Bu eser [Grant-in-Aid 0365274B H.L. için], Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen Ulusal Kanser Enstitüsü [GI SPORE P50CA150964] Z.W. için Ulusal Sağlık Enstitüleri [Office of araştırma altyapı paylaşılan araçları Grant S10RR031845 için Işık mikroskobu] Case Western Reserve Üniversitesi tesisinde görüntüleme ve Çin burs Konseyi'ne [X.G.]. Yazarlar ile slayt tarama ışık mikroskobu Imaging Core için onun yardım etmek içinde Richard Lee teşekkür ederiz.

Tüm fareler ilgili deneyler burada açıklanan Case Western Reserve Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması. Başlık 2016-0068 protokolünün (PI: Hua Lou) "alternatif pre-mRNA'ın porno versiyonunu omurgalı gelişiminde rolü" olduğunu.
Not: Bilgiler, tüm ekipman, reaktifler ve bu protokol için kullanılan malzemeleri Malzemeler tablovardır.
1. Formalin hazırlayın sabit parafin gömülü (FFPE) bölümleri
<ol><li>
1 CD1 fare ve 1 C57BL/6J fare tarafından servikal çıkığı ötenazi. Dikkatle cerrahi makas ve forseps ile kafatası kesmiş. Beyin bir kepçe ile kaldırın. Not: 5 aylık CD1 erkek fare ve 3 aylık C57BL/6J erkek fare kullanılan ve benzer sonuçlar ortaya koydu.<ol>
<li>PBS ile beyin yıkama. Tüm beyin % 10 formalin, oda sıcaklığında (RT) içeren bir çözüm ile 50 mL formalin çözüm tüm beyin koyarak için 30 h düzeltmek.</li>
		<li>Sabitleme çözüm değiştirin PBS'ye ve PBS beyin gecede 4 ° C'de kuluçkaya Kurutmak ve Ksilen ve standart prosedürler18kullanarak parafin ile beyin embed.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir microtome katıştırılmış doku 5 µm bölümler halinde kesmek için kullanın. Parafin kurdele bir RT su banyosunda önce ve sonra şerit i yaymak için bir 45 ° C su banyosunda koyun.
	<ol>
<li>Hemen kırışıklıklar ve kıvrımlar Şerit'teki yok zaman bölümler cam slaytlarda bağlayın. Gecede RT. Bake slaytlar için kullanmadan önce 60 ° C'de 1 h, Kuru slaytlar hava.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. örnek Önarıtma
<ol><li>
Doku bölümleri deparaffinize. Bir duman başlık olarak bu adımları uygulayın.
	<ol>
<li>İki bulaşık (Şekil 1A) 250 mL taze ksilen ve iki ile 250 mL % 100 etanol doldurmak. Doku slaytlar çamaşır raf içinde Tablo 1' de belirtilen sipariş ve kuluçka zaman aşağıdaki bulaşık yıkama raf (Şekil 1A) ve yer ekleyin.</li>
		<li>Her kuluçka sırasında çamaşır raf daha--dan 3 kere yukarı ve aşağı çamaşır bulaşık kaldır. Her kuluçka sonra hızlı bir şekilde doku bölümleri kurumasını önlemek için sonraki çamaşır bulaşık yıkama raf taşıyın.</li>
		<li>Kuluçka adımları tamamladıktan sonra çamaşır bulaşık yıkama raf slaytlar ile kaldırın. Raf 5 min için veya slaytları tamamen kuru olana 60 ° C kuluçka makinesine koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku bölümü hidrofobik bariyer kalemle çevreleyen bir 0,75 '' x 0,75 '' bariyer çizin. Hava kuru 3 dk RT. az için bariyer</li>
	<li>
Dilim pretreat
	<ol>
<li>Reaktifler ve donanımları hazırlamak<ol>
<li>Hibridizasyon fırını (Şekil 1B) ve sıcaklık 40 ° c 30 dk kullanmadan önce ayarlayın.</li>
			<li>Distile su ile tamamen ıslak nemlendirici kağıt (Şekil 1E) ve nem kontrolü tepsi (Şekil 1 d, sol) koydu. Nem kontrol tepsiyi hibridizasyon fırında tutun.</li>
			<li>Taze 1 x hedef alma reaktifler 700 mL 10 x hedef alma reaktifler 70 mL için dH2O 630 mL ekleyerek hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hidrojen peroksit uygulanır.<ol>
<li>Deparaffinized slaytlar bankta koymak. Hidrojen peroksit 5 – 8 damla doku tamamen kapsayacak bir bölümüne ekleyin. 10 dakika dik, kuluçkaya</li>
			<li>Hidrojen peroksit çözümü, bir defada bir slayt kaldırmak için emici kağıt parçası üzerinde slaytlar dokunun. Hemen bir çamaşır askısı slaytı eklemeden ve raf dH2ile O. dolu bir çamaşır bulaşık gitme</li>
			<li>Yukarı ve aşağı distile su içinde raf taşıyarak slaytları yıkama 3 – 5 kez. Distile su ve yıkama slaytlar ile bir kez daha dolu bir çamaşır bulaşık yıkama raf taşıyın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hedef alma gerçekleştirmek<ol>
<li>1000 mL Cam kabı sıcak bir tabağa yerleştirin. Taze 1 x hedef alma reaktifler 700 mL kabı ekleyin ve folyo ile kapatın. Ölçek folyo kapak (Şekil 1 c) aracılığıyla bir termometre yerleştirin. Sıcak plaka üzerinde açın ve 10-15 dk yüksek ayarlayın.</li>
			<li>Alma reaktifler sıcaklığını 98 ° C ulaştığında, sıcak plaka sıcaklık kontrolünü hafif çıban korumak için düşük yüksek geçin. 15 dk daha kaynatın değil.</li>
			<li>Bu arada, dikkatli bir şekilde folyo aç ve çamaşır raf içinde alma regent dilimlerle koy. Kabı tekrar kapak ve 15dk için kuluçkaya.</li>
			<li>DH2O ve durulama 15 için 200 mL ile raf bir çamaşır yemek kabı kaldırmak için kullanım forseps dolu s.</li>
			<li>Raf % 100 taze etanol içeren bir çamaşır bulaşık taşımak ve 3 dk. slaytlar kaldırmak ve onları 10 dk 60 ° C Kuluçka Makinası için oturup bekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Proteaz III uygulamak<ol>
<li>Slaytları leke raf (Şekil 1 d, sağ) yerleştirin. Proteaz doku kapsayacak şekilde III 5 damla ekleyin. Dikkatle raf nem kontrol tepsi (Şekil 1 d, sol) yerleştirebilir ve tepsiyi 40 ° C hibridizasyon fırın içine takabilirsiniz. 30 dk için kuluçkaya.</li>
			<li>Slayt rafa kaldırmak ve tepsiyi fırına koy. Aşırı sıvı, bir defada bir slayt kaldırmak için slaytlar dokunun. Bir çamaşır rafa slaytı eklemeden ve yer çamaşır bulaşık içinde raf raf slaytlar için yukarı ve aşağı yıkamak için dH2ile O. hareket dolu 3 - 5 kez.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH tahlil
<ol><li>
Malzemeleri hazırlamak
	<ol>
<li>50 x 40 ° C kuluçka 20 dk. Mix 2.94 L dH2O ve 50 60 mL x 1 x yıkama tampon yapmak için yıkama arabellek için yıkama arabellek önceden ısıtmak.</li>
		<li>% 50 hematoksilen boyama çözüm Gill'in hematoksilen dH21 N amonyum hidroksit 1,43 mL 250 mL dH2O. karışımı ekleyerek O. Prepare %0.02 (w/v) Amonyaklı su 100 mL için bir kap içinde iyi 100 mL ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>Sonda ve AMP 0-6 koymak reaktifler RT 30 dk kullanmadan önce. Nem kontrol tepsiyi 40 ° C hibridizasyon fırında tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ISH yordamı Not: izoformlarının Uçbirleştirme Nf1 ifade inceleyin ve hesaplamak için exon 23a, exon izoformu 23a dahil, hedef üç farklı ISH problar (PSI) değerindeki spliced yüzde exon 23a hariç izoformu veya her iki izoformlarının kullanılan (Şekil 2 üzeresiniz ). Sondalar adjacently kesilmiş doku bölümler üzerinde kullanılır. Kritik üç doku bölümleri kabul edilir hesaplama doğruluğunu sağlamak için tam olarak aynı hibridizasyon, güçlendirme ve sinyal algılama adımda.<ol>
<li>Hibridizasyon sonda.<ol>
<li>Slaytları çamaşır rafa kaldırmak ve slaytlardan aşırı sıvı dokunun. Slaytları leke rafa yerleştirin.</li>
			<li>Sonda adı ile slaytlar etiketlemek için bir kalem kullanın. Üç farklı Nf1 problar (Şekil 2) ile birlikte melezleşmiştir için üç adjacently kesilmiş beyin doku slayt koymak. Slaytların aynı sırada sonraki adımları uygulayın.</li>
			<li>Sonda doku kapsayacak şekilde 4 damla ekleyin. Bu bir slayt bölümleri kurumasını önlemek için bir anda yapmak. Leke raf içinde nem kontrol tepsi ve 2 h 40 ° C fırında içine yerleştirin.</li>
			<li>Slaytları iki kez arabellek yıkama ile yıkayın. Her yıkama için boyama bulaşık yıkama arabellek x 1 200 mL ile doldurun ve bir çamaşır rafa yerleştirin. Kağıt havlu bir slayt üzerindeki aşırı sıvı teker teker dokunun ve hızlı bir şekilde çamaşır raf ekleyebilirsiniz. Slayt raf yemek için yukarı ve aşağı hareket 3-5 defa için 2 dk az RT.</li>
			<li>İkinci yıkama için taze yıkama arabellek kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sinyal güçlendirme.<ol>
<li>Slaytları fazla yıkama arabelleğinden dokunun ve leke rafa koyun. Doku kapsayacak şekilde AMP 0 4 damla ekleyin. Leke raf içinde nem kontrol tepsi ve 40 ° C'de 30 dk fırında yerleştirin</li>
			<li>Slaytları iki kez arabellek yukarıda açıklandığı gibi yıkama ile yıkayın.</li>
			<li>1-6 takip sipariş ve Tablo 2durumunu AMP ile bu adımı yineleyin. Slaytları iki kez her hibridizasyon adımdan sonra yıkayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sinyal algılama<ol>
<li>Slaytları fazla yıkama arabelleğinden dokunun ve leke rafa koyun. Hızlı kırmızı b 2 µL hızlı kırmızı 120 µL için ekleyin microcentrifuge tüp içinde (1:60 oranı). Mix iyi ve tam olarak doku bölümü kapsayacak şekilde ekleyin. Not: Kırmızı a toplam hacim / B karışımı numarası ve doku bölümün boyutunu temel alır. 0,75 '' x 0,75 '' alan, 120 µL bir bölümü için yeterli. 5 dakika içinde karışımı kullanın ve mix doğrudan güneş ışığı veya UV ışık yay.</li>
			<li>Kapatmak belgili tanımlık tepsi ve RT. Kaldır, 10 min için atık konteyner çözüm kuluçkaya ve hemen bir çamaşır raf slaytlar eklemek ve musluk suyu ile dolu bir çamaşır bulaşık raf yer. Tekrar taze musluk suyuyla durulayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slayt counterstaining
	<ol>
<li>Musluk suyundan çamaşır rafa kaldırmak ve hızlı bir şekilde ilave su kaldırmak için emici kağıt üzerine dokunun. Raf çözüm boyama % 50 hematoksilen koymak ve hemen raf birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dik, 2 min için kuluçkaya</li>
		<li>Slayt raf musluk suyu tabak içine aktarın. 3-5 kat raf yukarı ve aşağı hareket ve slaytları beyin dokuları mor kalırken, netlik kadar taze musluk suyu değiştirilerek yıkayın.</li>
		<li>Raf %0.02 Amonyaklı su içeren bir yemek için hareket. Dokular maviye kadar raf 2-3 kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Slaytlar 3-5 kat boyama bir tabak taze musluk suyu ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaj örnekleri
	<ol>
<li>Slayt raf boyama yemek 60 ° C kuluçka taşımak ve slaytları tamamen kuru olana en az 15 dakikadır kuluçkaya.</li>
		<li>Orta slayt ve dikkatli bir şekilde montaj yer 40 µL 24 mm x 50 mm coverslip doku bölümünün üzerine yerleştirin. Hava kuru slaytlarını RT., 30 dk</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. veri toplama ve Analizi
Not: 40 X büyütmede görüntüleri taramak için bir slayt tarayıcı kullanın.
<ol><li>
Pozitif ve negatif denetimleri
	<ol>
<li>Her deneme için pozitif ve negatif denetimler (Şekil 3) içerir. İyi bir pozitif kontrol sinyal 20-40 X büyütme punctate noktalar olarak görünür olmalıdır.</li>
		<li>Kullanım fare (Mm) - PPIB - 1ZZ pozitif kontrol olarak. Bu sonda bir genel temizlik hizmetleri gen PPIB hedefler. Negatif kontrol için kabul edilebilir her 20 X mikroskop alanı boyama arka plan görüntüleme her 20 hücrelere bir nokta var.</li>
		<li>DapB-1ZZ sonda bir negatif kontrol kullanın. Bu sonda bakteri gen dapB hedefler. Bu denetim probları birçok ISH deneyleri19' kullanılmıştır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sinyal algılama ve Nf1 exon 23a ifade kalıpları olarak Analizi
	<ol>
<li>Hibridizasyon sinyalleri punctate noktalardan olarak gösterilmiş, noktalar elle saymak. Nokta sayısı belirli bir yoklama ile tespit tutanakları düzeyiyle ilişkilidir. Not nokta sayısı da ImageJ veya SpotStudio yazılım tarafından analiz edilebilir.</li>
		<li>Üç sondalar exon 23a-içeren, exon izoformlarının 23a eksik veya toplam Nf1 transkript (Şekil 2) melezlemek için kullanın. Üç sondalar aynı anda kullanılamaz gibi her sonda melezlemek için üç bitişik beyin doku bölümleri kullanın.<ol>
<li>(PSI) exon 23a spliced yüzdesini hesaplamak için hücreleri ve bazı beyin bölgelerinde nokta sayısını saymak. Faiz her bölge için Şekil 4' te gösterildiği gibi birden fazla alt bölge üzerinden 400'den fazla hücreleri saymak.</li>
			<li>Aynı alt bölgelerdeki her üç sondalar için veri toplama. PSI exon 23a dahil sonda ile hücre başına nokta sayısı olarak hesaplamak / (exon 23a dahil sonda + hücre exon23a ile sonda atlama başına nokta sayısı ile hücre başına nokta sayısı) x %100.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing?.">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?.</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li><li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+in+situ+hybridisation.">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li><li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity.">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA.">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li><li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li><li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras/ERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li><li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner.">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes.">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li><li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim raporları BaseScope RNA ISH fare beyin bölümleri ifade desenleri olarak incelemek için kullanın. Bu anti-anlamda exon-exon junction 50 nukleotid exon içerme ve sağlam ve özellikle izoformlarının atlama hedefleyebilirsiniz daha kısa probları gösterilmiştir. Ayrıca, elde edilen sinyalleri bir alternatif exon PSI hesaplamak için kullanılabilir.
Birkaç varyasyon yordamda test edildi. Örneğin, donmuş doku bölümleri cryostat kesit tarafından oluşturulan test ve ...

Alternatif dikişi (AS) pre-mRNA olgunlaşma sırasında oluşan ortak bir süreçtir. Bu süreçte bir exon differentially olgun mRNA dahil edilebilir. Böylece, AS ile bir gen birçok mRNA'ların farklı protein ürünleri için bu kodu oluşturabilirsiniz. Bu tahmin edilmektedir insan genlerinin % 92-94 alternatif dikişi1,2tabi. Anormal alternatif uçbirleştirme desenleri sonuçlandı genetik mutasyonlar hastalıklar, amyotrofik lateral skleroz, miyotonik distrofi ve kanser3,4de dahil olmak üzere çok sayıda bağlantılı. Böylece araştırmak ve alternatif alışılageldik düzenleyici mekanizmaları insan hastalıkların yeni tedaviler bulmak için bir girişim daha iyi anlamak önemlidir.
GİBİ sık sık bir hücre türüne özgü biçimde düzenlenmiştir. Belirli bir biyolojik sisteminin belirli bir gen AS ifade desenini belirlemek önemlidir. Hücreleri, beyin veya kalp, gibi birçok farklı türde içeren karmaşık bir organ okudu ancak bu karmaşık olur. Bu durumda, ideal bir tahlil sisteminin belirli bir gen AS ifade desen birçok hücre tiplerinde aynı anda tespit edilebilir böylece RNA in situ hibridizasyon (ISH) doku kullanarak bölümleri seçimdir. Nitekim, exon özgü probları bir alternatif exon5,6,7' nin ifade düzeylerini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, bu yaklaşım aşağıdaki nedenlerden dolayı iyi desen analiz için uygun değildir. İlk, geleneksel ISH yöntemleri genellikle probları 300'den daha uzun kullanın bp, omurgalı iç ekzonlar (değil ilk veya son exon) ortalama büyüklüğü 170 nükleotit8,9iken. Exon özgü sonda bir iç alternatif exon alışılageldik paterni incelemek için kullanıldığında, ikinci olarak, sondası tarafından algılanan tek mRNA izoformu exon tespit edilemez olmadan, mRNA izoformu ise exon içeren sıradır. Böylece, hesaplama için alternatif exon (PSI) değerindeki spliced yüzde karmaşıktır. Ayrıca, geleneksel floresan ISH kez ISH algılama verimliliği ve sağlamlık azaltan immunostaining ile bir araya getirir. Örneğin, stres kaynaklı araştırıldı bir çalışmada izoformu asetilkolinesteraz (ağrı) geçiş Uçbirleştirme mRNA, digoxigenin ISH sondayı dahil oldu ve anti-digoxigenin antikor kullanarak algılandı. Alternatif olarak, biotin etiketli sonda bir alkali fosfataz/streptavidin eşlenik ve alkalen fosfataz10için bir substrat tarafından tespit edildi. Ben de yöntemi herhangi bir güçlendirme stratejisi algılama hassasiyeti artırmak için kullanılır. Sonuç olarak, düşük seviyelerde ifade edilir mRNA transkript algılamak için meydan okuyor. Böylece, daha basit ve daha sağlam bir ISH tahlil sistem ifade desenleri in situanaliz etmek için gereklidir.
BaseScope son zamanlarda RNAscope, köklü bir platformda temel alınarak geliştirilmiş ve yaygın kullanılan ISH tahlil sistemi. Her iki tahlil sistemleri algılama11,12hassasiyeti artar bir hedef özgü güçlendirme teknolojisi kullanır. Birini diğerinden ayırt eder gibi kısa BaseScope için 50 nukleotid ve 300-1000 nükleotit RNAscope için hedef sırası uzunluğudur. Böylece, belirli alternatif mRNA izoformlarının algılamaya exon exon kavşak hedef tasarım probları mümkündür. Mevcut çalışmada, ifade desenleri nörofibromatozis 1 (Nf1) exon 23a, kapsamlı bir şekilde aynı laboratuvar13,14,15 ' te okudu bir alternatif exon yazarken incelemek için bir yordam kuruldu , 16 , 17, fare beyin bölümlerde. Sonuçları BaseScope Nf1 exon 23a içinde in situifade desen çalışması için ideal bir sistem olduğunu ispat. Bu tahlil sistemi gibi birçok alternatif ekzonlar ifade desenleri analiz etmek için adapte edilebilir gibi güçlü bir yeni araç as çalışmalarda temsil eder

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Control Tray (with lid)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III General Purpose Incubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pretreatment kit&lt;/strong&gt;</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

Alternatif dikişi (AS) insan genlerinin fazla % 90 oluşur. Bir alternatif olarak spliced exon ifade desenini kez bir hücre türüne özgü biçimde düzenlenmiştir. Kalıpları genellikle RT-PCR ve RNA-seq tarafından incelenir ifadesi olarak hücreleri bir popülasyondan RNA numuneleri kullanılarak izole. İn situ incelenmesi belirli bir biyolojik yapısı için ifade desen olarak kullanarak exon özgü probları RNA in situ hibridizasyon tarafından (ISH) yapılabilir. Ancak, alternatif ekzonlar genellikle exon özgü probları tasarlamak için çok kısa olduğu için ISH belirli bu kullanımı sınırlı olmuştur. Bu raporda, BaseScope, RNA ISH, kısa antianlamlı oligonucleotides istihdam son zamanlarda gelişmiş bir teknoloji kullanımı olarak fare beyin bölümleri ifade desenleri analiz etmek için tanımlanır. EXoN 23a nörofibromatozis tip 1 (Nf1) örnek olarak kısa exon-exon junction probları RNA ISH analiz fare beyin bölümlerinde yüksek özgüllük ile sağlam hibridizasyon sinyalleri sergi göstermek için kullanılır. Daha da önemlisi, exon eklenmesi ve atlama-özel probları ile tespit sinyalleri güvenilir değerlerde Nf1 exon 23a ifade bir fare beynin farklı anatomik bölgelerde spliced yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir. Deneysel protokol ve hesaplama yöntemi için analiz olarak sunulmaktadır. Sonuçlar BaseScope ifade desenleri in situdeğerlendirmek için güçlü bir yeni araç sağlar gösterir.

BaseScope ISH üç fare suşları kullanılarak gerçekleştirildi: CD1 vahşi türü fareler, C57BL/6J vahşi türü fare ve hangi exon 23a bir sonucu olarak tüm hücre tipleri içinde dahil C57BL/6J arka plan Nf123aIN/23aIN mutant farelerde mühendislik splice sitesi mutasyonlar14,15.
İlk adım olarak, sağlanan şirket reaktifler kullanarak ISH ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.

Video: Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Genetik

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Kanser Araştırmaları

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Nörobilim

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Biyoloji

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler