The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

Genel sözleri: NOT steril koşullar altında yumurta manipülasyonu ile ilgili tüm prosedürleri uygulayın ve steril tekniği buna göre kullanılmalıdır. % 70 etanol ile tüm ekipman kullanmadan önce ön-temiz. Genel olarak, influenza virüsü aşılama ve hasat BSL-2 laboratuvarda yapılmalıdır. Ancak, bu protokol yaymak için kullanıldığında çok daha patojenik grip virüsleri (örneğin, salgın ve pandemi öncesi suşları, kümes hayvanları ve hayvancılık, yüksek patojen kuş gribi suşları, 1918 H1N1 suşu için bir tehlike teşkil suşları), yüksek biyogüvenlik düzeyleri ve Bazı durumlarda, biyogüvenlik önlemleri ve izinler gereklidir. Yerel Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi grip virüsü ile ilgili tüm araştırmaları onaylaması gerekir. Aşılama için Yumurta 1. Hazırlık <ol><li> Uygun bir satıcıdan serum patojen içermeyen (SPF) taze döllenmiş yumurta kuş edinin. Tipik haliyle, tavuk yumurtası kullanılır. Yumurta bizi olmalıhemen girişte ed. </li><li> Otomatik yumurta turner ile nemlendirilmiş yumurta inkübatör varış yeri yumurta düzenli yumurta döndürmek için üzerine. Otomatik yumurta turner mevcut değilse, elle en az 2-3 kez bir gün (eldiven giymek ve mümkün olduğunca steril olarak her şeyi tutmak için emin olun) yumurta döndürün. </li><li> 37 ° C ve 10-11 gün boyunca% 55-60 nemde kuluçkaya. </li></ol> 2. Yumurta Mum <ol><li> Inkübasyon yaklaşık 7 veya 8 gün sonra candling ile infertilite yumurta kontrol etmek için karanlık bir odada bir parlak ışığa karşı yumurta incelemek için bir yumurta Candler kullanın. <ol><li> % 70 etanol ile yumurta Candler silin. Genellikle eldiven değiştirme ve patojenlerin kontaminasyon riskini en aza indirmek için% 70 etanol ile dezenfekte edin. </li><li> Inkübatör yumurta çıkarın ve boş yumurta kartonları koyun. </li><li> Odada ışıkları kapatın. </li><li> Candler karşı bir defada her yumurta bir büyük ucunu tutun. </li><li> Determin için yumurta uyunE o bereketli ya infertil olup olmadığını. NOT: Bir fasulye şeklinde embriyo giden İnce kan damarları açıkça görünür olmalıdır. Döllenmemiş yumurta görünür yumurta sarısı ile küçük bir kan nokta olarak görünecektir. </li></ol></li><li> Döllenmemiş yumurta olan atın ve inkübatör canlı yumurta dönün. Fazla 30 dakika inkübatör dışında yumurta bırakmayın. Bir yumurtanın durumu teyit edilememesi halinde, bunu işaretleyin ve daha sonra gözlemlemek. </li></ol> Virüs İnokulum 3. hazırlanması <ol><li> 10 mM HEPES (pH 7.4) ihtiva eden steril PBS içinde 10 4 pfu / ml - yaklaşık 10 ila 3 grip virüsü stokunu. Kritik adım: kullanımdan hemen önce virüs stokunu ve buz üzerinde her zaman seyreltilmiş virüs tutmak. </li></ol> Alantoik Rota aracılığıyla 4. Grip Virüsü Aşılama <ol><li> Virüs inokülasyonundan (gün 10 ve 11) gün, daha yumurta mum ve herhangi bir ölü embriyolar ortadan kaldırır. Canlı embriyoların ayırtyumurta içinde hareket arıyor. </li><li> Inkübatör üç yumurta çıkarın ve hava kesesi kadar ayrı bir tutucu yumurta düzenlemek. </li><li> Kalıcı bir kalem ile yumurta hava sahasını işaretleyin. </li><li> % 70 etanol ile hava alanı üzerinde eggshell yıkayın. </li><li> Bir yumurta karton ve bir biyogüvenlik kaput (BSL-2) içine hava boşluğu yukarı yumurta koyun. </li><li> Her bir yumurta hava torbasının hemen üzerinde bir kabuk içinde küçük bir delik açmak için bir steril 18G iğne kullanın. Embriyo veya sarısı bıçaklama önlemek için çok derinden iğne eklemek için dikkatli olun. </li><li> Steril 1 ml şırınganın içine seyreltilmiş grip virüsü çizin ve bir 22G iğne takın. </li><li> Dikkatle allantoik boşluğuna 45 ° açıyla iğne ile şırınga ilerlemek. </li><li> Seyreltilmiş grip virüsünün 0.2 ml enjekte edilir. </li><li> Diğer iki yumurta enjeksiyon tekrarlayın ve sonra şırınga ve iğne atın. </li><li> Bir tutkal tabancası (ya da erimiş parafin mumu) den tutkal bir damla ile delik mühür. Be tutkal yumurta içinde sızıntı olmadığını dikkatli. </li><li> Hava alanı yukarı çekti yumurta kuvöz içine yumurta geri yerleştirin. </li><li> Tekrarlayın 4.2 adımları - 4.12 tüm yumurtaları aşılanmış kadar. </li></ol> 5. İnkübasyon Süresi <ol><li> 37 ° C&#39;de ve •% 60 nemde açmadan enfekte yumurta inkübe edin. </li><li> Grip virüsü tipine bağlı olarak optimum inkübasyon süresi seçin. 48 saat boyunca influenza A inkübe; 72 saat grip B ve C kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 6. Grip Virüsü Hasat <ol><li> İnkübasyon süresinden sonra, embriyo öldürmek ve kan ile enfekte alantoik akışkan kontrol etme riskini azaltmak için kan damarları, 4 saat (ya da O / N), en az 4 ° C &#39;de yumurta soğutun. Verimi azaltır virüs, emici kırmızı kan hücrelerini engellemek için bunu yapın. Seçenek olarak ise, soğuk yumurta, 30 dakika boyunca -20 ° C &#39;de; Bununla birlikte, bu, kan kirlenme riskini arttırır. </li><li> Yumurta yeterince soğutulmuş olmuştur sonra, bir biyogüvenlik kaput yumurta transferi. Hava kesesi yukarı bakacak şekilde bir firma tutucu içine yumurta yerleştirin. % 70 etanol ile yumurta yüzeyini temizleyin. </li><li> Hava kesesi üzerindeki kabuğu açmak için steril makas kullanın. Koryoalantoik zar yok etmek değil dikkat ederek hava kesesi etrafında kabuk çıkarın. </li><li> Steril künt forseps ile koryoalantoik zar açın. Yavaşça embriyo ve küçük bir spatula ya da kaşık ile yumurta sarısı kesesi kenara taşıyın. Sarısını yırtılmasına dikkat edin. </li><li> 1 ml&#39;lik bir Eppendorf pipet yardımıyla, allantoik akışkanın toplanması. Gerekirse, yan biraz kadar sıvı mümkün olduğunca toplamak için yumurta eğin. </li><li> 50 ml&#39;lik plastik konik tüp içine bütün yumurta, allantoik akışkanın birleştirin. Virüs hasat sırasında her zaman buz üzerinde tüpler tutun. Bir yumurta verimi 5 - hafif sarımsı bir sıvı 10 mi. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de virüs içeren alantoik akışkan Spin6, C yıkıntıları pelet haline getirildi. Yeni 50 ml tüp içine net sıvıyı aktarın buz tuttu. Bir BSL-2 atık kabına yumurta bertaraf edin. </li></ol> 7. Depolama <ol><li> Hemen allantoik açıklık sıvının (örneğin, 50, 100 veya 500 ul tümbölenler) bölmeyin ve ek-freeze sıvı azot içinde. Dondurulmuş virüs stokları, uzun süreli depolama için -80 ° C dondurucu transfer. </li></ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States,+1976-2007.">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li><li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus.">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li><li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus:+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice.">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li><li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+and+the+challenge+for+immunology.">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li><li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuing+challenges+in+influenza.">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+15G.1+Influenza:+propagation,+quantification,+and+storage.+.">Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. .</a> Current protocols in microbiology. , (2006).</li><li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome.">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li><li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection.">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li><li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses.">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells).">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Grip hastalığının büyük bir küresel yük olur, ve iş akciğer hasarı 7 patogenezi anlayış içine devam ediyor. Bu ölümcül hastalık kolaylaştırdı araştırma, çeşitli yöntemler grip virüsü 6 yaymak için geliştirilmiştir. Burada, biz tavuk yumurtası influenza virüsü üretmek için bir tekniği açıklar. Bu yöntemin avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve çoğu zaman, in vitro çalışmalar için gerekli olan yüksek titre grip virüsü hisse senetleri, büyük miktarlarda elde edilir. Çoğu laboratuarlar az başlangıç ​​maliyetleri ile hızlı ve kolayca bu protokolü geliştirmek mümkün olacak. Biz otomatik turner ile bir yumurta inkübatör yatırım tavsiye rağmen, bu protokol böyle bir ekipman olmadan tamamlanmış olabilir, ancak daha zahmetli olacaktır. Biz de yumurta tutarlılığını ve sterilite garanti döllenmiş yumurta alımı için ticari araştırma satıcıları kullanmanızı öneririz. Laborat Ofisiİnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Servisi (PHS) Politikanın ORY Hayvan Refahı (OLAW) yorumlanması PHS politikası Yumurtadan çıktıktan sonra geçerlidir canlı embriyone kuş yumurta araştırma kullanımı için devletler. Bu nedenle, çoğu kurum bu protokol için IACUC onayı gerektirmez. Ancak, politikalar kurumlar arasında değişir ve Kurumsal Biyogüvenlik Kurulu onayı bu protokolü başlamadan önce gerekli olacaktır. Virüs ile çalışırken, enfekte embriyo yumurta allantoik sıvının hasat sonra 4 ° C&#39;de virüs tutmak için her şeyden önemlidir. Her yumurta allantoik sıvı 5-10 ml arasında üretmesi beklenen ve titre influenza virüsünün suşu bağlıdır. Bizim laboratuvar rutin bir fare adapte H1N1 grip suşu (A / PR / 8/34) yaymak için bu yöntemi kullandı. Bu protokolünün p klinik örnekler için de kullanılabilir, ancak bu durumda, amniyotik boşluğun aşılama tercih edilebilir2,6-bağlantılı sialik asit resence amniyotik astar 8,9 olan bağlanma için gerekli. Başka bir göz bu yöntem nedeniyle embriyo patojenisiteye yayılma Avian influenza virüslerinin (örn, H5N1 suşları) için ideal olmayabilir olmasıdır. Grip virüsü titering çeşitli yöntemler kendi avantaj ve dezavantajları var olan tüm geliştirilmiştir. Gerçekten de, viral miktar olabilir protein bazlı (örneğin, hemaglutinin testi, ELISA), bir nükleik asit bazlı (örneğin, kantitatif PCR) ya da işlevsel (örneğin, virütik plak deneyi) 6. Fonksiyonel olmayan tahliller olursa olsun yaşayan ya da ölü viral parçacıkların ise toplam viral titreleri belirleyecektir. Bu nedenle, grip virüsünün bulaşıcı aktivitesi için test Canlı virüs ölçülmesi ve bir partiden bir diğerine karşılaştırılabilir işlevsel denklik için izin verir. Plak oluşturan deneyi canlı grip vir titreleri değerlendirmek yaygın olarak kullanılan bir testtirBize, ama yavaş ve 10 gerçekleştirmek için hantal olabilir. Buna karşılık, hemagglutinin deneyi basit ve anlaşılır, ama canlılığını değerlendirmek değil ve tüm influenza partikülleri belirler. Burada, yüksek titre grip virüsü yaymak için nispeten kolay bir yöntem sağlar. Bir laboratuvarda bu protokolün de novo başlatılması basittir, ve başlangıç ​​maddeleri ve ekipmanları nispeten ucuzdur.

Grip A insan sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam ediyor. Büyük bir küresel yük dünya çapında yılda 1 500.000 ölüme kadar neden olan bir yıkıcı solunum hastalığıdır. Grip virüsleri ailesi Orthomyxoviridae olup genomları 1,2, 8 negatif sens, tek iplikçikli RNA taşır. Viral genomun yüksek değişebilirlik (yani, antijenik &quot;sürüklenme&quot;) uzun vadeli bağışıklık engeller. Ayrıca, grip, anti-viral ilaçlar 3 giderek dayanıklıdır. 2009 H1N1 pandemik influenza hastalığının (pandemik suşu anti-viral direnç, gecikmiş aşı üretimi) ile ilgili tüm zorlu konuları vurgulanır. Aşı formülasyonu büyük olasılıkla patojenik influenza suşları 4 (H1N1, H3N2 ve İnfluenza B için birer adet) için Dünya Sağlık Örgütü tarafından her yıl belirlenir. Bu yöntem tahmin grip suşu dayandığındans, patojen suşları bazen yanlış tespit ve aşı etkinliği önemli ölçüde düşer vardır. Ayrıca, yeni grip suşları görünümü pandemik hastalık 2 neden bu koruyucu programları aşmak olabilir. evrensel grip aşısının oluşturulması 5 zor olmuştur. Bu nedenle, araştırma akciğer hasarının patogenezinde anlamak içine devam etmelidir. Tesis laboratuar araştırmaları için, çeşitli yöntemler viral izolasyon ve yayılma 6 geliştirilmiştir. İnsan grip virüsleri, memeli hücre çeşitli substratlar olarak amplifiye edilebilir. Bununla birlikte, büyük miktarlarda üretilmesi yüksek titre virüsleri iyi embriyo haline gelmiş yumurtalardan elde edilmektedir. Aşağıdaki protokol grip için mevcut virüs stoklarından bir virüs yayılımını ve depolama tekniğini açıklar.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Cellgro&amp;nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs&amp;nbsp;</td><td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>humidified egg incubator&amp;nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>automatic egg turner</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3200</td><td></td></tr><tr><td>egg candler</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3300&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>diluted to 70% using water</td></tr><tr><td>glue gun &quot;Ad tech Hi Temp Project Pro&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Model 1105</td><td></td></tr><tr><td>glue &quot;Ad tech MINI SIZE, Multi Temp&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>MDCK cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

influenza virus propagation in embryonated chicken eggs

Grip enfeksiyonu yaklaşık 36.000 ölüm ve Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 200.000 &#39;den fazla hastaneye yatış her yıl ile ilişkilidir. Mutasyon ve yeniden çeşitler nedeniyle yeni influenza virüs türlerinin sürekli ortaya çıkması virüsün kontrol komplike ve yeni ilaçların ve aşıların kalıcı geliştirilmesini gerekli kılmaktadır. Grip laboratuar tabanlı çalışma virüsün yayılması için güvenilir ve maliyet-etkin bir yöntem gerektirir. Burada, bir kapsamlı protokol sürekli olarak yüksek titre virüs stokları elde edilir verimli tavuk yumurta influenza A virüs yayılması için sağlanır. 11 gün - Kısaca, serum patojen içermeyen (SPF) döllenmiş tavuk yumurtası 37 ° C ve 10% 55-60 nemde bekletilir. Bu süre içinde, embriyo gelişimi kolaylıkla bir yumurta Candler kullanılarak izlenebilir. Virüs aşı, bir iğne ile allantoik oyuğuna virüs stokunun püskürtülmesiyle gerçekleştirilir. 37 ° C&#39;de inkübasyon 2 gün sonra yumurta4 ° C&#39;de en az 4 saat süre ile donduruldu. Hava kesesi ve chorioallantoic membran üzerinde yumurta kabuğu sonra dikkatlice açılır, ve virüs içeren allantoik sıvı hasat edilir. sıvı, santrifüj ile etrafı temizlenmiş alikotlandı ve uzun süreli depolama için -80 ° C&#39;ye kadar aktarılır. büyük miktarda, genellikle, bu protokol ile elde edilir ve yüksek virüs titresi (bir virüs içeren yumurta başına sıvının 5-10 mi) büyük miktarlarda ihtiyaç in vitro çalışmalar için, özellikle, virüs preparatı eden uygun bir yöntem için yumurta kullanımını yapmıştır virüs içinde, aynı virüs stokunun yüksek dozlar gereklidir.

Çeşitli yöntemlerle grip virüsü titre edilmesi için geliştirilmiştir. Uygun bir yöntem seçerek Bir göz bazı canlı viryonlarını değerlendirecek olan, ne olursa olsun başkalarının enfekte dayalı ise canlılığı (örneğin, hemaglutinin deneyi) toplam parçacıkları tespit olduğunu (örneğin, plak deneyi) 6. Burada, bir fare adapte influenza virüsü (A / PR / 8/34) ile aşılanır tavuk yumurtalarından elde alantoik akışkan viral titresi plak deneyi (Şekil 1) ve hemaglüsinasyon tahlilinde (Şekil 2) ile tespit edilmiştir. Grip virüsü enfeksiyonu hücrelerin bir mono-tabakası üzerinde meydana getirmek üzere plaklar neden sitopatik etkiler (tabii tutulan parçalanmış hücrelerin dairesel bölgeleri) neden olur. Plaklar kristal mor ile boyanması ile görselleştirilmiştir ve 65 plaklar virüsün 10 -12 seyreltme (Şekil 1) ile birlikte oyuk içinde sayılmıştır. Seyreltilmiş viral stokunun 500 L w Çünkühücreleri üzerine yerleştirilmiş olarak, son titre 1.3 x 10 ila 14 PFU / ml &#39;dir. hemaglütinasyon testi kırmızı kan hücrelerinin yüzeyine bağlamak için virüsün yeteneği ile ilgili influenza virüsü bazları titre edilmesi için bir yöntemdir. Bir viral süspansiyon böylece süspansiyon yerleşmesini engelleyen, kırmızı kan hücreleri aglütine olacaktır. 96 çukurlu bir plaka (V ya da yuvarlak tabanlı) virüsün seri seyreltileri kullanılarak ve kırmızı kan hücrelerinin belirli bir miktar eklenerek, viral titrasyon belirlenebilir. 50 ul (Şekil 2) virüsün 2 10 seyreltme: Bir açık bir şekilde negatif sonuç 1 ile gözlenmiştir. Bu nedenle, son titre 2,1 x 10 4 HAU / ml&#39;dir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52421/52421fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Niceleme plak tahlili ile PR8 Virüs titresi. MDCK hücreleri bir tek tabakalı 10-kat seria bulaşmış olanPR8 l seyreltmeleri (10 -1 - 10 -12), 1 saat boyunca karıştırılmış, yıkanmış ve daha sonra% 0.6 agaroz çözeltisi ile kaplanmıştır. 72 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edildikten sonra, ağar dikkatlice uzaklaştırılmış ve hücreler, sabit ve% 0.25 kristal mor ile boyandı. Plak oluşumu bulaşmamış kontrol (ctr) karşılaştırmak edildi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52628/52628fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52421/52421fig2highres.jpg" /> Titre Yumurta türevli PR8 grip virüs Şekil 2. Hemaglutinasyon (HA) Deneyi. PR8 virüsünün seri PBS içinde 2 kat seyreltildi ve% 0.5 hindi, kırmızı kan hücreleri 50 ul ile karıştırıldı. Seyreltmeler, dörtlü hazırlandı ve resimleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra alınmıştır. Olumsuz sonuçlar olumlu sonuçlar ise kuyuların merkezi noktalar olarak görünürkuyu boyunca düzgün bir kırmızımsı bir renk oluşturur. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52628/52628fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs at JoVE.com

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

influenza-virus-propagation-in-embryonated-chicken-eggs

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.1K Görüntüleme.  Cedars-Sinai Medical Center. Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Video: Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Kanser Araştırmaları

Using Chicken Embryo as a Powerful Tool in Assessment of Developmental Cardiotoxicities

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is well-defined, and it is relatively easy to achieve precise and timely exposure via multiple methods. Moreover, the process of heart development in chicken embryos is similar to mammals, also resulting in a four-chambered heart, making it a valuable alternative model in the assessment of developmental cardiotoxicities. In our lab, the chicken embryo model is routinely used in the assessment of developmental cardiotoxicities following exposure to various environmental pollutants, including per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), particulate matter (PMs), diesel exhaust (DE) and nano materials. The exposure time can be freely selected based on the need, from the beginning of development (embryonic day 0, ED0) all the way to the day prior to hatch. The major exposure methods include air-cell injection, direct microinjection, and air-cell inhalation (originally developed in our lab), and the currently available endpoints include cardiac function (electrocardiography), morphology (histological assessments) and molecular biological assessments (immunohistochemistry, qRT-PCR, western blotting, etc.). Of course, the chicken embryo model has its own limitations, such as limited availability of antibodies. Nevertheless, with more laboratories starting to utilize this model, it can be used to make significant contributions to the study of developmental cardiotoxicities.

Chicken embryos, as a classical developmental model, are used in our lab to assess developmental cardiotoxicities following exposure to various environmental contaminants. Exposure methods and morphological/functional assessment methods established are described in this manuscript.

Gelişimsel Kardiyotoksikliklerin Değerlendirilmesinde Tavuk Embriyosunun Güçlü Bir Araç Olarak Kullanılması

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is ...

Gelişim Biyolojisi

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Biyoloji

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering exogenous materials into chicken embryos has a great advantage for studying gene function, transgenic breeding, and chimera preparation during embryonic development. Here we show the method of in ovo intravascular injection whereby exogenous materials such as plasmid vectors or modified primordial germ cells (PGCs) can be transferred into donor chicken embryos at early developmental stages. The results show that the intravascular injection through the dorsal aorta and head allows injected materials to diffuse into the whole embryo through the blood circulatory system. In the presented protocol, the efficacy of exogenous plasmid and lentiviral vector introduction, and the colonization of injected exogenous PGCs in the recipient gonad, were determined by observing fluorescence in the embryos. This article describes detailed procedures of this method, thereby providing an excellent approach to studying gene function, embryo and developmental biology, and gonad-chimeric chicken production. In conclusion, this article will allow researchers to perform in ovo intravascular injection of exogenous materials into chicken embryos with great success and reproducibility.

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

The overall goal of this paper is to describe how to perform in ovo intracellular injection of exogenous materials into chicken embryos. This approach is very useful to study the developmental biology of chicken embryos.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...