Name: evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
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A assistência técnica fornecida por Jaipreet Bharj. Este trabalho foi apoiado por subsídios da UE-FP7 (SYSCILIA -241.955) e The Dutch Kidney Foundation (CP11.18).

Declaração de Ética: Animal de manutenção, criação e procedimentos são definidos e controlados pelos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Todos os experimentos com animais foi efectuada ao abrigo de licenças concedidas pelo Ministro da Administração Interna (PIL No. 70/7892), em conformidade com Biológica Serviços de Gestão do Grupo e da Comissão de Ética do Serviço Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Foram feitos todos os esforços para reduzir o número de animais utilizados para refinar e ambos os procedimentos e pecuária, a fim de minimizar o sofrimento e melhorar o bem-estar. 1. Preparação de Instrumentos, anestésico, e corante fluorescente <ol><li> Usando um extractor de micropipeta e capilares padrão de borosilicato de parede (sem filamentos) puxam agulhas de comprimento adequado para microinjecção (Figura 1A). </li><li> Fazer um molde de agarose para orientação de embriões para injecção fácil no pericárdio (Figura 1B). Glue aproximadamente dez vidro microscópio slides juntos para formar uma &quot;escada&quot; de lâminas de compensado. Para melhores resultados, usar uma gota de cola de resina epoxi rápida conjunto no centro de cada lâmina. </li><li> Cortar uma seção de aproximadamente 78 mm de comprimento no meio duas pipetas de 10 ml de plástico com um bico de Bunsen bisturi aquecido, remova pipeta termina conforme o caso. Encaixe e secções de cola (resina epóxi) de pipeta para as lâminas de vidro empilhadas para proporcionar estabilidade para permitir que o molde de mergulhar em uma placa de Petri de 90 mm. Faça todos os esforços para garantir os cantos de slides alinhar perpendicular ao chão placa de Petri. Dê tempo cola para definir. </li><li> Lançar o molde em uma solução de agarose 2% feita em peixes de água (obtido a partir do aquário). Pour agarose em uma placa de Petri de 90 milímetros e colocar o molde por cima do prato de Petri abertas, permitindo que a lâmina de orlas empilhadas para submergir num ângulo abaixo da superfície de agarose. Deixar para definir sobre a bancada do laboratório durante 30 minutos. </li><li> Retirar o elenco slide e cobrir a agarose impressa-slide com água peixe frescocontendo tricaina anestésico (veja o passo 1.9) a uma razão de 1:25. </li><li> Faça soluções de rhodamine dextrano corante (RD). Ressuspender rodamina B 10.000 MW marcado de dextrano em água ultrapura esterilizada para fazer uma concentração de estoque de 50 mg / ml. Para micro-injecção, dilui-se ainda mais o material a uma concentração final de 5 mg / ml em água ultrapura esterilizada. NOTA: Pigmentado células começam a se diferenciar no peixe-zebra a partir de 24 horas pós fecundação (hpf); estes podem obscurecer marcadores fluorescentes na aquisição da imagem. </li><li> Inibir a formação de melanócitos usando N -Phenylthiourea (PTU), que bloqueia a melanogênese através da inibição da tirosinase. Adicione uma solução de estoque de 0,003% do PTU dissolvendo PTU pó em água do aquário, solução de calor a 60 ° C para solubilizar por completo. </li><li> Incubar embriões de peixes-zebra em solução de azul de metileno, um fungicida leve, para evitar blooms fúngicas e aumentar a sobrevida. Adicionar 2 ml de solução de estoque de azul de metileno, contendo 0,1% de azul de metileno em uágua ltrapure, para 1 L de água do aquário e utilização como meio de embrião padrão. </li><li> Certifique-se uma concentração de estoque 15 mM de tricaina sal metano / acetato de 3-aminobenzoate conforme as instruções em &#39;O Livro Zebrafish »23. Anestesiar os embriões e, consequentemente, eles imobilizadas para executar o procedimento de microinjecção. </li><li> Depois de anestesiar os embriões, orientá-los, para geração de imagens usando as propriedades não-tóxicos e viscosos de metilcelulose. Para fazer uma preparação de 3% de metilcelulose 200 ml, chill 130 ml de água à temperatura de -20 ° C durante 30 minutos e colocar em gelo. Aquecer 70 ml de água a 80 ° C numa proveta de vidro, adiciona-se 6 g de metilcelulose, e agita-se usando uma vareta de vidro, até que todas as partículas são molhadas e uniformemente dispersas. Adicionar a água com gelo, mistura, e permitir que a preparação para arrefecer a 4 ° C durante 30 min antes de alíquotas em tubos de 50 ml. NOTA: A redução da temperatura permite a metilcelulose para se tornar solúvel. A solução torna-se mais espessacomo os hidratos de pó. Metilcelulose a 3% pode ser armazenado sem o crescimento bacteriano por curtos períodos de uma semana a 4 ° C ou mais, à temperatura de -20 ° C. Certifique-se a metilcelulose atingiu RT antes do uso. </li><li> Para realizar injecções de corante fluorescente para o peixe-zebra usar microinjecção um set-up padrão (Figura 1C). Este é constituído por um compressor de ar ligado a um sistema regulador de pressão que alimenta um suporte pipeta linear para utilização com 1,0 de diâmetro exterior capilares. O titular da pipeta devem ser alojados dentro de um compacto micromanipulator controle de 3 eixos MM33 preso a uma placa de base de aço por um suporte magnético. Os embriões podem ser visualizados, manipulados e injectados utilizando um microscópio de dissecação estéreo. </li></ol> 2. Zebrafish Pecuária e Tratamento Pré-injeção <ol><li> Manter peixe-zebra, como previamente descrito 23. Use um aquário set-up que fornece água de recirculação fornecido a uma temperatura constante de 28,5 ° CCondicionadas ao pH 6,8-7,2 e condutividade de 450-550 uS com bicarbonato de sódio e Instant Oceano Mar Salgado, respectivamente. Use wildtype ou linhas de peixes-zebra transgénicos, conforme apropriado para o experimento, mantendo uma densidade de 15 machos e 15 fêmeas por 8 L tanque. Defina o photocycle facilidade de peixe para 14 horas de luz do dia entre 09:00-23:00. </li><li> Desova do peixe-zebra começa no início do photocycle, quando as luzes se acendem na parte da manhã. Para garantir o máximo de ovos podem ser recolhidos, sem perturbar o peixe, submergir tanques de criação (que contêm inserções de malha, disponíveis a partir de especialistas de peixe-zebra) em tanques de estoque de tipo selvagem a noite antes da coleta. </li><li> No dia da coleta, permitir que 30 - 40 min para os peixes para a desova, após o que coletar e enxaguar ovos usando um coador de chá e água do aquário fresco. Depositar os ovos limpos em um meio contendo embrião 90 milímetros placa de Petri e incubar a 28,5 ° C. </li><li> Trate os embriões com PTU para inibir melanogênese. Às 8 hpf, transferir embriões viáveis ​​em líquido mínimo para placas de Petri fresco com 1: 100 PTU e médio embrião e mais incubar a 28,5 ° C até 72 hpf. NOTA: PTU pode causar defeitos de desenvolvimento, se usado em fases anteriores por isso deve ser limitado ao postar 8 etapas HPF, mas pode ser tratada tão tarde quanto 24 hpf. Além Late of PTU não bloqueia totalmente a pigmentação do olho, mas é geralmente bem sucedido e inibir a formação de tronco dos melanócitos. </li></ol> 3. Microinjection NOTA: O pericárdio envolve o coração, mas é separado para a proteção e facilidade de movimento cardíaco por fluido no interior da cavidade do pericárdio. O objectivo deste procedimento é injectar RD na cavidade pericárdica, isto permite a absorção rápida do corante para o sistema vascular. <ol><li> Agulhas carga com 6 ul - diluída RD, usando dicas Microloader e seguro no porta-agulha da micromanipulator. Quebre a ponta da agulha usando tipp multafórceps ED (Figura 1A). Mova a solução RD à ponta da agulha, maximizando duração do pulso para a definição dos minutos, voltar para milisegundos, uma vez concluída. </li><li> Usar um micrómetro de plataforma, o regulador de pressão, e refinamentos de comprimento de ponta de agulha (utilizando pinças) para ajustar o tamanho da gotícula expelido a 100 um de diâmetro, isto equivale a um volume de 0,5 nl (Figura 2A). NOTA: Ao quebrar a agulha, tenha cuidado para não quebrar muito off caso contrário ele irá fazer a calibração do volume de injeção difícil. Se necessário, quebrar a ponta da agulha ainda mais para aumentar o tamanho de gota no entanto, manter uma espessura que permite a entrada da agulha no pericárdio sem uma curvatura excessiva ou danos no tecido. </li><li> Antes da injecção, anestesiar os embriões em meio contendo tricaina embrião. Configure 2 x 35 milímetros placas de Petri contendo 5 ml de meio de embrião, uma etiqueta do &#39;tricaina&#39; eo outro &#39;Recovery&#39;. </li><li> Adicionar 200ul de estoque tricaina ao prato devidamente rotulados. Uma vez pronto para injetar, selecionar um embrião humano no 72 hpf e transferir em líquido mínimo para o prato tricaina. Monitorizar a actividade do embrião, o embrião é testar anestesiados e imobilizados por agitação suave usando uma ponta microloader truncado. </li><li> Transferir o embrião anestesiado para o molde de injecção e orientação do embrião dentro de uma calha de agarose de modo que o lado esquerdo está virada para cima, o posicionamento do coração para a esquerda do campo de visão. </li><li> Para injectar a RD para o coração, o pericárdio perfurar com a agulha e injectam-se 1 nl de RD na cavidade pericárdica do embrião anestesiados (Figura 2B, painel da direita). Retire a agulha após a injeção. Transferir o embrião injectado no líquido mínimo para o &quot;prato de recuperação &#39;e monitorar durante 1 min. Transferência do embrião individual a uma placa de 24 poços contendo 1 ml de meio de embrião fresco (contendo o PTU) e etiqueta apropriadamente. NOTA: O pericárdio é difícil, no entanto, há um ponto fraco notável no cruzamento onde o pericárdio atende aos arcos faríngeos ventro-caudal e dorso-rostral saco vitelino (Figura 2B ponta de seta). A agulha deve ser direcionado para este groove. Quando a agulha está no lugar, uma torneira firme de um dedo na parte superior do micromanipulador vai facilitar a entrada na cavidade pericárdica. </li><li> Repita os passos de 3,2-3,6 por pelo menos 10 embriões por grupo experimental, coloque cada peixe em um bem separado e exclusivamente labelto autorização individuais experimentais follow-ups. Incubar a 28,5 ° C durante 3 h. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> Às 3 horas pós injeção (HPI) anestesiar embriões como descrito anteriormente e transfira para um prato de 35 milímetros Petri contendo 3% de metilcelulose. Com cuidado, empurre embriões na metilcelulose e orientar para que o lateral pode ser trabalhada. </li><li> Adquirir uma imagem do embrião sob UV, utilizando um filtro para o visualizaçãof a luz emitida a 570 nm (Figura 2C). Após a aquisição da imagem, permitir que o embrião para se recuperar antes de substituir no poço designado. Aquisição de imagens para todos os embriões injetados e mais incubar a 28,5 ° C. NOTA: Neste protocolo foi utilizado um microscópio estereoscópico fluorescente com um conjunto de filtros TXR, uma câmera DFC300FX e respectivo software aplicativo. Anote as configurações de aquisição exatas para aquisição de imagem subsequente. </li><li> Aos 24 hpi, adquirir uma segunda rodada de imagens como descrito acima. Uma vez que todas as imagens foram adquiridas, tanto a 3 hpi e 24 hpi, humanamente descarte dos embriões ou utilização para outros meios experimentais, por exemplo, imuno-histoquímica. </li></ol> 5. Processamento de Imagem <ol><li> Quantificar intensidade de fluorescência de cada embrião injetado, em 3 hpi e 24 hpi, através da análise de imagens usando o software ImageJ do NIH. Para medir a intensidade de fluorescência, abra uma imagem em ImageJ e especificar uma região de interesse (ROI) a 100 px 2 (Edit → seleção → especificar). </li><li> Posicione o coração no centro do roi (Figura 2C), definir as medidas a incluir escala de cinza médio e área (Analisar → medições de conjunto), efectuar a medição (Analisar → medida). Completar para cada conjunto de imagens, em 3 hpi e 24 hpi, por embrião e transferir valores médios de escala de cinza para uma folha de cálculo para posterior processamento. NOTA: Nós selecionamos um tamanho roi fixa de 100 px 2 como esta engloba corações individuais entre embriões. O coração foi escolhido para realizar medições, devido ao seu grande tamanho que permite uma localização conveniente para medir o teor de fluorescência do sangue antes de entrar no rim. </li><li> Realizar a análise estatística usando o software estatístico adequado. Compare grupos para significância estatística usando o teste t de um estudante. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Zebrafish oferecer uma ferramenta valiosa para modelar doença genética humana, a sua utilização como um instrumento científico para a pesquisa in vivo têm permitido estudos detalhados sobre a repartição genética de muitos sistemas biológicos, incluindo o rim. Muito se agora sabe sobre como o rim zebrafish desenvolve e funções. As semelhanças com nefrogênese humana e homologia com a doença que causa genes 21 ilustrou como peixe-zebra tornaram-se fundamentais na compreensão de como defeitos em função do gene levam à patologia da doença renal. Na verdade, a manipulação genética pode ser facilmente alcançado em peixes-zebra usando antisense morfolino tecnologia knockdown ou ferramentas de edição do genoma segmentado mais avançadas, como TALENS ou CRISPR. Criando modelos knockdown ou mutantes por suspeita de doença renal causando genes é o primeiro passo para entender a sua participação na manifestação da doença. Para fazer isso um ensaio confiável para a função renal é procuradopara indicar se um gene candidato é provavelmente responsável pela patologia observada em pacientes. Testes da função renal são simples e relativamente barato para executar em seres humanos, em geral, olhando para os níveis de solutos presentes no sangue ou na urina. No entanto, estes métodos são inaplicáveis ​​no peixe-zebra, devido ao seu pequeno tamanho e habitat aquático. O ensaio de dextrano rodamina descrito aqui utiliza a capacidade dos túbulos pronephric para filtrar os componentes de baixo peso molecular a partir do sangue. Os podócitos posicionado dentro da cápsula de Bowman do rim, envelopes que os capilares do glomérulo, permitir a passagem livre de moléculas pequenas tais como água, sais iónicos e glicose através de um diafragma de fenda 27. As fendas de filtração funcionar mais para prevenir a perda de proteínas macro a partir do sangue. A filtração é restrito para as moléculas acima de 5 kDa e quase completamente bloqueado com o tamanho de albumina de soro de 28 (aproximadamente0; 65 kDa). Ao injectar um corante fluorescente dextrano de cerca de 10 kDa, a uma concentração conhecida na cavidade pericárdica, que é capaz de medir a intensidade de fluorescência do sangue ao longo do tempo. Sob condições normais, cerca de 85% de fluorescência inicial é perdido a partir do sangue, ao longo de um período de 24 horas, através de secreção por via renal. Note-se que a injeção no espaço pericárdico somente é possível com baixo dextrano MW que passa livremente na vasculatura. Assim, este ensaio só dá a ler-out para a taxa de depuração para componentes de baixo peso molecular e não dá qualquer informação sobre a eficácia de filtração glomerular. Este último pode ser avaliada utilizando mais directamente corantes de elevado peso molecular superior a 70 kDa, exigindo a injecção no sistema vascular e não para o espaço pericárdico. Com efeito, dextranos de vários MW podem ser usados ​​para dissecar ainda mais a função renal 28. Os túbulos pronephric peixe-zebra são altamente ciliada com mocílios telha que facilitam o movimento do filtrado para a cloaca 3,4. Defeitos em máquinas ciliar têm sido implicadas na doença renal. BBS é um, autossômica recessiva desordem geneticamente heterogênea, caracterizada pela degeneração da retina de início na infância, obesidade início precoce, disfunção cognitiva, polidactilia e malformação renal 24. Até à data, 20 genes BBS (BBS1-20) foram identificadas. Rompimento de bbs leva à formação de cisto renal e função pronephric defeito no peixe-zebra 9. BBS9 interage com outras proteínas BBS para formar a BBSome responsável por ciliogênese apropriado, mutações de que são responsáveis ​​por 6% da BBS 24 casos. Enquanto um modelo bbs9 knockdown peixe-zebra tem sido relatada, uma descrição do fenótipo renal faltava 26. Por derrubar bbs9 no peixe-zebra, utilizando a abordagem morfolino, que demonstram a utilização do ensaio de eliminação renal como um método para determinara função renal em um modelo de doença renal. Aqui, nós mostramos que os embriões bbs9 morphant exibir apuramento fluorescente impedido de o fluxo de sangue, o que indica que o rim não conseguiu remover solutos baixo PM. Assim, devido ao envolvimento de bbs9 em ciliogênese, e o papel dos cílios pronephric em facilitar o movimento filtrado, o apuramento do rim observado em morphants é provável que seja devido à função dos cílios aberrante. Este método representa um instrumento valioso para a avaliação da função renal em modelos de doenças de peixes-zebra.

O rim humano desempenha um papel crucial na filtragem de resíduos metabólicos do sangue e recuperando os solutos necessários para manter a homeostase celular. Há um número de doenças genéticas humanas que causam disfunção renal. A doença renal hereditária mais comum é a doença renal policística autossómica dominante (ADPKD) caracterizada pelo desenvolvimento de sacos cheios de fluido dentro dos túbulos nefríticos; os danos causados ​​por cistogénese é prejudicial para a função renal a 10. ADPKD tem uma ocorrência de 1: 800-1: 1000 e responsável por 8 - 10% de doentes com insuficiência renal em fase terminal (ESRF) 11. Vários genes têm sido implicados para causar ADPKD incluindo policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), representando cerca de 85% e 15% dos casos, respectivamente, 12,13. Além disso, os produtos do gene PKD1 para localizar e -2 para o cílio e são fundamentais para ciliogênese 14,15. Existe agora uma família reconhecida de doenças genéticas humanas, conhecidas comoos ciliopathies, que afetam a função dos cílios e resultam em CKD 16. O crescente número de doenças genéticas humanas que afetam o desenvolvimento e função ciliar está despertando o interesse global nesta organela vestigial uma vez considerado. O cílio, uma saliência celular cabelo semelhante, é enriquecido com os receptores e canais necessários para a transdução de eventos de sinalização celular chave de iões. O cílio consiste de um axoneme à base de microtúbulos, normalmente estruturada em nove duplas de microtúbulos dispostos radialmente com ou sem um par central de microtúbulos singletos. A estrutura axonemais define o tipo e modo de acção ciliar. O arranjo de microtúbulos 9 + 2 confere a motilidade do cílio, onde é utilizada no movimento de fluidos através de superfícies epiteliais. A configuração 9 + 0 é não móveis, mas acredita-se principalmente a função em eventos de sinalização celular 17. Além de CKD, as conseqüências da disfunção ciliar são um conjunto de característicasciliopathy características que incluem, obesidade, degeneração da retina, polidactilia, e disfunção cognitiva 16. No entanto, a DRC está entre as mais prejudiciais para a qualidade de vida do paciente e, portanto, uma importante força motriz por trás do desenvolvimento adequado em modelos in vivo para ciliar relacionado CKD. O peixe-zebra é um excelente modelo para compreender a etiologia da doença genética humana. O seu desenvolvimento rápido, a produção de um grande número de ovos, tecido transparente, e crescimento ex utero permite que os processos de desenvolvimento de peixe-zebra para ser visualizado e eventos biológicos manipulados com facilidade considerável. Genes podem ser geneticamente alterada usando o recente sucesso de ferramentas de edição do genoma (CRISPR 18 e TALENS 19), derrubou usando antisense tecnologia morfolino 20, ou farmacologicamente regulado pela adição de compostos ao seu ambiente aquático. De fato, peixe-zebra oferecer uma plataforma para realizar experiments que não são permissivas em outros modelos animais. Embora peixe-zebra são animais vertebrados relativamente simples (em comparação com os seres humanos) que partilham muitos órgãos funcionalmente conservadas, genes e processos de sinalização em comum com os seres humanos. Por exemplo, o rim do peixe-zebra é notavelmente semelhante em estrutura e função de comparação para os seres humanos 21,22. No entanto, ao contrário do rim de mamíferos que se desenvolve através de uma sucessão de fases, cada uma marcada por um rim mais desenvolvida (pronephros, mesonephros e metanephros), o peixe-zebra embrionário desenvolve apenas um pronephros, a forma mais imatura de um rim. Enquanto milhões de nefrónios podem ser encontrados formando os blocos de construção de rim de mamífero, o embrião do peixe-zebra possuem apenas dois. Os glomérulos, que permitem o filtrado do sangue inicial, são fundidos na linha média ventral apenas para a aorta. Filtros de sangue através dos glomérulos nos túbulos pronephric que correm caudalmente ao longo do eixo, fundindo antes de sair através da cloaca. O pronephric tutúbulos são fortemente ciliada com cílios motilidade que são permissivas para o fluxo de filtrado para o caudal de saída de 3,4. Esta estrutura pronephric simples mantém a homeostase do peixe-zebra através de várias semanas de crescimento larval onde eventualmente evoluir para uma estrutura mais complexa mesonephros 21. No entanto, o peixe-zebra nunca desenvolve um metanephros 21. Apesar das idiossincrasias de peixe-zebra, o néfron peixe-zebra é segmentado, com perfis de expressão gênica iguais aos observados em mamíferos e, portanto, oferece uma inigualável no modelo vivo para nefrogênese 3,22. Rotineiramente, os pacientes são testados quanto à função renal através de uma série de análises de sangue e urina. Tipicamente, o sangue é analisado por sais dissolvidos, ureia e creatinina. Altos níveis de ureia, creatinina e concentrações anormais de sal são indicativas de problemas com a função renal. O exame de urina usando uma vareta colorimétrico detecta níveis anormais de proteínas, Blood, pus, bactérias e açúcar presente em amostras de urina. Tais ensaios requerem normalmente cerca de 30 ml de urina ou de 5 - 10 ml de sangue. Tem sido difícil de traduzir estes tipos de ensaios para pequeno em organismos modelo in vivo, tais como o peixe-zebra, principalmente devido à natureza impossível de recolha de sangue ou de urina suficiente para realizar o ensaio. Aqui, vamos abordar a falta de testes de função do rim zebrafish adequadas e descrever uma técnica inovadora para o seu estudo. Ao injectar um corante fluorescente para a corrente sanguínea que são capazes de monitorizar e quantificar individualmente ao longo do tempo a filtração e a excreção de actividade fluorescente a partir do sangue pelo rim. Este método pode ser usado para estudar os danos causados ​​por doença renal, que fornecem um exemplo de.

<table><tbody><tr><td>P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td><td>Intracel</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>borosilicate standard wall capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>VWR International</td><td>631-0109</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resin Glue</td><td>Evo-Stik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>D-1824</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>air compressor&amp;nbsp;</td><td>Jun-Air</td><td>OF302-15</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III&amp;nbsp;</td><td>Parker Instruments&amp;nbsp;</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>compact 3-axis control micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>Marzhauser</td><td>MM33&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>stage micrometer&amp;nbsp;</td><td>Pyser- SGI</td><td>02A00404</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

O embrião de peixe-zebra oferece um modelo tratável para estudar a organogênese e modelo de doença genética humana. Apesar da sua relativa simplicidade, o rim do peixe-zebra e desenvolve funções em quase da mesma maneira como os seres humanos. Uma diferença importante na construção do rim humano é a presença de milhões de nefrónios em comparação com o peixe-zebra que possui apenas dois. No entanto, simplificando um sistema tão complexo em unidades funcionais básicas ajudou nossa compreensão de como o rim desenvolve e opera. No peixe-zebra, a linha média localizada glomérulo é responsável pela filtragem do sangue inicial em duas túbulos pronephric que divergem para funcionar bilateralmente a partir do eixo embrionário antes da fusão para o outro na cloaca. Os túbulos pronephric são fortemente povoada por cílios motilidade que facilitam a circulação de filtrado ao longo do túbulo segmentada, permitindo a troca de vários solutos antes de finalmente sair através da cloaca 2-4. Muitos genes responsáveis ​​pela DRC, including aqueles relacionados à ciliogênese, têm sido estudadas em peixes-zebra 5. No entanto, um grande atrativo para trás tem sido a dificuldade em avaliar a função renal zebrafish após manipulação genética. Ensaios tradicionais para medir a disfunção renal em humanos provaram não translacional de peixe-zebra, principalmente devido ao seu ambiente aquático e pequeno porte. Por exemplo, não é fisicamente possível para extrair sangue de peixes embrionários encenado para análise do teor de ureia e creatinina, como eles são muito pequenos. Além disso, o peixe-zebra não produzem urina suficiente para testar em um simples proteinúria &#39;vareta&#39;, que muitas vezes é realizado durante os exames iniciais dos pacientes. Descreve-se um ensaio fluorescente que utiliza a transparência óptica do peixe-zebra para monitorar quantitativamente a depuração de um corante fluorescente, ao longo do tempo, a partir da vasculatura e para fora através do rim, para dar uma leitura de função renal 1,6-9.

A síndrome de Bardet-Biedl (BBS) é um ciliopathy heterogêneo rara que afeta cerca de 1: 160 mil pessoas em todo o mundo 16. Os pacientes apresentam uma série de problemas associados, incluindo rins policísticos, posteriormente pacientes frequentemente necessitam de diálise ou transplante renal 24. ESRF é a causa mais comum de morte em BBS, com cerca de 30% dos pacientes em desenvolvimento CKD 16. Actualmente, 20 genes não relacionados têm sido implicados em BBS sem associação genótipo-fenótipo publicada. As proteínas BBS compartilhar domínios localização de proteínas comuns no âmbito das instâncias cilium e basal que, juntamente com os traços característicos dos pacientes, inferir um diagnóstico ciliopathy. BBS9 codifica B1 Parathyoid Hormone-responsive proteína (PTHB1) que, juntamente com outro BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteínas formam o núcleo BBSome complexo responsável pela formação do cílio primária 24. Mutações em conta BBS9 para 6% do BBS cases 24. Além disso, a PTH tem sido implicada na formação de quistos nos rins, através da promoção da proliferação de células do epitélio renal, o que sugere que a perda de função bbs9 no peixe-zebra pode exibir defeitos renais 25. Os relatórios anteriores usando um modelo de peixe-zebra bbs9 knockdown excluir uma descrição do rim, apresentando a oportunidade de demonstrar o ensaio de função renal descrito 26. Knockdown da função bbs9 foi conseguida através da injecção no peixe-zebra, na fase de 1 a 4 células, um morfolino anti-sentido para bloquear a tradução de genes específicos bbs9 e em paralelo um controlo negativo morfolino padrão contra uma mutação em intrónica humano beta-globina (4 ng bbs9 MO, seqüência: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA e controle 4 ng MO, seqüência: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Nós descobrimos que a perda da função bbs9 resultou em 40% dos embriões que apresentam cistos pronephric por 5 dpf, sugerindo que este foi um modelo apropriado para analisarfunção renal utilizando o teste de eliminação de dextrano rodamina. Observou-se que os peixes morphant têm uma redução significativa na sua capacidade para limpar o corante fluorescente depois dos 24 hpi comparação com os controlos (Figura 3) - con: 14,8 ± 1,2 SEM, n = 9; MO bbs9: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; desemparelhado valor P t-teste: 0,002). Para descartar a possibilidade de que uma redução da depuração poderia ser devido à diminuição da circulação sanguínea, os embriões foram avaliados para células batimentos cardíacos e sanguíneos de recirculação, tanto o controle e peixes morphant teve freqüência cardíaca comparável e fluxo sanguíneo. Estes dados indicam que a função renal está prejudicada em morphants bbs9. De fato, os embriões morphant bbs9 desenvolver túbulos pronephric císticas simultâneas com o observado em pacientes BBS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52540/52540fig1highres.jpg" width="700" /> Figura preparação 1. Equipamentose set-up. Capilares (A) de borosilicato deve ser puxado para microinjeção usando um extrator de agulha apropriada. A agulha é necessário acabar com uma pinça (linha tracejada) para permitir a RD para sair da agulha, deve-se tomar cuidado para não quebrar a agulha muito render uma agulha que não pode ser calibrado. Barra de escala:. 200 mm (B) Um molde de agarose para a manipulação de embriões e orientação pode ser formado colando lâminas de vidro e pipetas de plástico (C) O padrão microinjeção set-up.. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura .</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52540/52540fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Microinjeção de rhodamine dextrano no saco pericárdio. (A) Calibrar o tamanho de gota a 10 incexigên- (100 mm) em um palco retícula de 1 mm. (B) O posicionamento correto da agulha (setas pretas) para a marcação a intersecção entre o arco faríngeo caudal, saco vitelino e coração vai facilitar a perfuração do tecido (seta) fenda. Barra de escala:. 200 mm (C) Rhodamine dextrano pode ser visto rapidamente absorvido por toda a vasculatura (setas brancas). 100 px duas regiões de interesses abrangendo um coração centralizado (quadrado amarelo) deve ser usado para fazer medições de o valor de cinza médio e, portanto, de pixel / intensidade de fluorescência. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52540/52540fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Knockdown de bbs9 provoca defeito func rimção no peixe-zebra. (A) Os embriões injectados no pericárdio com rodamina dextrano a 3 hpi e 24 hpi, topo e fundo de dois painéis, respectivamente, em qualquer controlo ou embriões bbs9 morphant. As setas indicam o coração; seta indica a formação de um quisto pronephric. (B) Percentagem de intensidade fluorescente depois de 24 hpi remanescente no controle versus embriões bbs9 MO. As barras de erro mostrar o erro padrão da média (SEM), ** P ≤ 0,01. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

O peixe-zebra é uma ferramenta popular para modelar doença renal crônica (DRC). No entanto, seu pequeno tamanho torna impossível avaliar a função renal através de métodos tradicionais. Nós descrevemos um teste de eliminação fluorescente rim corante 1, que permite a análise quantitativa da função renal zebrafish em CKD.

Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K visualizações.  University College London.  O peixe-zebra é uma ferramenta popular para modelar doença renal crônica (DRC). No entanto, seu pequeno tamanho torna impossível avaliar a função renal através de métodos tradicionais. Nós descrevemos um teste de eliminação fluorescente rim corante 1, que permite a análise quantitativa da função renal zebrafish em CKD. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologia

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Um manual de tela pequena molécula Aproximando de alta capacidade Usando embriões Zebrafish

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modelo de lesão renal aguda induzida por cisplatina em zebrafish adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...