim için önceden işleme 1 ~ 4 damla (~ 120 | il) ilave parafilm ile kapatın ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Taze damıtılmış su içinde 3-5 kez yıkayın. </li><li> Isı kaynaklı maskesinin kaldırıldı gerçekleştirin: <ol><li> (CISH Reaktif Kiti dahil) sıcak önceden işleyin 2 Transferi slaytlar 15 dakika çözüm ve kaynatın. Kaynama sağlayan sıcak bir plaka üzerinde yapılabilir Not:Sürekli kaynama ya da 1.2.3 belirtilen kritik adımlar) Aşağıdaki bir mikrodalga. </li></ol></li><li> Hemen distile su slaytlar aktarmak ve 3 ila 5 kez yıkayın. </li><li> Yıkama taze% 100 etanol içinde 3 ila 5 kez kayar. </li><li> Hava kuru dilimler, oda sıcaklığında 5 dakika. Not: Alternatif dilimler kurutulabilir O / N. </li><li> Proteaz kaynaklı maskesinin kaldırıldı uygulayın: <ol><li> (CISH Reaktif Kiti dahil) önceden işleyin 3 4 damla ekleyin, parafilm ile kaplayın ve hibridizasyon fırında 40 o C&#39;de 30 dakika inkübe. </li></ol></li><li> Yıkama taze damıtılmış su içinde 3 ila 5 kez kayar. </li><li> Arka plan boyama değerlendirmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış dapB probu 4 damla ekleyin. </li><li> Ilgi RNA tespit etmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış hedefleme probu 4 damla ekleyin. NOT: kalıntılarını 15 hedefleme prob seti - İnsan ATF4 mRNA 1,256 bu örnekte kullanılmıştır. İSTEĞE BAĞLI: Ek beyin dilimleri hyb olabilirİnsan ppiB hedef alan bir prob seti ile ridized ve pozitif kontroller olarak kullanılmıştır. </li><li> Slayt kutusuna slaytlar yerleştirin ve 2 saat süre ile inkübe edilir. hibridizasyon fırında 40 o C&#39;de. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her beyin dilime AMP 1 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her beyin dilime AMP 2 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her beyin dilime AMP 3 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe. </li><li> 1x oldu ile iki kez yıkayın slaytlaroda sıcaklığında 2 dakika süre ile H tamponu. </li><li> Her beyin dilime AMP 4 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her bir beyin dilime AMP 5 reaktif 4 damla, parafilm ile slaytlar kapağı ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her bir beyin dilime AMP 6 reaktifi 4 damla, parafilm ile slaytlar kapağı ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her beyin dilime ~ çözeltinin 120 ul ekleyin, (CISH Reaktif Kiti dahil) eşit BROWN-1 hacmini ve BROWN-2 reaktif karıştırın parafilm kapağı ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki kez kayar ve damıtılmış su içinde bir kez yıkayın. NOT: KRİTİK ADIMLAR: Aşağıdaki adımlar için kritik olanRNA granüllerinin varlığı maskeleme olmadan optimal aksonal counterstain edinin. </li><li> Bir aydınlık mikroskop altında ilgi mRNA varlığını kontrol counterstain gerçekleştirmeden önce. Counterstain prosedür boyunca puncta varlığını izlemek için hangi beyin örneklerinde referans alanlarını tanımlayın. </li><li> 60 o C&#39;de ısıtın luxol hızlı mavi çözüm </li><li> Yer luxol hızlı mavi slaytlar ve 60 o C de 30 dakika inkübe </li><li> Damıtılmış su içinde birkaç kez çalkalayın. </li><li> Daldırma farklılaşmasını başlatmak için% 0.05 lityum karbonat çözeltisi içinde birkaç kez kayar. </li><li> Dip taze% 75 etanol içinde iki kez kayar. </li><li> Damıtılmış su içinde durulayın. </li><li> Bir aydınlık mikroskop altında beyin dilimleri kontrol edin. Gri ve beyaz cevher koyu mavi / siyah puncta olarak hala görünür ayırt ve RNA granülleri olmaya başlaması gerektiğini unutmayın. Aksonlar açık mavi lifler gibi görünen başlar doğrulayın. </li><li> Tekrarlayın 2.2.32 ile 2.2.28 adımları. Perfor20 dk adımlar dikkatle counterstain ve RNA granül varlığının izlenmesi - 10 luxol hızlı mavi çözeltisi ile m inkubasyon. Not: Genellikle, optimum counterstain 60 kazanılır - bu RNA granüller luxol hızlı mavi leke (örnekler için bakınız Şekil 2) tarafından maskeli olabileceği şüphesi varsa 90 dakika (toplam kuluçka süresi) ancak zaman kısaltılabilir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kresil violet solüsyonu slaytlar inkübe edin. </li><li> Damıtılmış su içinde slaytlar durulayın. </li><li> Dip% 70 etanol içinde 5-10 kez kayar. </li><li> % 100 etanol 3 hızlı değişiklikleri ile beyin dilimleri dehydrate. </li><li> Bir çeker ocak içinde, 2 dakika ve oda sıcaklığında 5 dakika süre ile üçüncü kez ksilen, alternatif temizleme maddesi içinde iki kez inkübe edilerek açık bir beyin kesitleri. </li><li> Ksilen bazlı kalıcı montaj ortamda Dağı beyin dilimleri. </li><li> Bir aydınlık mikroskop altında örnekleri analiz edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly,+maintenance+and+repair.">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li><li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation.">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li><li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+RhoA+regulates+growth+cone+collapse.">Local translation of RhoA regulates growth cone collapse.</a> Nature. 436, 1020-1024 (2005).</li><li>Piper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+Slit2-induced+collapse+of+Xenopus+retinal+growth+cones.">Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones.</a> Neuron. 49, 215-228 (2006).</li><li>Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+&#946;-actin+mRNA+localization+and+translation+in+Ca2+-dependent+growth+cone+guidance.">An essential role for &#946;-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance.</a> Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).</li><li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein.">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).</li><li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth.">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506 (2014).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+Is+an+RNA-Binding+Protein,+and+Its+Interactome+Provides+a+Link+to+Neural+Development+and+Microtubule+Assembly.">APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly.</a> Cell. 158, 368-382 (2014).</li><li>Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110, 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li><li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival.">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li><li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+of+SMAD1/5/8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification.">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li><li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+poly(A)+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons.">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li><li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture.">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li><li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons.">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li><li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome.">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079 (2012).</li><li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions.">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li><li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization.">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55 (2014).</li><li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yazıda axonally lokalize Atf4 mRNA&#39;nın tespiti yüksek çözünürlüklü ISH teknolojisinin kullanımını tarif eder. Bu ve daha önce yayınlanmış çalışmalar, bu teknoloji dokular ya da hatta tüm embriyolar 33 antikor bazlı protein tespiti ile uyumlu olduğunu gösterir. Önemli olarak, bu son hipokampal nöronlar 34 dendritleri olan ark mRNA&#39;nın tespiti için kullanılmıştır. Aynı zamanda, dokuya boyama için histolojik boyalar ile kombine edilebilir. Son olarak, birden fazla hedef RNA 28,30,33 birinin eş zamanlı saptanması için uygundur. Bu bulgular yüksek çözünürlüklü RNA ISH teknolojilerinin çok yönlülük örnek ve özgün protokoller küçük değişiklikler bu yöntemin duyarlılığını azaltmak yoktur. Bir tek-molekül çözünürlükte dokularda ilgi mRNA&#39;ların algılamak için Z-yapı probları kullanımını anlatan özgün protokoller mRNA içeren maskesinin için iki adım önermekproteaz sindirimi ve örnek 30,35 kaynar. Burada, proteaz kaynaklı negatif deşifre, septo-hippokampal yolunun (Şekil 2A ve B) kaynaklanan kolinerjik aksonlarda ChAT başarılı bir antikor bazlı algılama nasıl etkilediğini göstermektedir. Böylece, bu adımı dışlamak ve aksonal counterstaining antikorların kullanımı dahil, eğer sadece ısı kaynaklı maskesinin kaldırıldı gerçekleştirmek için karar verdi. (Şekil 2C ve D) gösterildiği gibi, kolinerjik aksonlar, bir anti-ChAT antikoru ile görüntülendi ve Atf4 mRNA granüller proteaz sindirimi kaçınarak tespit edildi edilebilir. Atf4 mRNA pozitif algılama negatif prob elde edilen eşiğe dayalı olduğunu unutmayın. İlave kontrol RNases beyin örnekleri tedavisi ve özgüllük test etmek amacıyla, fare Atf4 problar ile problama ile bu noktada dahil edilebilir. Bu adım, ancak burada beri tartışılan prosedürlere dahil değildirBu aynı teknolojiyi, fare hipokampus 18 siRNA enjeksiyonu takiben aksonlarında Atf4 mRNA tam tükenmesi kullanarak önceki delil göstermek. Bu sonuçlar, burada kullanılan ISH araştırmaları özgüllük göstermektedir. Negatif problar dışındaki denetimlerin kullanımı, özellikle bilimsel sorulara dayalı değerlendirilmelidir. Son olarak, ısıyla bağlı alma ile ikame edilmiş ya da akson counterstaining için kullanılan antikor gereksinimlerine bağlı olarak, proteaz ile indüklenen maskesinin düşürülmesi ile kombine edilebilir. bir ya da daha başka bir işlem ya da her ikisinin kombinasyonu kullanılarak seçimi ampirik olarak kullanıcı tarafından belirlenmelidir. İnsan beyin örneklerindeki protease- ve ısı kaynaklı maskesinin kaldırıldı yaparken, histolojik boyalar antikor bazlı aksonal counterstaining yerini alabilir. Burada takip orijinal protokole 30 counterstaining doku için hematoksilin kullanımını önermektedir, ancak, bu tür boya akson boyama için uygun değildir. Bu nedenle, luxol fast, mavi miyelinli aksonlar leke için kullanılmış ve kresil violet nöronal hücre gövdeleri görselleştirmek için kullanılmıştır. Farklılaşma optimize eğer Kluever ve Barrera 31 tarafından geliştirilen LFB, bu en az 2 saat içinde tamamlanabilir çünkü diğer lekeleri üzerinde seçildi ve (Şekil 3C-F) açık mavi leke olarak koyu görünür mRNA granüller engel değildir kahverengi-siyah noktalar. 90 dakika - (Şekil 3) gösterildiği gibi 60 60 o C&#39;de örnekleri kuluçka sırasında optimum LFB counterstaining yapılabilir. Ancak farklılaşma dikkatle izlenebilir ve mRNA granülleri her zaman görünür böylece kuluçka adım adım gerçekleştirildiğini tavsiye edilir. Bu raporda seçilen DAB-tabanlı kromojenik reaksiyon ile uyumlu olmayabilir 36 boyama Bielchowsky ya da Bodian gümüş boyama verimi gri-siyah akson gibi diğer histolojik teknikler. Büyük olasılıkla, bu boyama teknikleri RNA CISH tahlilleri ile kombine edilmelidirböyle hızlı kırmızı veya HRP 30 yeşil gibi alternatif boyaların kullanılmasını sağlar. RNA, ISH testlerinin ve aksonal lekelerin uygun kombinasyonu seçmek ampirik kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Proteaz sindirim yapılırsa bu raporda açıklanan ilk prosedürün bir sınırlama immünohistokimyasal olarak başarısız bir protein tespit edilmesidir. Bu sınırlama, proteaz ile indüklenen maskesinin kaldırıldı kaçınarak aşılabilir. Isı ile uyarılan maskesinin kaldırıldı performans axonally-lokalize Atf4 özel durumunda kolinerjik akson arka plan seviyelerinin üstünde mRNA granüller tespit etmek için yeterli olmuştur. Ancak bu gerekli olabilir çıkar ve proteaz sindirimi diğer mRNA için durum olmayabilir. Bu durumda, aksonal counterstaining Burada tarif edilen anti-ChAT antikoru dışında antikorlar kullanılarak yapılmalıdır. Protokol bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi Alternatif olarak, antikor bazlı counterstaining histolojik boyalar ile ikame edilebilir. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; liflerin LFB boyama myelinsiz akson görselleştirilmesi için uygun değildir. Böyle Bielchowsky ya da Bodian en gümüş boyama gibi alternatif boyama teknikleri, miyelinli ve miyelinsiz aksonlar hem görselleştirme izin. Her iki yöntem de, mRNA granüller kahverengi-siyah bir puncta göründüğünden DAB CISH ile uyumlu değildir akson gri-siyah boyama ile sonuçlanır. Bununla birlikte, bu 30, yeşil, hızlı kırmızı ya da HRP gibi bir aydınlık mikroskop altında ilgi mRNA tespiti için uygun diğer boyalar bulunmaktadır. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, her iki prosedürlerin kritik adımlardan biri ısı kaynaklı unmasking olduğunu. Kaynayan bir mikrodalga fırında gerçekleştirilir, cihazın özelliklerine bağlı olarak çözelti, buharlaşma şansı vardır. Çözelti buharlaşmasını önlemek için 1.2.3 ve 2.2.4 belirtilen adımları izleyin. Maskesinin düşürülmesi sabit dondurulmuş doku 10 dk yeterli olacaktır için, parafin oysa gömülü15 dakika kaynatılarak dokular tavsiye edilir. Numuneleri tavsiye süre boyunca sürekli kaynatın yoksa bu kısmi maskesinin düşürülmesi neden olabilir. Ancak böyle bir pirinç ocak ya da sıcak plaka olarak diğer cihazlar yerine mikrodalga seçilirse kez biraz farklı olabilir. Kaynama süresi yöntemine bağlı olarak, kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Diğer önemli adım LFB counterstaining olduğunu. Bu mavi boya yoğunluğu mRNA granüllerin görselleştirme ile karışmaz önemlidir. Orijinal protokole 31 bazı modifikasyonları sıcaklığı (Şekil 3A) ve inkübasyon süresi (veriler gösterilmemiştir) azaltılması gibi, boyanın yoğunluğunu azaltmak amacıyla yapıldı, ancak açık bir şekilde, insan beyin örneklerindeki miyelinli aksonlar ayırt başarısız . Diğer tarafta, önerilen sıcaklıkta (60 ° C) de LFB çözeltisi içinde örneklerin inkübe edilmesi miyeline aksonların uygun boyama ile sonuçlanmıştır. OAncak counterstaining dikkatle adımlarda 2.2.28-2.2.36 belirtilen LFB ilgi mRNA maske değil emin olmak için her zaman RNA granüllerinin varlığı izleme adım adım gerçekleştirildiğini önerilir. Son olarak, örnekler kurumasına asla. Bu raporda açıklanan yöntemler reaktif buharlaşma şansını artırır 40 o C, birden fazla inkübasyon adımları içermektedir. Protokolleri de belirtildiği gibi, örnekler buharlaşmayı önlemek için, tüm adımlarda parafilm ile kaplanmalıdır. Özetle, yüksek çözünürlüklü RNA ISH ve diğer ISH yöntemlerin geliştirilmesi in vivo yetişkin akson lokalize olanlar da dahil olmak üzere, düşük bol transkript, görselleştirme vermiş olursunuz. Bu da translationally inaktif kabul edildi olarak büyük ölçüde göz ardı edildi erişkin akson uzun yıllar mRNA için yerelleştirme ve çeviri için çünkü özellikle önemlidir. Sonuç olarak, bir roman ve PR sunuyoruzAtf4 saptanması ve memeli beyin, yetişkin aksonların potansiyel olarak bir çok başka mRNA için teknoloji omising. RNAscope mRNA lokalizasyonu gelecek çalışmalara kolaylaştıracak ve in vivo kendi yerel çeviri biyolojik önemini çözmeye yardımcı olacaktır.

Aksonal mRNA istihdam ve yerel çeviri bir zamansal ve mekansal akut bir şekilde 1 ekstrasellüler uyaranlara yanıt vermek için aksonları etkinleştirin. Intra-aksonal protein sentezi en iyi akson 9-11 pathfinding ve retrograd 12,13 sinyalizasyon, büyüme konisi davranış 2-8 yılında çok önemli roller oynamaktadır nörogelişimsel bağlamında anlaşılmaktadır. Aksonal mRNA ve ribozom seviyeleri büyük ölçüde 14,15 azalır Ama çok daha az post-gelişimsel nöronlar akson protein sentezi fonksiyonel önemi hakkında bilinmektedir. Olgun omurgalı aksonlar uzunluğunda 16 translationally inaktif olduğu düşünülmektedir. Ancak son çalışmalar, yerel çeviri patolojik koşullarda olgun aksonların içinde yeniden olduğunu göstermektedir. Örneğin, mRNA bir alt sinir yaralanması ve intra-aksonal protein sentezi, bu aksonlar 17 doğru rejenerasyonu için gerekli olan aşağıdaki yenileyici aksonlar için işe. Ayrıca, bizim grup haS, Alzheimer hastalığı peptid Aβ 1-42 ve transkripsiyon faktör ATF4 lokal çeviri yerel nöronal soma 18 aksonlardan Aβ 1-42 nörodejeneratif etkileri yaymak için gereklidir sonra spesifik mRNA&#39;lar aksonlar için işe olduğunu göstermiştir. Son olarak, yüksek verimlilik analizleri olgun aksonlar özellikle patolojik koşullarda, 18-21 beklenenden daha karmaşık ve dinamik bir transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu çalışmalar ışığında, son derece hassas ve özel yöntem, yetişkin sinir sisteminde lokalize axonally mRNA&#39;lar tabi tespit etmek. MRNA işe ve olgun akson yerel çeviriye çalışmaların çoğu kültürlü nöronlar üzerinde yapılmıştır. Özel kültür yöntemleri somato-dendritik bölmesi 18-20 den akson izolasyonu izin vermesini var çünkü transcriptome analizleri için bu özellikle doğrudur. Bu tür çalışmalar, değerli ins verilmiş olmasına rağmenolgun akson yerel çeviri rolüne ight, soru kültürlü nöronlar sadakatle vivo durumu temsil veya mRNA işe kültürleme koşullara aksonların bir uyum cevabı ise hala açık olup olmadığını. Az sayıda çalışma in vivo aksonlar olgun mRNA işe kanıtlar sağlamıştır. Örneğin, koku markör proteini kodlayan transkript yetişkin duyu nöronları 22 akson tespit edildi. Β-aktin mRNA &#39;nın 3&#39; UTR içeren bir transgen farelerinde periferal ve merkezi sinir sistemi nöronlarının akson taşınır ve yerel olarak gelişim dönemlerde 23 sonra çevrilmiştir. Xenopues Kurbağa yavrularını laevis de Lamin b2 mRNA retina aksonlar lokalize ve tükenme aksonal gelişimi 21 sonra akson bakım etkiler. Sitokrom C oksidaz IV mRNA kodlama aksonal taşıma Müdahale fare davranışını 24 değiştirir. Son olarak, Atf4 mRNA yetişkin a bulunanAβ 1-42 bağlamında fare ve insan beyin Xons nörodejenerasyonu 18 indüklenen. Yüksek üretim transcriptome analizleri, in vitro olarak izole akson mRNA profillerini belirlemek ancak aksonlar izolasyon bulunabilir, ancak nöronal hücre gövdeleri, gliyal hücreleri ve diğer hücre tipleri ile iç içe hiçbir zaman bütün dokularda yana in vivo çalışmalar için sınırlamalar olması yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu durumda, bu analizler, mRNA bir hücre içi lokalizasyonu teyit görüntüleme teknikleri ile kombine edilmelidir. In situ hibridizasyon (ISH RNA) RNA hücre ve dokularda spesifik RNA dizilerinin algılama ve görselleştirme sağlar. Ancak, orijinal RNA, ISH testlerinin nadiren axonally lokalize mRNA için durum oldukça zengin RNA&#39;ların 25 tanımlanması için uygun idi. Çabaları artan son yıllarda için tek-molekül düzeyinde mRNA algılanmasına izin gelişen yeni teknolojiler konulmuştur <sup&gt; 25,26. Örneğin, Singer ve arkadaşları içinde oluşan tek hücrelerde mRNA algılamak için ISH sondalar geliştirdik 5 örtüşmeyen floresan (ayrıntılar 27&#39;ye bakınız için) 50-mers etiketli. Yukarıda belirtilen teknikler ve burada açıklanan bir arasındaki temel fark, daha sonra 20 çift Z-yapı (lineer değil), tipik olarak, faiz sağlanması özgüllük ve düşük arka plan seviyelerinin RNA ~ 1 kb bölgesini hedef sondalar kullanmasıdır. Sondalar daha sonra son olarak, flüoresan olarak etiketlenir veya kromojenik tepkileri izin enzimler ile konjuge edilmiş ön yükselteç ve amplifikatör sekansları ile hibridize edilir. Bu amplifikasyon adımları diğer ISH teknolojileri 28 ile karşılaştırıldığında sinyali-gürültü oranını iyileştirir. Burada floresans immunositokimya ile veya aksonal counterstaining sağlayan histolojik boyalarla, ya Birleştirilen RNAscope kullanılarak iki protokol açıklar. Her iki protokol erişkin mo Atf4 mRNA aksonal lokalizasyonu görselleştirmek için uygundurkullanımı ve insan beyni.

<table><tbody><tr><td>custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse &lt;i&gt;Atf4&lt;/i&gt; mRNA (NM_009716)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>-</td><td>probe</td></tr><tr><td>custom probe targeting residues 15-1,256 of the human &lt;i&gt;ATF4&lt;/i&gt; mRNA (NM_001675.2)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>-</td><td>probe</td></tr><tr><td>negative control probe-DapB</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310043</td><td>probe</td></tr><tr><td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312471</td><td>probe</td></tr><tr><td>positive control probe-human PPIB (optional)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>313901</td><td>probe</td></tr><tr><td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320850</td><td>&lt;i&gt;in situ&lt;/i&gt; hybridization kit</td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>&lt;i&gt;in situ&lt;/i&gt; hybridization kit</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold mounting&amp;nbsp; medium with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX mounting medium</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

mRNA&#39;ları sıkça omurgalı akson lokalize ve yerel çeviri akson yol bulma veya geliştirme sırasında ve postdevelopmental dönemlerde bakım, onarım veya nörodejenerasyonun için dallanma için gereklidir. Yüksek verim analizleri son zamanlarda aksonlar önce beklenenden daha dinamik ve karmaşık transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu analiz, bununla birlikte daha çok aksonlar somato-dendritik bölmeleri izole edilebilir kültürlenmiş nöronlar yapılmıştır. Bu, in vivo olarak, tüm dokularda bu tür izolasyon elde etmek hemen hemen imkansızdır. Bu durumda, bir bütün hayvan mRNA ve bunların fonksiyonel alaka işe doğrulamak amacıyla, transcriptome analizleri ideal yerinde mRNA görülmesini sağlayacak teknikleri ile kombine edilmelidir. Son zamanlarda, bir tek-molekül düzeyinde RNA&#39;lar tespit roman ISH teknolojileri geliştirilmiştir. MRNA&#39;nın hücre içi lokalizasyonu analiz edilirken bu özellikle önemlidirBeri lokalize RNA&#39;lar genellikle düşük seviyelerde bulunur. Burada yeni bir derece hassas bir RNA ISH teknolojisini kullanarak axonally-lokalize mRNA&#39;ların tespiti için iki protokol açıklar. Biz olgun fare ve insan beyinlerinde in vivo akson için Atf4 mRNA işe doğrulamak için floresan immunhistokimya veya histolojik boyalar kullanarak aksonal counterstain ile RNAscope ISH birleştirdik.

Yukarıda tarif edilen prosedürlere kısa bir özeti Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Atf4 mRNA optimal deteksiyon ısıya bağlı maskesinin kaldırıldı kullanılarak kolinerjik aksonlarda granülleri MRNA aksonal lokalizasyonu değerlendirirken, bu aksonlar tespit edebilmek ve düşük bol RNA&#39;lar görselleştirmek mümkün önemlidir. Burada tarif edilen RNA, ISH teknolojisi, tek moleküllü çözünürlükte RNA&#39;lar belirlenmesini sağlar. Bu teknolojiyi kullanarak standart protokoller verimli hedef RNA&#39;lar algılamak için iki unmasking prosedürlerin kombinasyonunu öneririm: proteaz kaynaklı ve unmasking 28 ısı kaynaklı. ISH aksonlar tespit etmek immünohistokimya ile birleştirilir, ancak, proteaz kaynaklı olduğunu ortaya çıkarması uygun bir antijen algılama 29 neden olabilir. Kullanılan antikor c tanımak için başarısız çünkü burada tarif edilen birinci protokol, proteaz sindirimi, kaçınılmasıPozitif mRNA granüller tespit edilmiştir, ancak, tipik olarak septohippocampal yolunun (Şekil 2A ve B) kaynaklanan dentat girusun aksonların bulunan holine asetiltransferazı (ChAT). Isı-ile indüklenen, 10 mM sitrat tampon maddesi (pH 6) ile alma, diğer taraftan, bir anti-ChAT antikor tarafından tanınan epitopun bütünlüğü sağlanmış ve mRNA etkin ChAT lekeli aksonlar (Şekil 2C ve D) &#39;de tespit edilmiştir hedef almaktadır. Burada sunulan sonuçlar (Şekil 2) mRNA alımları ve yerel çeviri 1-42 oligomerler hipokampus içine Aβ infüzyon tarafından uyarılan erişkin farelerin dentat girus Atf4 varlığını göstermektedir. Önceki kanıtlar Atf4 mRNA bazal koşullar 18 altında in vitro veya in vivo olarak akson tespit edilmez ve bu nedenle bu tür bir deney paradigma gösterilmemiştir olduğunu göstermektedir. ATF4 optimal deteksiyonHer iki ısı kaynaklı ve proteaz kaynaklı maskesinin kaldırıldı kullanarak aksonlar mRNA granüller Proteaz ön arıtma gerekiyorsa yararlı olmayabilir deşifre kaynaklı ısı yaparken antikor bazlı protein algılama RNA ISH teknolojisi ile uyumlu olduğunu göstermektedir yukarıda açıklanan sonuçlara Oysa. Bölüm 2 tipik beyin numuneleri 31,32 kullanılan histolojik lekeleri ile birlikte daha önce yayınlanmış prosedürleri 28,30 aşağıdaki aksonlar içinde ATF4 mRNA tespiti açıklar. Bu prosedürde kritik bir adım CISH tarafından boyanan akson mRNA granüllerinin varlığı maskeleme olmadan luxol hızlı mavi (LFB) kullanılarak miyelinli liflerin optimum counterstain olduğunu. Bu amaç için kullanılan reaktifler LFB 90 dakika 60 inkübasyon süreleri aşağıdaki uygun counterstain sağlar. Counterstain hem sıcaklık ve inkübasyon süreleri azaltılır başarısız olabilir (Şekil 3A ve ek ve veri gösterilmemiştir)mRNA granüller hala görünür olacak, ancak nd, onların aksonal lokalizasyon doğrulanmadı olamaz. Diğer taraftan pozitif granüllerin varlığının izlenmesi olmadan 60 dakika ya da 60 ° C&#39;de daha uzun bir süre, beyin için örneklerin inkübe edilmesi periyodik boyası ile ilgili mRNA&#39;nın (Şekil 3B ve ek), geri dönüşü olmayan bir maskeleme neden olabilir. Bu nedenle örnekler 30 dakika boyunca LFB inkübe edilir ve daha inkübasyon aksonlar ve RNA granüller (Şekil 3D-F) her ikisinin de, bir optimal lekelenme elde etmek için örneklerin her 10-20 dakikada bir kontrol kademeli gerçekleştirilir önerilir. Atf4 pozitif granüller açıkça tespit edilebilir bu yönergelere takiben hem kontrol (Şekil 3D) ve Alzheimer hastalığı (Şekil 3F) beyin örneklerindeki. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52799/52799fig1.jpg" /> Şekil 1. özet iş akışıRNA ISH aksonal counterstain ardından evi. siyah tasvir Adımlar örneklenen iki prosedürlere ortaktır. Mavi vurgulanan Adımlar kırmızı vurgulanan bu kromogenik ISH tarafından boyandı formalin ile fikse parafine gömülü örnekleri özgü iken floresan ISH tarafından boyandı paraformaldehid sabit numunelerin özgüdür. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52799/52799fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52799/52799fig2.jpg" /> Atf4 mRNA için Şekil 2. FISH Yetişkin farelerin dentat girus kolinerjik aksonlar lokalize. FISH kolin asetiltransferaz antikor tespiti (ChAT) takiben proteaz kaynaklı (l EFT panel) ya da ısı-kaynaklı (sağ panel) maskesinin kaldırıldı kullanılarak gerçekleştirilmiştir . antibody proteaz tedavisi uygulandı zaman ChAT tanımak için başarısız oldu. Olmayan bir hedefleme prob (dapB) ve mikroskop ayarları ve görüntü ayarlamaları aynı kullanarak Atf4 -targeting prob ile elde edilen sonuçların örnekleri gösterilmiştir. Belirsiz aksonal lokalizasyonu ile Atf4 pozitif granüller soru işaretleri ile gösterilir lokalize granüller &quot;olarak işaretlenmiş ise tamam &quot;. Ölçek çubuğu 20 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52799/52799fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52799/52799fig3.jpg" /> ATF4 mRNA için Şekil 3. CISH insan hipokampus oluşumuna miyeline aksonlar lokalize. ISH sonra, aksonlar luksol hızlı mavi (LFB) ile zıt ve nöronal somata kresil moru ile ters. Sıcaklık hem (A ve gömme 4 saat 40 o C&#39;de LFB ile boyandı örnekleri temsil etmektedir.) Eğer bırakıyorsa LFB boyama ve inkübasyon süresi (gösterilmemiştir) azalmış, ya da neden olabilir counterstain kısa inkübasyon süreleri (B ve içerlek sonra kontrol edilmez zaman ). Olmayan bir hedefleme prob (dapB) ya da ATF4 -targeting probu kullanılarak ISH ile birlikte uygun LFB boyama örnekleri arasında (CF ve girintisiyle) gösterilmektedir. Lokalize granüller &quot;ok&quot; olarak işaretlenmiş ise görüntü elde etme otomatik belirsiz aksonal lokalizasyonu ile en iyi sinyal-gürültü oranı. ATF4 pozitif granüller için ayarlandı soru işaretleri ile gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mikron, 10 mikron takmalar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52799/52799fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization at JoVE.com

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K Görüntüleme.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Video: Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Nörobilim

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Genetik

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Çabuk<em&gt; In Situ</emSerotonin Sendromu ile Ratlarda Paraformaldehyde-öneki Beyin oligonükleotid Problar kullanarak&gt; Melezleme

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Biyoloji

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

Radyoaktif In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Probe Hybridization and Signal Amplification in RNA In Situ Hybridization: A Technique for Detecting Specific RNA Sequences in Tissue Sections

Source: Outh-Gauer, S. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/59422" target="_blank">Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video describes a sequential hybridization strategy that involves hybridizing mRNA probes to specific target mRNA. Following probe hybridization, signal amplification is performed to enhance resolution via reduction of signal-to-noise ratio during RNA-CISH of histological samples.

RNA In Situ Hibridizasyonda Prob Hibridizasyonu ve Sinyal Amplifikasyonu: Doku Kesitlerinde Spesifik RNA Dizilerini Tespit Etmek İçin Bir Teknik

Source: Outh-Gauer, S. et al. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (2019)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

Baş ve Boyun Kanseri

Analizler ve teknikler

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

Source: Shokry, I. M., et al. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin ...

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53976/combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling'>Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).</a>This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal amplification to enhance sensitivity. The resulting fluorescence enables co-localization analysis of the target RNAs within the tissue.

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse ...

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA'larının Algılama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler