This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

<ol>
	<li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly,+maintenance+and+repair.">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li><li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation.">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li><li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+RhoA+regulates+growth+cone+collapse.">Local translation of RhoA regulates growth cone collapse.</a> Nature. 436, 1020-1024 (2005).</li><li>Piper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+Slit2-induced+collapse+of+Xenopus+retinal+growth+cones.">Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones.</a> Neuron. 49, 215-228 (2006).</li><li>Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+&#946;-actin+mRNA+localization+and+translation+in+Ca2+-dependent+growth+cone+guidance.">An essential role for &#946;-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance.</a> Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).</li><li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein.">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).</li><li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth.">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506 (2014).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+Is+an+RNA-Binding+Protein,+and+Its+Interactome+Provides+a+Link+to+Neural+Development+and+Microtubule+Assembly.">APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly.</a> Cell. 158, 368-382 (2014).</li><li>Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110, 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li><li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival.">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li><li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+of+SMAD1/5/8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification.">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li><li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+poly(A)+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons.">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li><li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture.">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li><li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons.">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li><li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome.">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079 (2012).</li><li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions.">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li><li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization.">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55 (2014).</li><li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בדוח זה אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית ISH ברזולוציה גבוהה בזיהוי של mRNA Atf4 המקומי axonally. מחקרים שפורסמו אלה וקודמים הראו כי טכנולוגיה זו היא תואמת עם זיהוי חלבון מבוסס נוגדנים ברקמות או אפילו עובר כל 33. חשוב לציין, זה כבר היה בשימוש לאחרונה לגילוי Arc mRNA בתוך הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס 34. זה גם יכול להיות בשילוב עם צבעים היסטולוגית לצביעת רקמות. לבסוף, הוא מתאים לזיהוי בו זמני של מספר יעד RNAs 28,30,33. ממצאים אלו ממחישים את הרבגוניות של טכנולוגיות RNA ISH ברזולוציה גבוהה, ושינויים קלים בפרוטוקולים המקוריים לא להקטין את הרגישות של שיטה זו. פרוטוקולים מקוריים המתארים את השימוש בבדיקות Z-מבנה כדי לזהות mRNAs של עניין ברקמות ברזולוציה מולקולה בודדת מציעים שני צעדים להסרת מסווה מעל mRNA מעורבעיכול פרוטאז ומדגם רותח 30,35. כאן אנו מראים כיצד הסרת מסווה מעל לרעה מושרה פרוטאז משפיע על זיהוי מבוסס נוגדנים המוצלחים של צ&#39;אט באקסונים כולינרגית הנובעים ממסלול septo-היפוקמפוס (איור 2 א &#39;וב&#39;). לפיכך, החלטנו שלא לכלול את הצעד הזה ולבצע הסרת מסכות מושרה חום רק אם counterstaining axonal כללו השימוש בנוגדנים. כפי שניתן לראות (איור 2C ו- D), האקסונים כולינרגית יכולים להיות דמיינו עם נוגדן אנטי-צ&#39;אט וגרגרי Atf4 mRNA היו להבחין הימנעות עיכול פרוטאז. שים לב שזיהוי החיובי של Atf4 mRNA מבוסס על הקרינה הרקע המתקבלת מהבדיקה השלילית. שליטה נוספת ניתן לכלול בשלב על ידי טיפול דגימות מוח עם RNases וחיטוטם עם בדיקות העכבר Atf4 כדי לבדוק הסגוליות שלהם זה. צעד זה אך לא נכלל בהליכים שנדונו כאן מאזמופע קודם ראיות, באמצעות זה אותה טכנולוגיה, דלדול מוחלט של Atf4 mRNA באקסונים הבאים הזרקת siRNA בהיפוקמפוס העכבר 18. תוצאות כאלה להפגין את הספציפיות של בדיקות ISH משמשות כאן. השימוש בפקדים, למעט הבדיקות השליליות יש להעריך על סמך שאלות מדעיות מסוימות. לבסוף, אחזור מושרה חום עלול להיות תחליף ידי או בשילוב עם הסרת מסכות מושרה פרוטאז בהתאם לדרישות של הנוגדן המשמש לcounterstaining האקסון. הבחירה של שימוש באחד או הליך אחר או שילוב של שניהם צריכה להיקבע באופן אמפירי על ידי המשתמש. בעת ביצוע protease- והסרת מסכות מושרה חום בדגימות מוח אנושיים, צבעים היסטולוגית יכולים להחליף counterstaining axonal מבוסס נוגדנים. אף על פי הפרוטוקול המקורי כאן אחרי מרמז על השימוש בhematoxylin לרקמה counterstaining 30, צבע כזה אינו מתאים לצביעת האקסון. לפיכך, luxol FASלא כחול שימש להכתים האקסונים myelinated וסגול cresyl שימש לדמיין גופי תא עצביים. LFB, שפותח על ידי Kluever ו -31 Barrera, נבחר על כתמים אחרים, כי זה יכול להסתיים בפחות משעה 2 ואם ההבחנה היא מותאמת (איור 3 ג-ו) את הכתם הכחול האור לא מפריע גרגרי mRNA המופיעים כהה כ נקודות חומות-שחורות. כפי שניתן לראות (איור 3), counterstaining LFB האופטימלי יכול להיות מושלם כאשר דוגרים דגימות בC o 60 ל60-90 דקות. עם זאת מומלצת שהדגירה מתבצעת בשלבים, כך שבידול יכול להיות במעקב צמוד וגרגרי mRNA הם תמיד נראים לעין. טכניקות היסטולוגית אחרות כגון האקסון של של Bielchowsky או Bodian תשואת צביעת כסף אפור-שחור מכתים 36 שייתכן שאינו תואם עם תגובת chromogenic מבוסס DAB בחרה בדוח זה. טכניקות צביעה סבירה, כזה צריך להיות משולבים עם מבחני RNA CISH<html> המאפשר את השימוש בצבעים חלופיים כגון אדום או ירוק HRP 30 מהירים. בחירת השילוב המתאים של מבחני ISH RNA וכתמי axonal צריך להיקבע באופן אמפירי על ידי משתמש. מגבלה אחת של ההליך הראשון המתואר בדוח זה היא גילוי החלבון לא מוצלח על ידי אימונוהיסטוכימיה אם עיכול פרוטאז מתבצע. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי הימנעות הסרת מסכות מושרה פרוטאז. במקרה המסוים של Atf4 axonally-מקומי ביצוע הסרת מסכות מושרה חום היה מספיק כדי לזהות גרגירי mRNA מעל רמות רקע באקסונים כולינרגית. אולם זה לא יכול להיות המקרה לmRNAs האחר של עניין ועיכול פרוטאז ייתכן שיידרש. אם כן, counterstaining axonal צריך להתבצע באמצעות נוגדנים אחרים מאשר הנוגדן אנטי-הצ&#39;אט כאן תאר. לחלופין, counterstaining מבוסס נוגדנים עשוי להחליף בצבעים היסטולוגית כפי שתואר בסעיף 2 לפרוטוקול. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; צביעת LFB של סיבים אינה מתאים להדמיה של האקסונים unmyelinated. טכניקות צביעה אלטרנטיביות, כגון Bielchowsky של או צביעת הכסף של Bodian, מאפשרות ההדמיה של שני האקסונים myelinated וunmyelinated. שני השיטות לגרום להכתמה אפורה-שחורה של אקסונים שאינה תואם לCISH DAB מאז גרגרי mRNA מופיעים puncta החום-שחור כ. עם זאת, יש צבעים אחרים זמינים עבור זיהוי של mRNAs של עניין תחת מיקרוסקופ brightfield, כגון אדום מהיר או HRP ירוק 30. כאמור בסעיף הפרוטוקול, אחד השלבים הקריטיים של שני ההליכים הוא הסרת המסכות מושרה חום. אם רותח מתבצע במיקרוגל, יש סיכוי של אידוי פתרון בהתאם למאפיינים של המכשיר. בצע את השלבים המפורטים ב1.2.3 ו2.2.4 כדי למנוע אידוי פתרון. לקפוא רקמת 10 דקות קבועות של הסרת מסכות צריכה להספיק, ואילו עבור פרפין מוטבערקמות רותחים במשך 15 דקות מומלצת. אם דגימות לא להרתיח ברציפות במשך הזמן המומלץ זה עלול לגרום להסרת מסכות חלקיות. עם זאת פעמים מעט יכולות להשתנות אם התקנים אחרים, כגון סיר אורז או צלחת חמה נבחרים במקום מיקרוגל. משך רותח צריך להיקבע על ידי משתמש, בהתאם לשיטה. עוד צעד קריטי הוא counterstaining LFB. חשובה שעוצמת הצבע הכחול לא מפריעה להדמיה של גרגרי mRNA. שינויים מסוימים לפרוטוקול המקורי 31 בוצעו על מנת להפחית את עוצמת הצבע, כגון הפחתת הטמפרטורה (איור 3 א) או זמן הדגירה (מידע לא מוצג), עם זאת, אנו לא הבחנו בבירור האקסונים myelinated בדגימות מוח אנושיים . מצד השני, דוגרים הדגימות בפתרון LFB בטמפרטורה הציעה (60 המעלות צלסיוס) הביא צביעה אופטימלית של אקסונים myelinated. זהעם זאת המליץ ​​counterstaining מתבצע בשלבים ניטור בזהירות את הנוכחות של גרגרי RNA בכל העת על מנת להבטיח שLFB לא להסוות את ה- mRNA של עניין כמפורט בצעדים 2.2.28-2.2.36. לבסוף, דגימות לא צריכים להתייבש. השיטות שתוארו בדוח זה כרוך צעדי דגירה מרובים ב 40 o C, אשר מגדיל את הסיכויים של אידוי מגיב. כאמור בפרוטוקולים, דגימות צריכים להיות מכוסות בparafilm בכל הצעדים כדי למנוע אידוי. לסיכום, הפיתוח של רזולוציה גבוהה RNA ISH ושיטות ISH אחרים המאפשר הדמיה של תמלילים נמוכים בשפע, כוללים אלה מקומיים לאקסונים מבוגרים in vivo. זה חשוב במיוחד מאז ללוקליזציה שנים רבות mRNA ולתרגום באקסונים מבוגרים מאוד היה להתעלם כפי שהם נחשבו translationally לא פעיל. לסיכום אנו מציגים רומן ויחסי ציבורomising טכנולוגיה לזיהוי של Atf4 ופוטנציאל רב mRNAs האחר באקסונים מבוגרים של המוח היונקים. RNAscope יקל מחקרים עתידיים על לוקליזציה mRNA ויעזור לפענח את המשמעות הביולוגית של התרגום המקומי שלהם in vivo.

גיוס mRNA axonal ותרגום מקומי לאפשר האקסונים להגיב לגירויים תאיים באופן 1 באופן זמני ומרחבית חריפה. סינתזת חלבון תוך-axonal היא הדרך הטובה ביותר להבין בהקשר של התפתחות המוח שבו משחק תפקידים מכריעים בצמיחה חרוט התנהגות 2-8, האקסון מפלס-הדרך 9-11 ומדרדר איתות 12,13. אבל הרבה פחות ידוע על המשמעות התפקודית של סינתזת חלבון axonal בתאי עצב פוסט-התפתחותית כאשר רמות ה- mRNA והריבוזום axonal מופחתות 14,15 מאוד. האקסונים חוליות בוגרים כבר מזמן חשבו להיות translationally פעיל 16. עם זאת, המחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתרגום מקומי מחדש באקסונים בוגרים תחת מצבים פתולוגיים. לדוגמא, קבוצת משנה של mRNAs מגויס לאקסונים התחדשות הבאה פגיעה עצבית וסינתזה של חלבונים תוך-axonal נדרשים להתחדשות הנכונה של אקסונים אלה 17. בנוסף, חה הקבוצה שלנוים הוכיח כי mRNAs הספציפי מגויסים לאקסונים לאחר חשיפה מקומית לפפטיד מחלת אלצהיימר Aβ 1-42, ותרגום המקומי של ATF4 גורם השעתוק נדרשת כדי להפיץ את השפעות ניווניות של Aβ 1-42 מן האקסונים לסומה העצבית 18. לבסוף, ניתוחי תפוקה גבוהים גילו כי יש לי האקסונים בוגרים transcriptome יותר מורכבת ודינמית מהצפוי 18-21, במיוחד בתנאים פתולוגיים. לאור המחקרים הללו, שיטה רגישה וספציפית מאוד כדי לזהות mRNAs axonally מקומי במערכת העצבים הבוגרת יש צורך. חלק גדול מהעבודה על גיוס mRNA ותרגום מקומי באקסונים בוגרים שבוצע על נוירונים בתרבית. זה נכון במיוחד עבור transcriptome ניתוחים מאז שיטות culturing מיוחדות קיימות המאפשרות הבידוד של אקסונים מהתא הדנדריטי somato-18-20. למרות שמחקרים כאלה ניתנו תוספות יקרותight לתוך התפקיד של תרגום המקומי באקסונים בוגרים, השאלה אם נוירונים בתרבית מייצגים נאמנה את המצב בvivo או אם גיוס mRNA הוא תגובה אדפטיבית של אקסונים לתנאי culturing עדיין פתוח. מחקרים מעטים סיפקו ראיות לגיוס mRNA להבשיל האקסונים in vivo. לדוגמא, תמליל קידוד לחלבון סמן חוש הריח זוהה באקסונים בתאי עצב תחושתיים מבוגרים 22. Transgene המכיל &#39;UTR 3 של mRNA β-אקטין מועבר לאקסונים בתאי עצב במערכת עצבים היקפיים ומרכזיים בעכברים ומתורגם באופן מקומי לאחר תקופות התפתחותיות 23. B2 Lamin mRNA הוא מקומי לאקסונים רשתית בXenopues laevis ראשנים ודלדולה משפיע תחזוקת האקסון לאחר פיתוח axonal 21. הפרעה לתחבורה axonal של קידוד mRNA לIV מונואמין ציטוכרום C משנה עכבר התנהגות 24. לבסוף, Atf4 mRNA נמצא במבוגריםxons של עכברים ומוח אנושי בהקשר של Aβ 1-42 -induced ניוון מוחיים 18. ניתוחי transcriptome תפוקה גבוהה הוכיחו להיות שימושי כדי לזהות פרופילי mRNA באקסונים מבודדים במבחנה אבל יש מגבלות במחקרי vivo מאז בכל רקמות האקסונים לא נמצאים בבידוד, אבל התערבבו עם גופים עצביים תא, תאי גלייה וסוגי תאים אחרים. לפיכך, ניתוח כזה צריך להיות משולב עם טכניקות הדמיה שלאשר את לוקליזציה subcellular של mRNAs. RNA הכלאה באתר (RNA ISH) מאפשר זיהוי והדמיה של רצפי RNA ספציפיים בתאים וברקמות. עם זאת, מבחני RNA ISH המקוריים היו מתאימים רק לזיהוי RNAs הנרחב ביותר 25, שהוא לעתים רחוקות במקרה של mRNAs המקומי axonally. לעשורים האחרונים גוברים מאמצים כבר הכניס לתוך טכנולוגיות חדישות פיתוח המאפשרות זיהוי של mRNAs ברמת המולקולה בודדת <sup&gt; 25,26. לדוגמא, זינגר ועמיתיו פיתחו בדיקות ISH לזהות mRNAs בתאים בודדים, הכוללים 5 שאינם חופף שכותרתו fluorescently 50 מרס (לפרטים עיינו 27). ההבדל העיקרי בין השיטות שהוזכרו לעיל ואחד כאן תאר הוא שמאוחר יותר משתמש 20 Z-מבנה כפול (לא ליניארי) בדיקות, כי בדרך כלל היעד ~ אזור KB 1 של ה- RNA של הספציפיות הבטחת ריבית ורמות רקע נמוכות. אז בדיקות הם הכלאה עם רצפי מגבר קדם מגבר שסופו של דבר כותרת או מצומדות עם אנזימים המאפשרים תגובות chromogenic fluorescently. צעדי הגברה אלה משפרים את יחס אות לרעש בהשוואה לטכנולוגיות אחרות ISH 28. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים באמצעות RNAscope בשילוב גם עם immunocytochemistry הקרינה או עם צבעים היסטולוגית מאפשרים counterstaining axonal. שני הפרוטוקולים מתאימים לדמיין לוקליזציה axonal של Atf4 mRNA במו הבוגרלהשתמש ומוח אנושי.

<table><tbody><tr><td>custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse &lt;i&gt;Atf4&lt;/i&gt; mRNA (NM_009716)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>-</td><td>probe</td></tr><tr><td>custom probe targeting residues 15-1,256 of the human &lt;i&gt;ATF4&lt;/i&gt; mRNA (NM_001675.2)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>-</td><td>probe</td></tr><tr><td>negative control probe-DapB</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310043</td><td>probe</td></tr><tr><td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312471</td><td>probe</td></tr><tr><td>positive control probe-human PPIB (optional)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>313901</td><td>probe</td></tr><tr><td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320850</td><td>&lt;i&gt;in situ&lt;/i&gt; hybridization kit</td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>&lt;i&gt;in situ&lt;/i&gt; hybridization kit</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold mounting&amp;nbsp; medium with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX mounting medium</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

mRNAs לעתים קרובות מקומי לאקסונים חוליות והתרגום המקומי שלהם נדרש לpathfinding האקסון או הסתעפות בפיתוח ותחזוקה, תיקון או ניוון של מערכת עצבים בתקופות postdevelopmental. ניתוחי תפוקה גבוהים חשפו לאחרונה כי יש לי האקסונים transcriptome יותר דינמית ומורכבת יותר מהצפוי בעבר. ניתוח אלה, עם זאת כבר נעשה בעיקר בנוירונים בתרבית שבו ניתן לבודד האקסונים מתאי somato-הדנדריטים. זה כמעט בלתי אפשרי להשיג בידוד כזה ברקמות שלמות in vivo. לפיכך, על מנת לאמת את הגיוס של mRNAs ורלוונטי הפונקציונלי שלהם בכל בעלי חיים, צריכים להיות משולבים באופן אידיאלי ניתוחי transcriptome עם טכניקות המאפשרות ההדמיה של mRNAs באתר. לאחרונה, טכנולוגיות ISH רומן המזהות RNAs ברמת מולקולה בודדת פותחו. זה חשוב במיוחד בעת ניתוח לוקליזציה subcellular של mRNA, RNAs המקומי מאז נמצא בדרך כלל ברמות נמוכות. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים לצורך זיהוי של mRNAs axonally-מקומי באמצעות טכנולוגית RNA ISH רומן רגישה. יש לנו שילוב RNAscope ISH עם counterstain axonal באמצעות אימונוהיסטוכימיה הקרינה או צבעים היסטולוגית כדי לאמת את הגיוס של Atf4 mRNA לאקסונים in vivo בעכבר הבוגר והמוח אנושי.

סיכום קצר של ההליכים שתוארו לעיל מוצג באיור 1. זיהוי אופטימלי של Atf4 mRNA גרגירים באקסונים כולינרגית באמצעות הסרת מסכות מושרה חום כאשר הערכת לוקליזציה axonal של mRNAs, זה הוא קריטי כדי להיות מסוגל לזהות את האקסונים ולהיות מסוגל לדמיין RNAs שפע נמוך. טכנולוגית RNA ISH המתוארת כאן מאפשרת זיהוי של RNAs ברזולוציה מולקולה בודדת. פרוטוקולים סטנדרטיים באמצעות טכנולוגיה זו מציעים שילוב של שני הליכי הסרת מסכות כדי לזהות ביעילות RNAs היעד: והחום מושרה 28 הסרת מסכות מושרה פרוטאז. עם זאת, כאשר אני עורך בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה לזהות האקסונים, הסרת מסכות מושרה פרוטאז אולי לא לגרום לזיהוי אנטיגן האופטימלי 29. בפרוטוקול הראשון המתואר כאן, עיכול פרוטאז נמנע, מאז הנוגדן משמש לא הצליח לזהות גacetyltransferase holine (צ&#39;אט) נמצא בדרך כלל באקסונים של הרכס המשונן הנובע ממסלול septohippocampal (איור 2 א &#39;וב&#39;), אם כי גרגרי mRNA חיוביים אותרו. אחזור עם חיץ 10 מ&quot;מ ציטרט (pH 6) הנגרם על-חום, לעומת זאת, הבטיח את השלמות של epitope מוכר על ידי הנוגדן אנטי-הצ&#39;אט ולמקד mRNA זוהה ביעילות באקסונים מוכתם צ&#39;אט (איור 2C ו- D). התוצאות שהוצגו כאן (איור 2) להראות נוכחות Atf4 ברכס המשונן של עכברים בוגרים שבי mRNA גיוס ותרגום מקומיים הנגרמים על ידי עירוי של Aβ 1-42 oligomers להיפוקמפוס. העדויות קודמות מצביעות על כך שAtf4 mRNA לא זוהה באקסונים במבחנה או בvivo בתנאים בסיסיים 18, ובכך הפרדיגמה כגון ניסיונית אינה מוצגת. זיהוי אופטימלי של ATF4גרגרי mRNA באקסונים בשתי הסרת המסכות מושרה החום ומושרה פרוטאז ואילו התוצאות שתוארו לעיל עולה כי גילוי חלבון נוגדן המבוסס תואם טכנולוגית RNA ISH בעת ביצוע החום מושרה הסרת מסווה מעל זה לא יכול להיות שימושי אם נדרש פרוטאז מראש טיפול. סעיף 2 מתאר זיהוי של ATF4 mRNA בתוך אקסונים הבאים נהלים שפורסמו בעבר 28,30 בשילוב עם כתמים היסטולוגית משמשים בדרך כלל דגימות מוח 31,32. שלב קריטי בהליך זה הוא counterstain האופטימלי של סיבי myelinated באמצעות כחול luxol מהיר (LFB) ללא מיסוך הנוכחות של גרגרי mRNA באקסונים מוכתמים על ידי CISH. חומרים כימיים המשמשים למטרה זו יאפשר counterstain האופטימלי עם LFB הבא פעמים דגירה של 60 עד 90 דקות. Counterstain עלול להיכשל כאשר בשתי הפעמים הטמפרטורה והדגירה הם ירדו (איור 3 א והבלעה, ומידע לא מוצג)ND למרות גרגרי mRNA עדיין יהיו גלויים, לא ניתן לאמת לוקליזציה axonal. מצד השני, דוגרים דגימות מוח למשך 60 דקות או יותר ב 60 מעלות צלסיוס ללא ניטור הנוכחות של גרגרים חיוביים מעת לעת עלול לגרום למיסוך בלתי הפיך של mRNA של ריבית על ידי הצבע (איור 3 והבלעה). הוא כך מומלץ שדגימות מודגרת בLFB למשך 30 דקות ושדגירה נוספת מתבצעת בשלבים בדיקת הדגימות כל 10 עד 20 דקות כדי להשיג צביעה אופטימלית של שני האקסונים וגרגרי RNA (איור 3D-F). בעקבות הנחיות אלה גרגרים חיוביים Atf4 ניתן להבחין בבירור בשתי שליטה (איור 3D) ודגימות מוח מחלה (איור 3F) אלצהיימר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52799/52799fig1.jpg" /> עבודה באיור 1. תמציתישל RNA ISH אחרי counterstain axonal. השלבים מתוארים בשחור משותפים לשני ההליכים שהודגמו. הצעדים מודגשים בכחול ספציפיים לדגימות קבועות paraformaldehyde המוכתם על ידי ISH ניאון ואילו אלה מסומנים באדום הם ספציפיים לדוגמאות מוטבעים פרפין-קבוע פורמלין המוכתם על ידי ISH chromogenic. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52799/52799fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52799/52799fig2.jpg" /> איור 2. דגים לAtf4 mRNA מקומיים לאקסונים כולינרגית ברכס המשונן של עכברים בוגרים. FISH בוצע באמצעות מושרה פרוטאז (L פנל העברה בנקאית) או מושרה בחום (פנל מימין) ואחריו הסרת מסכות זיהוי נוגדן של acetyltransferase כולין (צ&#39;אט) . Antibody לא הצליחה לזהות צ&#39;אט כאשר טיפול פרוטאז בוצע. דוגמאות לתוצאות שהושגו עם בדיקה מיקוד-עישון (dapB) ובדיקת -targeting Atf4 באמצעות הגדרות מיקרוסקופ והתאמות תמונה זהות מוצגות. גרגרי -positive Atf4 עם לוקליזציה axonal ברורה מסומנות בסימני שאלה ואילו גרגרים מקומיים מסומנים כ&quot; בסדר &quot;. 20μm בר סולם. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52799/52799fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52799/52799fig3.jpg" /> איור 3. CISH לATF4 mRNA מקומי לאקסונים myelinated בהיווצרות בהיפוקמפוס האדם. בעקבות איש, האקסונים היו counterstained עם כחול המהיר luxol (LFB) וsomata העצבי counterstained עם סגול cresyl. צביעת LFB לא טובים עלולה לגרום אם שתי הטמפרטורה (והבלעה מייצגות דגימות מוכתמות בLFB ב 40 מעלות צלסיוס במשך 4 שעות.) וזמן דגירה (לא מוצג) הם ירדו, או כאשר counterstain אינו מסומן לאחר תקופות קצרות דגירה (B והבלעה ). דוגמאות לצביעת LFB אופטימלית בשילוב עם ISH באמצעות בדיקה מיקוד-עישון (dapB) או הבדיקה ATF4 -targeting מוצגות (CF וריבועים). רכישת תמונה הותאמה באופן אוטומטי לגרגרי -positive יחס אות לרעש. ATF4 הטובים ביותר עם ​​לוקליזציה axonal ברורה מסומנים בסימני שאלה ואילו גרגרים מקומיים מסומנים כעל &quot;אישור&quot;. בר סולם 50 מיקרומטר, ריבועי 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52799/52799fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization at JoVE.com

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K Views.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Video: Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Genetics

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Probe Hybridization and Signal Amplification in RNA In Situ Hybridization: A Technique for Detecting Specific RNA Sequences in Tissue Sections

Source: Outh-Gauer, S. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/59422" target="_blank">Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video describes a sequential hybridization strategy that involves hybridizing mRNA probes to specific target mRNA. Following probe hybridization, signal amplification is performed to enhance resolution via reduction of signal-to-noise ratio during RNA-CISH of histological samples.

הכלאת בדיקה והגברת אותות בהכלאה של RNA באתרו: טכניקה לאיתור רצפי RNA ספציפיים במקטעי רקמות

Source: Outh-Gauer, S. et al. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (2019)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Head and Neck Cancer

Assays & techniques

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

Source: Shokry, I. M., et al. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin ...

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53976/combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling'>Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).</a>This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal amplification to enhance sensitivity. The resulting fluorescence enables co-localization analysis of the target RNAs within the tissue.

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse ...

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video