Name: influenza virus propagation in embryonated chicken eggs
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs at JoVE.com

The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

ملاحظة: ملاحظات عامة: تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على التلاعب في البيض تحت ظروف معقمة، وينبغي استخدام تقنية معقمة وفقا لذلك. قبل تنظيف جميع المعدات مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام. وبصفة عامة، ينبغي إجراء التلقيح فيروس الإنفلونزا، والحصاد في مختبر BSL-2. ومع ذلك، إذا تم استخدام هذا البروتوكول لنشر أكثر من ذلك بكثير المسببة للأمراض فيروسات الأنفلونزا (على سبيل المثال، والسلالات الوبائية وما قبل الوباء، والسلالات التي تشكل خطرا على الدواجن والماشية، سلالات أنفلونزا الطيور الشديدة الإمراض، وH1N1 سلالة 1918)، وارتفاع مستويات السلامة الأحيائية و في بعض الحالات، يطلب من احتياطات الأمن الحيوي والتراخيص. وينبغي للجنة السلامة الأحيائية المؤسسية المحلية الموافقة على جميع البحوث المتعلقة بفيروس الأنفلونزا. 1. إعداد بيض للتلقيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيض (SPF) خالية من مسببات الأمراض المخصبة حديثا المصل الطيور من بائع مناسبة. عادة، يتم استخدام بيض الدجاج. يجب أن يكون لنا البيضإد فور وصوله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على بيض مكان الوصول في حاضنة البيض مرطب مع تيرنر البيض التلقائي لتدوير البيض بانتظام. إذا كان تيرنر البيض التلقائي غير متوفر، وتناوب يدويا البيض على الأقل 2-3 مرات في اليوم (تأكد من ارتداء القفازات وإبقاء كل شيء كما عقيمة ممكن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ عن 10-11 يوما. </li></ol> تشميع 2. البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كاندلر البيض لفحص البيض ضد الضوء الساطع في غرفة مظلمة للتحقق البيض للعقم قبل تشميع بعد حوالي 7 أو 8 أيام من الحضانة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح كاندلر البيض مع الايثانول 70٪. تغيير القفازات في كثير من الأحيان وتعقيم مع الايثانول 70٪ للحد من مخاطر التلوث عن طريق الجراثيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البيض من الحاضنة ووضعها في علب البيض الفارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطفاء الأنوار في الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نهاية كبيرة من كل بيضة واحدة في وقت واحد ضد كاندلر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة البيض إلى determinه إذا كان خصبة أو العقم. ملاحظة: الأوعية الدموية رقيقة مما يؤدي إلى الجنين على شكل حبة وينبغي أن تكون واضحة للعيان. سوف تظهر بويضة غير مخصبة كما بقعة دم صغيرة مع صفار البيض وضوحا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل البيض التي هي غير مخصبة، والعودة البيض قابلة للحياة إلى الحاضنة. لا تترك البيض من خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة. إذا كانت حالة البويضة لا يمكن تأكيد، علامة عليه، والالتزام به في وقت لاحق. </li></ol> 3. إعداد فيروس اللقاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأسهم فيروس الأنفلونزا إلى حوالي 10 مارس - 10 أبريل PFU / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 10 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة). خطوة حاسمة: تمييع الأسهم فيروس فورا قبل الاستخدام والحفاظ على فيروس المخفف على الجليد في كل وقت. </li></ol> 4. فيروسات الأنفلونزا التلقيح عن طريق السقاء الطريق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم التلقيح فيروس (يوم 10 أو 11)، شمعة البيض مرة أخرى والقضاء على أي أجنة ميتة. تمييز الأجنة الحيةأبحث عن الحركة داخل البيضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ثلاث بيضات من الحاضنة، وترتيب البيض في حامل منفصل مع كيس الهواء فوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة المجال الجوي للبيض مع علامة دائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل قشر البيض فوق المجال الجوي مع 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البيض مع مساحة الهواء في كرتون البيض وإلى غطاء للسلامة الأحيائية (BSL-2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة معقمة 18G لكمة ثقب صغير في وعاء على كيس الهواء من كل بيضة. يجب الحرص على عدم ادخال الإبرة عميقا جدا لتجنب طعن الجنين أو صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فيروس الانفلونزا المخفف إلى معقمة 1 مل حقنة ونعلق إبرة 22G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع بعناية المحاقن مع إبرة في زاوية 45 درجة في جوف السقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 0.2 مل من فيروس الانفلونزا المخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الحقن مع غيرها من اثنين من البيض، ومن ثم التخلص من المحاقن والإبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حفرة مع قطرة من الغراء من مسدس الغراء (أو ذاب شمع البارافين). Bالبريد الدقيق الذي الغراء لا تسرب داخل البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض مع وأشار المجال الجوي أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،2-4،12 حتى يتم تلقيح جميع البيض. </li></ol> 5. الحضانة الوقت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض المصابين دون تحول عند 37 درجة مئوية والرطوبة 60٪ ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الأمثل فترة حضانة تبعا لنوع فيروس الانفلونزا. احتضان الأنفلونزا A لمدة 48 ساعة. احتضان الإنفلونزا B و C لمدة 72 ساعة. </li></ol> 6. فيروسات الأنفلونزا الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة، هدئ البيض عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات (أو O / N) لقتل الجنين وانقباض الأوعية الدموية للحد من مخاطر تلوث السائل السقاء بعدوى الدم. هل هذا لمنع خلايا الدم الحمراء من امتصاص الفيروس، مما يقلل من العائد. بدلا من ذلك، البيض البرد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية؛ ولكن هذا يزيد من خطر تلوث الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن كان البيض المبردة بما فيه الكفاية، ونقل البيض إلى غطاء للسلامة الأحيائية. وضع البيض إلى حامل ثابت مع كيس الهواء مواجهة. تنظيف السطح البيض مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص العقيمة لفتح قشر البيض فوق كيس الهواء. إزالة القشرة حول كيس الهواء مع الحرص على عدم تدمير غشاء مشيمائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح غشاء مشيمائي مع ملقط حادة معقمة. بلطف التحرك جانبا الجنين وكيس الصفار مع ملعقة صغيرة أو ملعقة. الحرص على عدم تمزق صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 1 مل إيبندورف ماصة، وجمع بعناية السوائل السقاء. إذا لزم الأمر، إمالة البيض قليلا إلى الجانب لجمع السائل كما قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين السائل السقاء من جميع البيض في 50 مل أنبوب مخروطي البلاستيك. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات أثناء الحصاد الفيروس. غلة واحدة البيض من 5 - 10 مل من السائل مصفر قليلا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 46؛ C لتكوير الحطام. نقل السوائل واضحا في أنبوب جديد 50 مل أبقى على الجليد. التخلص البيض في وعاء النفايات BSL-2. </li></ol> 7. التخزين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة فورا أوضح سقائية السائل (على سبيل المثال، 50، 100 أو 500 مأخوذة UL) والمفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل. نقل مخزونات فيروس المجمدة إلى -80 ° C الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل. </li></ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States,+1976-2007.">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li><li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus.">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li><li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus:+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice.">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li><li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+and+the+challenge+for+immunology.">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li><li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuing+challenges+in+influenza.">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+15G.1+Influenza:+propagation,+quantification,+and+storage.+.">Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. .</a> Current protocols in microbiology. , (2006).</li><li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome.">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li><li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection.">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li><li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses.">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells).">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يسبب الإنفلونزا في العبء العالمي للمرض واسع، ويستمر العمل في فهم التسبب في إصابة الرئة 7. لبحث سهلت في هذا المرض الفتاك، وضعت أساليب مختلفة لنشر فيروس انفلونزا 6. هنا، نحن تصف تقنية لإنتاج فيروس الإنفلونزا في بيض الدجاج. وميزة هذه الطريقة هي أنها تكرار للغاية والنتائج في كميات كبيرة من مخزونات فيروس أنفلونزا عيار عالية، والتي غالبا ما تكون ضرورية للدراسات في المختبر. ومعظم المختبرات تكون قادرة على تطوير هذا البروتوكول بسرعة وبسهولة مع الحد الأدنى من تكاليف بدء التشغيل. على الرغم من أننا نوصي الاستثمار في حاضنة البيض مع تيرنر التلقائي، هذا البروتوكول يمكن أن تكتمل بدون هذه المعدات، ولكن سيكون أكثر شاقة. ننصح أيضا باستخدام الباعة البحوث التجارية لشراء البويضات المخصبة لضمان الاتساق والعقم من البيض. مكتب Laboratأوري رعاية الحيوان (OLAW) تفسير سياسة دائرة الصحة العامة (PHS) على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية ينص على استخدام البحوث البيض المحتوي الطيور الحية أن سياسة PHS لا تطبق إلا بعد الفقس. ولذلك، فإن معظم المؤسسات لا يتطلب موافقة IACUC لهذا البروتوكول. ومع ذلك، السياسات تختلف بين المؤسسات، وسوف تكون هناك حاجة موافقة لجنة السلامة الأحيائية المؤسسي قبل الشروع في هذا البروتوكول. عند العمل مع الفيروس، فإن من الأهمية بمكان للحفاظ على الفيروس في 4 C بعد حصاد السوائل السقاء من البيض المحتوي المصابة. يتوقع من كل بيضة لإنتاج ما بين 5-10 مل من السوائل السقاء، وعيار يعتمد على سلالة من فيروس الأنفلونزا. مختبرنا وقد استخدمت هذه الطريقة بشكل روتيني على نشر H1N1 سلالة الإنفلونزا تكييفها الماوس (A / PR / 8/34). ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها لالعينات السريرية، ولكن في هذه الحالة، التلقيح من تجويف الذي يحيط بالجنين قد يكون من الأفضل نظرا لصresence من الأحماض اللعابي المرتبطة 2،6 حاجة للربط داخل بطانة الذي يحيط بالجنين 8،9. وهناك اعتبار آخر هو أن هذه الطريقة قد لا تكون مثالية لانتشار فيروسات إنفلونزا الطيور (على سبيل المثال، سلالات H5N1) بسبب المرضية إلى الجنين. وقد تم تطوير طرق مختلفة من titering فيروس الانفلونزا وكلها لها مزاياها وعيوبها. في الواقع، يمكن أن يكون الكمي الفيروسي القائم على البروتين (مثل فحص راصة دموية، ELISA)، القائم على حمض (PCR على سبيل المثال، الكمي)، أو وظيفية النووي (على سبيل المثال، فحص اللوحة الفيروسي) 6. سوف المقايسات غير وظيفية تحديد إجمالي التتر الفيروسية بغض النظر إذا كانوا يعيشون أو الجسيمات الفيروسية الميتة. لذلك، واختبار للنشاط المعدية من فيروس الانفلونزا سوف قياس فيروسات حية والسماح لالتكافؤ الوظيفي مقارنة من الكثير الكثير. مقايسة تشكيل اللوحة هو الفحص المستخدمة الشائعة التي يمكن تقييم التتر من فير الإنفلونزا الحيلنا، ولكن يمكن أن تكون بطيئة ومرهقة لأداء 10. في المقارنة، الفحص راصة دموية هو بسيط ومباشر، ولكن لا تقييم الجدوى ويحدد جميع الجزيئات الأنفلونزا. هنا، ونحن نقدم طريقة سهلة نسبيا لنشر فيروس الانفلونزا عيار عالية. بدء من جديد من هذا البروتوكول في المختبر واضح ومباشر، والمواد والمعدات انطلاق غير مكلفة نسبيا.

الأنفلونزا A لا يزال يشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان. وهو مرض الجهاز التنفسي يمكن أن يكون مدمرا مع العبء العالمي الكبير يسبب ما يصل إلى 500،000 حالة وفاة سنويا حول العالم 1. فيروسات الأنفلونزا هي في الأسرة فيروسات مخاطية قويمة وتحمل 8-الشعور السلبي RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل في الجينوم من 1،2. التحولية عالية (أي الأنتيجين &quot;الانجراف&quot;) من الجينوم الفيروسي يمنع مناعة طويلة الأمد. وعلاوة على ذلك، الانفلونزا بشكل متزايد مقاومة للعقاقير المضادة للفيروسات 3. سلط الضوء على وباء انفلونزا H1N1 2009 جميع القضايا الصعبة المرتبطة بمرض أنفلونزا (سلالة وبائية، ومقاومة مضادة للفيروسات، وإنتاج لقاح تأخر). يتم تحديد تركيبة اللقاح سنويا من قبل منظمة الصحة العالمية لسلالات الأنفلونزا الأكثر احتمالا المسببة للأمراض (واحد في كل من H1N1، H3N2 وانفلونزا B) 4. لأنه يعتمد هذا الأسلوب على سلالة انفلونزا تنبأالصورة، وأحيانا تحديدها بشكل غير صحيح السلالات المسببة للأمراض وقطرات نجاعة اللقاح بشكل كبير. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ظهور سلالات الأنفلونزا الجديدة الالتفاف على هذه البرامج الوقائية المسببة للأمراض الوبائية 2. وقد تم إنشاء لقاح الأنفلونزا العالمي راوغ 5. لذلك، يجب أن تستمر الأبحاث في فهم التسبب في إصابة الرئة. لالبحوث المختبرية المرفق، وقد وضعت عدة طرق لعزل الفيروسية ونشر 6. يمكن أن فيروسات الأنفلونزا البشرية أن تتسع دائرة في مجموعة متنوعة من ركائز خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة لتحقيق توليد الفيروسات عيار عالية بكميات كبيرة في البيض المحتوي. يصف بروتوكول التالية تقنية لنشر فيروس الأنفلونزا A والتخزين من مخزونات فيروس القائمة.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Cellgro&amp;nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs&amp;nbsp;</td><td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>humidified egg incubator&amp;nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>automatic egg turner</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3200</td><td></td></tr><tr><td>egg candler</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3300&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>diluted to 70% using water</td></tr><tr><td>glue gun &quot;Ad tech Hi Temp Project Pro&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Model 1105</td><td></td></tr><tr><td>glue &quot;Ad tech MINI SIZE, Multi Temp&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>MDCK cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

influenza virus propagation in embryonated chicken eggs

ويرتبط عدوى الإنفلونزا مع حوالي 36،000 حالة وفاة وأكثر من 200،000 المستشفيات كل عام في الولايات المتحدة. ظهور المستمر من سلالات فيروس الإنفلونزا الجديدة بسبب طفرة وإعادة تشكيلة-يعقد السيطرة على الفيروس ويتطلب التطوير الدائم لأدوية جديدة واللقاحات. الدراسة المختبري للأنفلونزا تتطلب طريقة موثوق بها وفعالة من حيث التكلفة لنشر الفيروس. هنا، يتم توفير بروتوكول شامل للأنفلونزا A انتشار الفيروس في بيض الدجاج الخصبة والتي ينتج باستمرار عيار ارتفاع الأسهم الفيروسية. وباختصار، يتم تحضين خالية من مسببات الأمراض المصل (SPF) بيض الدجاج المخصب عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ لمدة 10 - 11 يوما. خلال هذه الفترة، تطور الجنين يمكن رصدها بسهولة باستخدام كاندلر البيض. ويتم التلقيح خارج الفيروس عن طريق الحقن من الأسهم الفيروس في جوف السقاء باستخدام إبرة. 2 بعد أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، والبيضمبردة لمدة 4 على الأقل ساعة على 4 درجات مئوية. قشر البيض فوق كيس الهواء وغشاء مشيمائي يتم بعد ذلك فتحت بعناية، ويتم حصاد السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس. تم مسح السوائل من الحطام بواسطة الطرد المركزي، aliquoted ونقل إلى -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. وقد جعلت كمية كبيرة (5-10 مل من السوائل في البيض التي تحتوي على فيروس) وفيروس عيار عالية والتي عادة ما يتحقق مع هذا البروتوكول استخدام البيض لتحضير فيروس أسلوبنا مواتية، ولا سيما بالنسبة للفي الدراسات المختبرية التي تتطلب كميات كبيرة من الفيروسات التي هناك حاجة جرعات عالية من الأسهم الفيروس نفسه.

وقد تم تطوير طرق متعددة لعيار الفيروس الأنفلونزا. واحد الاعتبار عند اختيار الطريقة المناسبة هي التي تحدد بعض مجموع الجسيمات بغض النظر عن جدوى (على سبيل المثال، راصة دموية الفحص) في حين تستند الآخرين على العدوى، والتي سوف تقيم virions قابلة للحياة (على سبيل المثال، فحص اللوحة) 6. هنا، تم تحديد عيار الفيروسية من السوائل السقاء تم جمعها من بيض الدجاج تلقيح مع فيروس الإنفلونزا تكييفها الماوس (A / PR / 8/34) عن طريق فحص اللوحة (الشكل 1)، ومقايسة التراص (الشكل 2). عدوى فيروس الانفلونزا يسبب تأثير الاعتلال الخلوي التي تنتج في لويحات (مناطق دائرية من الخلايا هي lysed) لتشكيل على أحادي الطبقة من الخلايا. وتصور اللوحات التي كتبها تلطيخ الخلايا مع الكريستال البنفسجي، واحصي 65 لويحات في البئر مع 10 -12 التخفيف من فيروس (الشكل 1). بسبب 500 L من الأسهم الفيروسية المخفف ثكما وضعت على الخلايا، وعيار النهائي هو 1.3 × 10 14 PFU / مل. مقايسة التراص هي طريقة لعيار قواعد فيروس الانفلونزا على قدرة الفيروس لنعلق على سطح خلايا الدم الحمراء. وهناك تعليق الفيروسي التصقت خلايا الدم الحمراء، وبالتالي منعهم من تسوية للخروج من الايقاف. باستخدام التخفيفات المسلسل من الفيروس في لوحة 96-جيدا (إما V- أو أسفل مستديرة) وإضافة كمية محددة من خلايا الدم الحمراء، ويمكن تحديد عيار الفيروسية. ولوحظ وجود نتيجة سلبية بشكل واضح مع 1: 2 10 التخفيف من الفيروس في 50 ميكرولتر (الشكل 2). ولذلك، فإن عيار النهائي هو 2.1 × 10 4 HAU / مل. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52421/52421fig1highres.jpg" /> الشكل 1. الكمي من PR8 فيروس العيار الحجمي التي كتبها البلاك الفحص. وقد يصاب أحادي الطبقة من الخلايا MDCK مع الدوري الايطالي 10 أضعافالتخفيفات لتر من PR8 (10 -1 - 10 -12) لمدة 1 ساعة، وغسلها، ثم مضافين مع حل الاغاروز 0.6٪. بعد مرور فترة الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة، تم إزالتها بعناية أجار، وتم إصلاح الخلايا وملطخة 0.25٪ الكريستال البنفسجي. تم مقارنة تشكيل اللوحة إلى عنصر تحكم غير المصابة (الظهور). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52628/52628fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52421/52421fig2highres.jpg" /> الشكل 2. التراص (HA) الفحص لالعيار الحجمي البيض المستمدة من فيروس أنفلونزا PR8. فيروس PR8 تم تخفيفه بشكل متسلسل 2 أضعاف في برنامج تلفزيوني ومختلطة مع 50 لترا من 0.5٪ تركيا خلايا الدم الحمراء. تم إعداد التخفيفات في quadruplicates، وأخذت الصور بعد 1 ساعة حضانة في RT. تظهر نتائج سلبية النقاط في المركز من الآبار بينما نتائج إيجابيةتشكيل اللون المحمر موحد في جميع أنحاء البئر. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52628/52628fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs at JoVE.com

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

influenza-virus-propagation-in-embryonated-chicken-eggs

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.0K Views.  Cedars-Sinai Medical Center. Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Video: Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

إنتاج فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار من سائل ألانتويك

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Cancer Research

Using Chicken Embryo as a Powerful Tool in Assessment of Developmental Cardiotoxicities

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is well-defined, and it is relatively easy to achieve precise and timely exposure via multiple methods. Moreover, the process of heart development in chicken embryos is similar to mammals, also resulting in a four-chambered heart, making it a valuable alternative model in the assessment of developmental cardiotoxicities. In our lab, the chicken embryo model is routinely used in the assessment of developmental cardiotoxicities following exposure to various environmental pollutants, including per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), particulate matter (PMs), diesel exhaust (DE) and nano materials. The exposure time can be freely selected based on the need, from the beginning of development (embryonic day 0, ED0) all the way to the day prior to hatch. The major exposure methods include air-cell injection, direct microinjection, and air-cell inhalation (originally developed in our lab), and the currently available endpoints include cardiac function (electrocardiography), morphology (histological assessments) and molecular biological assessments (immunohistochemistry, qRT-PCR, western blotting, etc.). Of course, the chicken embryo model has its own limitations, such as limited availability of antibodies. Nevertheless, with more laboratories starting to utilize this model, it can be used to make significant contributions to the study of developmental cardiotoxicities.

Chicken embryos, as a classical developmental model, are used in our lab to assess developmental cardiotoxicities following exposure to various environmental contaminants. Exposure methods and morphological/functional assessment methods established are described in this manuscript.

استخدام جنين الدجاج كأداة قوية في تقييم السموم القلبية التنموية

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is ...

Developmental Biology

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

وحيد الخلية في الأجنة ترنسفكأيشن الفرخ

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Biology

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering exogenous materials into chicken embryos has a great advantage for studying gene function, transgenic breeding, and chimera preparation during embryonic development. Here we show the method of in ovo intravascular injection whereby exogenous materials such as plasmid vectors or modified primordial germ cells (PGCs) can be transferred into donor chicken embryos at early developmental stages. The results show that the intravascular injection through the dorsal aorta and head allows injected materials to diffuse into the whole embryo through the blood circulatory system. In the presented protocol, the efficacy of exogenous plasmid and lentiviral vector introduction, and the colonization of injected exogenous PGCs in the recipient gonad, were determined by observing fluorescence in the embryos. This article describes detailed procedures of this method, thereby providing an excellent approach to studying gene function, embryo and developmental biology, and gonad-chimeric chicken production. In conclusion, this article will allow researchers to perform in ovo intravascular injection of exogenous materials into chicken embryos with great success and reproducibility.

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

The overall goal of this paper is to describe how to perform in ovo intracellular injection of exogenous materials into chicken embryos. This approach is very useful to study the developmental biology of chicken embryos.

في أوفو الحقن داخل الأوعية الدموية في أجنة الدجاج

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

إنتاج جسيمات الإنفلونزا المعدية العالية التهابات بالمغلفات بالبروتينات السكرية المسببة للامراض الشديدة H5N1 وفيروسات الطيور H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

النوكليوفوكساتيون وفي فيفو نشر طفيليات الايميريا الدجاج

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...