Name: evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay at JoVE.com

Jaipreet Bharj tarafından sağlanan teknik destek. Bu çalışma, AB-FP7 (SYSCILIA -241.955) ve Hollanda Böbrek Vakfı (CP11.18) hibe ile desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Hayvan bakım, hayvancılık ve prosedürler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 Tüm hayvan deneyleri Biyolojik uygun Ana Sekreteri (PIL No 70/7892) tarafından verilen lisanslar altında gerçekleştirilmiştir tarafından tanımlanan ve kontrol edilir Hizmetleri Yönetimi Grubu ve Biyolojik Hizmetleri Etik Komitesi, SGUL, Londra, İngiltere. Tüm çabalar kullanılan hayvanların sayısını azaltmak ve refah acı en aza indirmek ve geliştirmek amacıyla hem usul ve hayvancılık rafine yapılmıştır. 1. Araçların, Anestezik hazırlanması ve Floresan Boya <ol><li> Bir mikropipet çektirmesi ve (filamentler olmadan) borosilikat standart duvar kılcal mikroenjeksiyon (Şekil 1A) için uygun uzunlukta iğneler çekin kullanma. </li><li> Perikard (Şekil 1B) içine kolay enjeksiyon için embriyo yönlendirme için bir agaroz kalıp olun. Tutkal yaklaşık on cam mikroskop slBirlikte ides ofset slaytlar bir &#39;merdiven&#39; oluşturmak için. En iyi sonuçlar için, her slayt merkezinde hızlı set epoksi reçine yapıştırıcı bir damla kullanın. </li><li> Kaldırmak, bir Bunsen beki ısıtılmış neşter kullanılarak iki adet 10 ml&#39;lik plastik pipetler ile uzunluk yarım yaklaşık 78 mm&#39;lik bir bölümünü kesip pipet gibi uygun biter. Takın ve yığılmış cam slaytlar tutkal (epoksi reçine) pipet bölümleri kalıp 90 mm Petri kabı içine daldırma izin istikrar sağlamak. Slayt köşeleri Petri kabı yere dik hizaya sağlamak için her türlü çabayı gösteriyoruz. Tutkal zamanı ayarlamak için izin ver. </li><li> Balık, su içerisinde yapılan% 2 agaroz çözelti içinde kalıp döküm (akvaryum de elde edilmiş). Bir 90 mm Petri kabı içine agaroz dökün ve istiflenmiş slayt agaroz yüzey altında bir açı ile su altında kenarları izin veren açık bir petri kabı üzerine kalıp yerleştirin. 30 dakika için laboratuar bankta ayarlamak için bırakın. </li><li> Slayt döküm çıkarın ve taze balık su ile slayt baskılı agaroz kapakTricaine anestezik içeren 1:25 oranında (adım 1.9 bakınız). </li><li> Rodamin dekstran (RD) boya çözümleri olun. Süspanse rodamin B 10,000 MA, 50 mg / ml&#39;lik bir stok konsantrasyonu için otoklava, aşırı saf su içinde dekstran etiketli. Mikroenjeksiyon için daha otoklavlanmış, aşırı saf su içinde 5 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar stok seyreltin. NOT: Pigmentli hücreler 24 saat sonra döllenme (hpf) den Zebra balığı ayırt başlar; Bu görüntü alımı sırasında floresan işaretçileri belirsiz olabilir. </li><li> Blok tirozinaz inhibe etmek suretiyle melanojenezin K -Phenylthiourea (PTU) kullanarak melanosit oluşumunu inhibe eder. Tam olarak çözündürülmesi için 60 ° C&#39;de akvaryum su, ısı çözeltisi propiltiourasil&#39;in tozunun çözülmesiyle propiltiyourasil&#39;i bir% 0.003 stok solüsyonu olun. </li><li> , Metilen mavisi çözeltisi, hafif fungisit zebrafish embriyolar inkübe mantar blum önlemek ve hayatta kalma artırmak için. U içinde% 0.1 Metilen mavisi ihtiva eden, metilen mavisi stok çözeltisi 2 ml ilave edilirltrapure su, standart bir embriyo ortamı olarak akvaryum su ve kullanım 1 L. </li><li> &#39;Zebra balığı Kitap&#39; 23 belirtildiği gibi Tricaine / etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu 15 mM stok konsantrasyonu Makyaj. Embriyoların uyutmak ve dolayısıyla mikroenjeksiyon işlemi gerçekleştirmek için onları hareketsiz. </li><li> Embriyoların anestezi sonra, metilselüloz, toksik olmayan ve yapışkan özelliklerini kullanarak görüntüleme için, yönlendirilmesi. % 3 metilselüloz 200 ml&#39;lik bir hazırlık yapmak buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı ve bir yer için -20 ° C &#39;de suyun 130 ml soğuk için. , Bir cam beher içinde, 80 ° C&#39;ye kadar 70 mi kadar su Isı metilselüloz 6 g ekleyin ve bütün parçacıkları ıslatıldığında ve düzgün bir şekilde dağılmıştır kadar bir cam çubuk kullanılarak çalkalayın. Buz soğukluğunda su ekleyin karıştırın ve hazırlama 50 ml tüpler içinde aliko haline önce 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de soğumaya bırakın. NOT: sıcaklık düşürülmesi metil çözünür olmayı sağlar. Çözelti daha kalın olacakToz hidratlar gibi. % 3 metil bakteriyel 4 ° C &#39;de bir haftalık, kısa süreler için büyüme ya da -20 ° C&#39;de daha uzun olmayan saklanabilir. Metilselüloz Kullanmadan önce RT ulaşmıştır emin olun. </li><li> Zebra balığı içine floresan boya enjekte gerçekleştirmek için bir standart mikroenjeksiyon set-up (Şekil 1C) kullanın. Bu 1.0, dış çap kapiller ile kullanım için düz bir pipet tutucusunun içine besleyen bir basınç düzenleyici sistemine bağlı bir hava kompresörü oluşur. Pipet tutucu bir manyetik stand ile bir çelik taban plakasına sabitlenmiş bir MM33 kompakt 3-eksenli kontrol mikromanipülatör içinde muhafaza edilmelidir. Embriyolar manipüle, görsel ve bir stereo mikroskop kullanarak enjekte edilebilir. </li></ol> 2. Zebra balığı Yetiştirme ve Ön-enjeksiyon tedavisi <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 23 zebrafish koruyun. 28.5 ° C sabit sıcaklıkta verilen sirkülasyon suyu sağlayan bir akvaryum set-up kullanınPH 6.8 şartına - 7.2 ve sodyum bikarbonat ve Anında Okyanus Deniz Tuzu ile 450-550 uS iletkenliği sırasıyla. 8 L tank başına 15 kadın 15 erkek bir stoklama yoğunluğu muhafaza, deney uygun olarak yabani-tip veya transgenik zebrabalıkları hatları kullanın. 09:00-23:00 arasında gün ışığı 14 saat balık tesisi photocycle ayarlayın. </li><li> Zebra balığı yumurtlama ışıkları sabah açmak photocycle, başında başlar. Toplamadan önce yabani türde stok tanklarına akşam üreme tankları (zebrabalıkları uzmanları temin içeren örgü ekler,) batığın, maksimum yumurta balık bozmadan toplanabilir sağlamak. </li><li> Sonra bir çay süzgeci ve taze akvaryum su kullanarak yumurta toplamak ve durulayın, balık için 40 dk yumurtlamaya - toplama gününde, 30 izin. Bir 90 mm Petri kabı içeren embriyo ortamda temizlenir yumurta bırakır ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. </li><li> Melano inhibe etmek için propiltiyourasil&#39;i embriyo tedavidoğuşu. 8 hpf, 1 içeren taze petri kaplarına minimal sıvı içinde canlı embriyo transferi: embriyo ortamına 100 PTU ve daha 72 hpf kadar 28.5 ° C&#39;de inkübe. NOT: PTU yani 8 hpf aşamalarını göndermek için sınırlı olmalıdır erken aşamalarında kullanıldığında gelişimsel bozukluklara neden olabilir, ama geç 24 hpf olarak tedavi edilebilir. PTU Geç eklenmesi tamamen göz pigmentasyon engellemek ama genelde başarılı ve gövde melanosit oluşumunu inhibe vermezse. </li></ol> 3. Mikroenjeksiyon NOT: perikard kalp encases ama perikard boşluğu içinde sıvı ile koruma ve kardiyak hareket kolaylığı için ayrılır. Bu işlemin amacı, bu damar sistemine boya hızlı alımı için izin veren, perikardiyal boşluğuna RD enjekte edilmesidir. <ol><li> 6 ul yük iğneler - Microloader ipuçlarını kullanarak, RD seyreltilmiş ve mikromanipülatör iğne tutucu içine sabitleyin. İnce tipp kullanarak iğne ucunu kırıned forseps (Şekil 1A). , Dakika ayarına darbe süresi maksimize ederek iğne ucu RD çözüm taşı kez tam msan geri dönmek. </li><li> Çapı 100 um sınırdışı damlacık boyutunu ayarlamak için (forseps kullanarak) iğne ucu uzunluğu bir sahne mikrometre, basınç regülatörü ve inceliklerini kullanarak, bu 0.5 nl hacmi (Şekil 2A) eşittir. NOT: İğneyi kırma yaparken, aksi takdirde zor enjeksiyon hacmi kalibre yapacak kapalı çok kırmak için değil dikkatli olun. Gerekirse ayrıca bununla birlikte açılan boyutunu artırmak dokunun aşırı bükme veya zarar vermeden perikard girişi izin veren bir iğne kalınlığı korumak için iğne ucu bölünürler. </li><li> Enjeksiyon öncesinde, Tricaine içeren embriyolar embriyo ortamda uyutmak. 5 ml embriyo orta, etiket, bir &#39;Tricaine&#39; ve diğer &#39;Kurtarma&#39; içeren 2 x 35 mm Petri kapları ayarlayın. </li><li> 200 ekleuygun şekilde etiketlenmiş çanak stok Tricaine ul. Enjekte etmek kez hazır, 72 hpf bireysel embriyo seçmek ve Tricaine çanak minimal sıvı içinde aktarmak. Embriyonun aktivitesi Monitör, embriyo anestezi uygulandı ve kesilmiş bir Microloader ucu kullanılarak hafif çalkalama ile hareketsiz hale test edin. </li><li> Enjeksiyon kalıp anestezi embriyo transfer ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde görüş alanının solunda kalp konumlandırma böylece agaroz çukur içinde embriyo yolunuzu. </li><li> Kalbin içine enjekte RD için, iğne ile perikard delmek ve anestezi embriyo (Şekil 2B, sağ panel) perikard boşluğuna RD 1 nl enjekte. Enjeksiyondan sonra iğneyi çekiniz. &#39;Kurtarma çanak&#39; minimal sıvı enjekte embriyo transfer ve 1 dakika izlemek. 1 ml taze embriyo ortamı (PTU ihtiva eder) ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bireysel embriyo transferi ve uygun olarak etiketleyin. NOT: Perikard zor, ancak perikard ventro-kaudal farenks kemerler ve dorso-rostral yolk kesesi (Şekil 2B ok ucu) karşılayan kesiştiği bir kayda değer bir zayıf nokta vardır. İğne bu oluk yönelik olmalıdır. İğne yerinde olduğunda, mikromanipülatör üstünde bir parmak sağlam bir musluk perikard boşluğuna girişini kolaylaştırmak olacaktır. </li><li> Ayrı bir kuyu ve benzersiz labelto izin bireysel deneysel takipleri her balık yer, deney grubu başına en az 10 embriyolar için 3.6 - 3.2 tekrarlayın adımları. 3 saat 28.5 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 4. Görüntüleme Toplama <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 3 saat sonra, enjeksiyon (HPI) de embriyolar anestezi ve% 3 metilselüloz içeren 35 mm Petri tabağına aktarın. Yavaşça metilselüloz içine embriyolar itmek ve lateral yan görüntülü böylece yolunuzu. </li><li> Görselleştirme o bir filtre kullanılarak, UV altında embriyo bir görüntü eldef 570 nm (Şekil 2C) ışığı yaydığı. Görüntü alındıktan sonra, embriyo iyi belirlenmiş içinde değiştirmeden önce kurtarmak için izin verir. Tüm enjekte embriyolar için görüntü elde ve daha 28.5 ° C&#39;de inkübe. NOT: Biz TXR filtre seti, bir DFC300FX kamera ve ilgili uygulama yazılımı ile bir floresan stereomikroskopta kullanılan bu protokolde. Sonraki görüntü elde etmek için tam satın alma ayarları bir yere not edin. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi 24 HPI anda, görüntülerin bir ikinci tur kazanır. Tüm görüntüleri elde edildikten sonra, 3 HPI ve 24 HPI hem de, insanca embriyoların imha veya diğer deneysel yollarla, örneğin, immunohistokimyasal için kullanın. </li></ol> 5. Görüntü İşleme <ol><li> NIH ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri analiz ederek, 3 HPI ve 24 HPI de, her enjekte embriyo floresan yoğunluğu niceliğini. , Floresan yoğunluğu ölçmek ImageJ bir görüntüyü açmak ve 1 faiz (roi) bir bölgeyi belirtmek için00 px 2 (Düzen → seçimi → belirtin). </li><li> Roi (Şekil 2C) merkezinde kalp yerleştirin, (→ tedbir Analiz) ölçümü gerçekleştirmek, (→ set ölçümleri analiz) ortalama gri skala ve bölgeyi kapsayacak şekilde ölçümler ayarlayın. Embriyo başına, 3 HPI ve 24 HPI de, görüntülerin her set için tamamlayın ve daha fazla işlem için bir elektronik tabloya ortalama gri skala değerleri aktarmak. NOT: Bu embriyolar arasındaki bireysel kalpleri kapsar Biz 100 px 2 sabit roi boyutu seçilir. Kalp nedeniyle önce böbrek girmeden kan floresan içeriğini ölçmek için elverişli bir konuma sağlayan geniş boyutuna ölçümler yapmak için seçildi. </li><li> Uygun istatistiksel yazılım kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bir öğrencinin t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık için gruplar karşılaştırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+zebrafish+kidney:+a+tale+of+two+tubes.">Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes.</a> Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).</li><li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged2a-notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct.">Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Cardenas-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CCDC28B+reveals+its+role+in+ciliogenesis+and+provides+insight+to+understand+its+modifier+effect+on+Bardet-Biedl+syndrome.">Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).</li><li>Osborn, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+FTO+antagonises+Wnt+signaling+and+leads+to+developmental+defects+associated+with+ciliopathies.">Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies.</a> PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).</li><li>Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+stability+and+ciliogenesis+requires+the+conserved+component+Poc1.">Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1.</a> J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).</li><li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies.">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).</li><li>Torres, V. E., Harris, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease:+the+last+3+years.">Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years.</a> Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).</li><li>Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+-+clinical+and+genetic+aspects.">Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects.</a> Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).</li><li>Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+kidney+disease.+1:+Identification+and+analysis+of+the+primary+defect.">Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect.</a> J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).</li><li>Reynolds, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+splicing+in+the+PKD2+gene+as+a+cause+of+polycystic+kidney+disease.">Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease.</a> J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).</li><li>Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+localizes+to+kidney+cilia+and+the+ciliary+level+is+elevated+in+orpk+mice+with+polycystic+kidney+disease.">Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease.</a> Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).</li><li>Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycystic+kidney+disease+proteins,+polycystin-1,+polycystin-2,+polaris,+and+cystin,+are+co-localized+in+renal+cilia.">The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).</li><li>Baker, K., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+cilia+in+disease:+the+human+ciliopathies.">Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).</li><li>Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+and+signaling+pathways+in+mammalian+development,+health+and+disease.">Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease.</a> Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).</li><li>Hruscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+with+low+off-target+effects+in+zebrafish.">Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish:+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration.">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bardet-Biedl+syndrome).">Bardet-Biedl syndrome).</a> Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).</li><li>Corbetta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+simple+kidney+cysts+in+patients+with+primary+hyperparathyroidism.">High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism.</a> J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).</li><li>Veleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Bardet-Biedl+syndrome+gene+BBS9/PTHB1+leads+to+cilia+defects.">Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects.</a> PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).</li><li>Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).</li><li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran.">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Zebra balığı, insan genetik hastalık modellemek için değerli bir araç sunmak, in vivo araştırma için bilimsel bir enstrüman olarak kullanılması böbrek dahil olmak üzere birçok biyolojik sistemlerin, genetik arıza detaylı çalışmalar sağlamıştır. Çok şimdi Zebra balığı böbrek geliştirir ve işlevleri nasıl anlaşılmaktadır. İnsan nefrogenezisi ve hastalığa neden olan genlerin 21 ile homoloji çarpıcı benzerlikler anlamada temel hale nasıl Zebra balığı resimli nasıl böbrek patolojisi ile gen fonksiyonu kurşun kusurları. Gerçekten de, genetik manipülasyon zahmetsizce antisens morfolino demonte teknolojisi ya da TALENS veya CRISPR gibi daha ileri hedef genom düzenleme araçları kullanılarak zebrabalıkları elde edilebilir. Şüpheli böbrek hastalığı neden olan genlerin için demonte veya mutant modelleri oluşturma hastalık tezahürü katılımlarını anlamak ilk adımdır. Böbrek fonksiyonu güvenilir bir deneydir aranan Bunu yapmak içinBir aday gen hastalarda gözlenen patoloji olasılıkla sorumlu olup olmadığını göstermek için. Böbrek fonksiyon testleri genellikle kanda veya idrarda mevcut solutların seviyelerinde bakarak, insanlar üzerinde gerçekleştirmek için basit ve nispeten ucuz. Ancak bu yöntemler nedeniyle küçük boyutu ve sucul habitat Zebra balığı uygulanamaz bulunmaktadır. Burada tarif edilen rodamin dekstran deney kandan düşük molekül ağırlıklı bileşenler filtre Pronephric tübül kabiliyetini kullanır. Podositler glomerül zarf kapiller, su gibi küçük moleküller, iyonik tuzlarının serbest geçişi sağlamak ve bir yarık diyafram 27 yoluyla glikoz olduğu, böbrek Bowman kapsülü içinde konumlandırılmış. filtrasyon yarıklar ayrıca kan makro protein kaybını önlemek için işlev görürler. Filtrasyon yaklaşık (serum albümin 28 boyutunda bloke moleküllerin 5 kDa üstünde ve neredeyse tamamen için sınırlı0, 65 kDa) sahiptir. Perikardiyal boşluğuna bilinen bir konsantrasyonda, yaklaşık olarak 10 kDa&#39;lık bir floresan boya dekstran enjekte edilerek, zaman içinde kan floresan yoğunluğunun ölçülmesi mümkündür. Normal şartlar altında, ilk floresans yaklaşık% 85 böbrek yoluyla salgılama yoluyla, 24 saatlik bir süre boyunca kan kaybolur. Bir perikard uzaya enjeksiyon damar içine serbestçe geçer, düşük MW dekstran ile mümkün olduğuna dikkat etmelidir. Bu durumda, bu deney, sadece düşük molekül ağırlıklı bileşenler için açıklık oranı için bir okuma verir ve glomerüler filtrasyon etkinliği konusunda herhangi bir bilgi vermemektedir. İkincisi daha doğrudan damar içine değil, perikard uzaya enjeksiyon gerektiren, kDa 70 üzerinden yüksek molekül ağırlıklı boyalar kullanılarak değerlendirilebilir. Aslında, çeşitli MW olarak ve dekstranlar da böbrek fonksiyonu 28 incelemek için kullanılabilir. Zebra balığı Pronephric tübüller çok mo ile kirpikli edilircloaca 3,4 doğru süzülen maddenin hareketini kolaylaştıran kiremit kirpikler. Siliyer makine Kusur böbrek hastalığında suçlanmıştır. BBS çocukluk başlangıçlı retina dejenerasyonu, erken başlangıçlı obezite, bilişsel bozukluk, polidaktili ve böbrek malformasyon 24 ile karakterize bir genetik olarak heterojen, otozomal resesif bir hastalıktır. Bugüne kadar, 20 BDS genleri (BBS1-20) tespit edilmiştir. Bbs bozulması zebrabalıkları 9 renal kist oluşumu ve kusurlu Pronephric fonksiyonu yol açar. BBS9 BBS durumda 24 6% hesaba mutasyonlar olan uygun ciliogenesis için BBSome sorumlu oluşturulması için diğer BBS proteinleri ile etkileşime girer. Bir Zebra balığı bbs9 demonte modeli bildirilmiştir iken, böbrek fenotip bir açıklama 26 eksik. Morfolino yaklaşımını kullanarak, Zebra balığı bbs9 aşağı vurma, biz belirlemek için bir yöntem olarak renal klirensi tahlil kullanımını göstermekBir böbrek hastalığı modelinde böbrek fonksiyonu. Burada, biz bbs9 morphant embriyolar böbrek düşük MW solutları kaldırmak için başarısız olduğunu belirten, kan akışından engelledi floresan temizlenmesini görüntüler olduğunu göstermektedir. Böylece, söz ciliogenesis içinde bbs9 katılımı ve süzüntü hareketini kolaylaştırmak Pronephric kirpikler rolü, morphants gözlenen böbrek açıklık anormal kirpikler işlevine bağlı olması muhtemeldir. Bu yöntem Zebra balığı hastalık modellerinde böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için değerli bir araç temsil eder.

İnsan böbrek kanından metabolik atıkların filtreleme ve hücresel homeostazı sürdürmek için gerekli eriyiklerin kurtarma önemli bir rol oynar. Böbrek fonksiyon bozukluğuna neden olan insan genetik hastalıkların bir dizi vardır. En yaygın kalıtsal böbrek hastalığı böbrek tübülleri içindeki sıvı dolu keseler gelişimi ile karakterize otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek) &#39;dir; cystogenesis kaynaklanan hasar böbrek fonksiyonu 10 için zararlıdır. 800-1: polikistik böbrek 1 oluştuğunun vardır 1,000 ve 8 hesapları - son dönem böbrek yetmezliği (SDBY), 11 hastada% 10. Birkaç genler yaklaşık% 85 ve sırasıyla 12,13 vakaların% 15 için muhasebe, polikistin-1 (PKD1) ve -2 (PKD2) dahil ADPKD neden suçlanmıştır. Ayrıca, gen PKD1 ürünleri ve -2 cilium lokalize ve ciliogenesis 14,15 temelidir. Olarak bilinen insan genetik bozukluklar, tanınmış bir aile artık varkirpikler fonksiyonunu etkileyebilir ve CKD 16 neden ciliopathies. siliyer gelişimini ve fonksiyonunu etkileyen insan genetik hastalıkların giderek artan sayıda bu kez kabul körelmiş organel küresel ilgi çekiyor. kirpik, saç benzeri hücresel çıkıntı, reseptörler ve anahtar hücre sinyal olayları transdüksiyonu için gerekli iyon kanalları ile zenginleştirilmiştir. kirpik tipik olarak ya da tekil mikrotübül merkezi bir çift olmaksızın dokuz radyal olarak düzenlenmiş mikrotübül çifti içine yapılandırılmış bir mikrotübül göre aksonem oluşur. axonemal yapısı siliyer eylem türünü ve modunu tanımlar. 9 + 2 mikrotübül düzenlemesi epitel yüzeyleri boyunca sıvıların hareketi kullanılmaktadır kirpiğin hareketliliğini bahşeder. 9 + 0 yapılandırması olmayan hareketlidir ama hücresel sinyal olaylar 17 ağırlıklı olarak işlev inanılmaktadır. Dışında CKD gelen, siliyer disfonksiyon sonuçları karakteristik bir dizi vardır, obezite, retina dejenerasyonu, polidaktili ve kognitif bozukluk 16 dahil ciliopathy özellikleri. Ancak, CKD hastanın yaşam kalitesi en zararlı ve bu nedenle silier ilgili CKD için vivo modellerde uygun gelişiminin arkasındaki önemli bir itici güç arasındadır. Zebra balığı, insan genetik hastalığının etyolojisi anlamak için mükemmel bir model. Bunların pratik geliştirme, yumurta, çok sayıda şeffaf doku ve eski in utero büyüme üretimi zebra balığı gelişim süreçleri görsel ve biyolojik etkinlik önemli kolaylıkla idare edilmesine olanak sağlamaktadır. Genler genetik, genom düzenleme araçları (CRISPR 18 ve TALENS 19) son başarısını kullanılarak değiştirilmiş antisens morfolino teknolojisi kullanılarak 20 nakavt, ya da farmakolojik onların su ortamında bileşiklerin eklenmesi ile kontrol edilebilir. Nitekim, Zebra balığı e üstlenmek için bir platform sunuyoruzDiğer hayvan modellerinde izin veren değil xperiments. Zebra balığı iken insanlarda ile birçok ortak işlevsel korunmuş organları, genleri ve sinyalizasyon işlemleri paylaşan (insanlara kıyasla) nispeten basit omurgalılar vardır. Örneğin, Zebra balığı böbrek insanlara 21,22 oranla yapısında ve fonksiyonunda oldukça benzer. Ancak, fazların bir arkaya yoluyla gelişir memeli böbrek aksine, her bir daha gelişmiş böbrek (pronephros, mezonefros ve metanephros) ile işaretlenmiş, embriyonik zebrafish sadece bir pronephros, bir böbreğin en olgunlaşmamış formu geliştirir. Nefron milyonlarca memeli böbrek yapı taşlarını oluşturan bulunabilir iken, Zebra balığı embriyo sadece iki sahip. İlk kan süzülen kısım için izin glomerüller, aort orta hatta sadece ventral olarak kaynaşmıştır. Cloaca yoluyla çıkmak için önce eritme, eksen boyunca kaudal çalıştırmak Pronephric tübüllerine glomerüllerden kan filtreleri. Pronephric tubules ağır kaudal çıkış 3,4 doğru süzülen maddenin akışına toleranslılar hareketli kirpikler ile kirpikli edilir. Bu basit Pronephric yapı onlar sonunda bir daha karmaşık yapıya mezonefros 21 haline larva büyümenin birkaç hafta boyunca Zebra balığı homeostazı korur. Bununla birlikte, zebra balığı, bir metanephros 21 geliştirir olmadı. Zebra balığı özel duruma rağmen, zebra balığı nefron memelilerde görülen eşit gen sentezleme profilleri ile bölümlere ve böylece nefrogenezisi 3,22 in vivo modelinde rakipsiz sunmaktadır. Rutin hasta, kan ve idrar testleri bir dizi böbrek fonksiyonu için test edilir. Tipik haliyle, kan çözülmüş tuzları, üre, kreatinin için analiz edilir. Üre, kreatinin ve anormal tuz konsantrasyonu yüksek düzeyde böbrek fonksiyonu ile ilgili sorunlar göstergesidir. Bir kolorimetrik çubuğunu kullanarak İdrar tahlili proteini, bloo anormal seviyelerini algılard irin, bakteri ve idrar örneklerinde şeker mevcut. Kanın 10 ml - Bu gibi testler, normal olarak idrar yaklaşık 30 ml ya da 5 gerektirir. Bu esas olarak tahlili gerçekleştirmek için yeterli kan ya da idrar toplama imkansız olması sebebiyle, söz zebrabalıkları gibi in vivo model organizmaların, küçük deneylerde, bu tür çevirmek için zor olmuştur. Burada, biz uygun zebrabalıkları böbrek fonksiyon testleri eksikliğini gidermek ve çalışma için yenilikçi bir teknik tarif. Kan akışı içine bir floresan boya enjekte edilmesi Böbreğin ile kandan süzme ve floresan aktivitesi atılımını izlemek ve ayrı ayrı zaman içinde ölçmek mümkündür. Bu yöntem, bir örnek teşkil hastalığın neden olduğu böbrek hasarı, çalışma için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td><td>Intracel</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>borosilicate standard wall capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>VWR International</td><td>631-0109</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resin Glue</td><td>Evo-Stik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>D-1824</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>air compressor&amp;nbsp;</td><td>Jun-Air</td><td>OF302-15</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III&amp;nbsp;</td><td>Parker Instruments&amp;nbsp;</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>compact 3-axis control micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>Marzhauser</td><td>MM33&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>stage micrometer&amp;nbsp;</td><td>Pyser- SGI</td><td>02A00404</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

Zebra balığı embriyo organogenezi çalışma ve insan genetik hastalık modellemek için bir uysal bir model sunuyor. Göreli basitliğine rağmen, Zebra balığı böbrek geliştirir ve insanlar hemen hemen aynı şekilde çalışır. İnsan böbrek yapımında önemli bir fark sadece iki olan Zebra balığı göre nefron milyonlarca varlığıdır. Ancak, temel fonksiyonel birimler halinde böyle karmaşık bir sistemin basitleştirilmesi böbrek geliştirir ve nasıl çalıştığını anlayışımızı destekli etti. Zebra balığı, glomerulus bulunduğu orta hat cloaca birbirine kaynaştırarak önce embriyonik eksen aşağı ikili çalıştırmak sapmak iki Pronephric tübüllerine ilk kan filtrasyon sorumludur. Pronephric tübüller ağır nihayet cloaca 2-4 vasıtasıyla çıkmadan önce çeşitli çözünenlerin alışverişini sağlayan, parçalı tübül boyunca süzülen maddenin hareketini kolaylaştıran hareketli kirpikler tarafından doldurulur. CKD, inc sorumlu Birçok genlerciliogenesis ile ilgili olanlar luding, zebrabalıkları 5 incelenmiştir. Ancak, büyük bir beraberlik geri genetik manipülasyon sonra Zebra balığı böbrek fonksiyonunu değerlendirmede zorluk olmuştur. İnsanlar çoğunlukla nedeniyle sucul ortamda ve küçük boyutu, Zebra balığı olmayan translasyonel kanıtladık Geleneksel tahliller böbrek disfonksiyonu ölçmek için. Örneğin, embriyonik üre ve kreatinin içeriğinin analizi için balık kademeli gelen bunlar çok küçük oldukları gibi, kan çıkarmak için fiziksel olarak mümkün değildir. Buna ek olarak, Zebra balığı genellikle ilk hasta muayeneleri sırasında yapılan basit bir proteinüri &#39;yağ çubuğu&#39; üzerinde test için yeterli idrar üretemezler. Böbrek fonksiyonu 1,6-9 üzerinden bir okuma vermek için, damar ile ilgili ve dışarı böbrek yoluyla niceliksel olarak, zaman içinde, bir floresan boya açıklık izlemek için zebrabalıkları optik saydamlığı kullanan bir floresan deneyi tarif eder.

Dünya çapında 16 160,000 kişiyi: Bardet-Biedl sendromu (BBS) yaklaşık 1 etkileyen nadir heterojen ciliopathy olduğunu. Polikistik böbrekler olmak üzere ilgili bir takım sorunlar ile başvururlar, daha sonra hastalar sıklıkla böbrek diyaliz veya transplantasyon 24 gerektirir. SDBY CKD 16 gelişmekte olan hastaların yaklaşık% 30 ile, BBS içinde en sık ölüm nedenidir. Şu anda, 20 sigara ile ilgili genler yayınlanmış genotip-fenotip dernek ile BBS suçlanmıştır. BBS proteinleri hastaların karakteristik özellikleri ile birlikte, bir ciliopathy tanı anlaması, kirpik ve bazal organları içinde ortak protein yerelleştirme etki paylaşıyoruz. BBS9 birlikte diğer BBS ile (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteinlerinin primer kirpiksi cisim 24 oluşumu için BBSome kompleks sorumlu çekirdeğini oluşturan Parathyoid hormon duyarlı B1 (PTHB1) proteini kodlar. BBS c% 6 BBS9 hesabında mutasyonlargazlar 24. Bundan başka, PTH böbrek kusurları 25 görüntüleyebilir zebrabalıkları bbs9 fonksiyon kaybının işaret böbrek epitelyal hücre çoğalmasının teşvik edilmesi yoluyla böbrek kist oluşumuna işaret edilmiştir. Bir bbs9 demonte Zebra balığı modeli kullanılarak Önceki raporlar açıklanan böbrek fonksiyonu tahlili 26 gösterme fırsatı sunan, böbrek açıklamasını hariç. Bbs9 fonksiyonunun demonte, 1, 4-hücre aşamasında, enjekte edilerek zebrabalıkları insan beta-Globin bir intronik mutasyon karşı gen spesifik bbs9 çeviri ve paralel bir standart negatif kontrol morfolino engellemek için bir anti-duyum morfolino elde edildi (4 ng bbs9 MO sekansı GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA 4 ng kontrol MO sekansı CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Biz bu analiz için uygun bir model düşündüren, bbs9 fonksiyon kaybı 5 dpf&#39;e tarafından Pronephric kistler görüntüleyen embriyoların 40% sonuçlandı bulundurodamin dekstran boşluk testi kullanılarak böbrek fonksiyonu. 61.0 ± 10.3 SEM, n = 10: bbs9 MO; 14.8 ± 1.2 SEM n = 9: con - Biz 24 hpi kontrollere kıyasla sonra morphant balık (Şekil 3) floresan boya temizlemek için yeteneği önemli bir azalma olduğu görülmektedir ; t-test P değeri: 0.002). Düşük kan dolaşımı nedeniyle olabilir boşluk azaltılmış potansiyeli ekarte etmek için, embriyolar, kalp atım ve devir daim kan hücreleri için değerlendirildi, kontrolü ve morphant balık hem karşılaştırılabilir kalp hızı ve kan akışını vardı. Bu veriler böbrek fonksiyon bbs9 morphants bozulmuş olduğunu göstermektedir. Nitekim, bbs9 morphant embriyolar BBS hastalarında gözlenen ile eşzamanlı kistik Pronephric tübülleri geliştirmek. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52540/52540fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1. Ekipman hazırlıkve set-up. (A) Borosilikat kılcal damarlar uygun bir iğne çektirmenin kullanarak mikroenjeksiyon için çekilmelidir. iğne iğne çıkmak için RD izin vermek forseps (kesikli çizgi) ile kırma gerektirir, bakım çok kalibre edilemez bir iğne render iğne kırmak için değil alınmalıdır. Ölçek çubuğu:. 200 mikron (B) embriyo manipülasyonu ve yönlendirme için bir agaroz kalıp cam slaytlar ve plastik pipetler birlikte yapıştırma ile moda olabilir (C), standart mikroenjeksiyon set-up.. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız .</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52540/52540fig2highres.jpg" width="700" /> Perikardiyal kese içine rodamin dekstran Şekil 2. Mikroenjeksiyon. (A) 10 inc için damla boyutu kalibrerements 1 mm sahne reticule üzerinde (100 mikron). (B) doku (ok başı) piercing kolaylaştıracak kaudal farengeal kemer, yumurta sarısı kesesi ve kalp arasındaki kavşak işaretleme crevasse içine iğne (siyah oklar) Doğru konumlandırma. Ölçek çubuğu:. 200 mikron (C) Rodamin dekstran hızla tüm damar (beyaz oklar) tarafından alınan görülebilir. 100 px merkezi kalp (sarı kare) kapsayan çıkarları 2 bölgeleri ortalama gri değeri ve dolayısıyla piksel / floresan yoğunluğu ölçümleri almak için kullanılmalıdır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52540/52540fig3highres.jpg" width="700" /> Bbs9 Şekil 3. demonte arızalı böbrek fonk nedenZebra balığı yon. (A), embriyolar kontrol veya bbs9 morphant embriyolar ya da sırasıyla, 3 HPI 24 HPI, üst ve alt iki panel de rodamin dekstran ile perikard içine enjekte edilir. Ok uçları kalp gösterir; ok Pronephric kist oluşumunu gösterir. (B) Yüzde floresan yoğunluğu bbs9 MO embriyolar karşı kontrol 24 HPI sonra kalan. Hata çubukları, ortalama (SEM) standart hata göstermiyor ** P ≤ 0.01. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay at JoVE.com

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Zebra balığı, kronik böbrek hastalığı (KBH) modellemek için popüler bir araçtır. Ancak, kendi küçük boyutu imkansız geleneksel yöntemlerle böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için yapar. Biz CKD zebrafish böbrek fonksiyonunun kantitatif analiz sağlayan bir floresan boya böbrek boşluk tahlil 1 açıklar.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Görüntüleme.  University College London.  Zebra balığı, kronik böbrek hastalığı (KBH) modellemek için popüler bir araçtır. Ancak, kendi küçük boyutu imkansız geleneksel yöntemlerle böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için yapar. Biz CKD zebrafish böbrek fonksiyonunun kantitatif analiz sağlayan bir floresan boya böbrek boşluk tahlil 1 açıklar. 

Video: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Gelişim Biyolojisi

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biyoloji

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Yetişkin Zebra Balıklarında Cisplatin tarafından İndüklenen Akut Böbrek Yaralanması Modeli

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...