Name: influenza virus propagation in embryonated chicken eggs
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs at JoVE.com

The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

הערה: הערות כלליות: בצע את כל הנהלים הקשורים מניפולציה של הביצה בתנאים סטריליים, ויש להשתמש בי טכניקה סטרילית בהתאם. טרום נקי כל הציוד עם אתנול 70% לפני השימוש. באופן כללי, חיסון נגיף שפעת וקציר צריכים להתנהל במעבדה BSL-2. עם זאת, אם פרוטוקול זה משמש כדי להפיץ הרבה יותר פתוגניים נגיפי שפעת (למשל, זני מגיפה ומראש מגיפה, זנים שמהווים סכנה לעופות ובעלי חיים, זני שפעת עופות אלימים במיוחד, זן H1N1 1918), רמות בטיחות ביולוגיות גבוהות ו בחלק ממקרים, אמצעי זהירות ביטחון ביולוגי ואישורים נדרשים. ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית המקומית צריכה לאשר את כל המחקר מעורב נגיף שפעת. 1. הכנת הביצים להרכבת חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ביצי עופות לפתוגן חופשי (SPF) טרי מופרה סרום מספק מתאים. בדרך כלל, ביצי תרנגולת משמשות. ביצים צריכה להיות לנוed מייד עם הגעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ביצי מקום הגעה בחממה ביצת humidified עם טרנר ביצה אוטומטי כדי לסובב ביצים באופן קבוע. אם טרנר ביצה אוטומטי אינו זמין, לסובב ידני ביצים לפחות 2-3 פעמים ביום (הקפד ללבוש כפפות ולשמור הכל כסטרילי ככל האפשר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצים על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 ל10-11 ימים. </li></ol> Candling 2. ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קנדלר ביצה לבחון את הביצה נגד אור בהיר בחדר חשוך כדי לבדוק ביצים לבעיות פוריות בcandling לאחר כ -7 או 8 ימים של דגירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את קנדלר הביצה עם אתנול 70%. לשנות כפפות לעתים קרובות ולחטא עם אתנול 70% כדי לצמצם את הסיכון לזיהום על ידי פתוגנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הביצים מן החממה ולמקם אותם בקרטונים ביצים ריקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות בחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקצה הרחב של כל ביצה אחת בכל פעם נגד קנדלר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לביצה לdeterminדואר אם זה פורה או לא פורה. הערה: כלי דם דקים מובילים לעובר בצורת שעועית צריכה להיות ברור לעין. ביצים מופרה תופיע ככתם דם קטן עם חלמון ביצת עין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך ביצים כי הם מופרה, ולהחזיר את ביצי קיימא לחממה. אל תשאיר ביצים מחוץ לחממה עבור יותר מ -30 דקות. אם המצב של ביצה לא ניתן לאשר, לסמן אותו, ולבחון אותו מאוחר יותר. </li></ol> 3. הכנת הבידוד וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מניות וירוס שפעת לכ 10 מרס - 10 אפריל pfu / מיליליטר PBS סטרילי המכיל 10 מ&quot;מ HEPES (pH 7.4). צעד קריטי: לדלל את מניות הווירוס מייד לפני השימוש ולשמור את הווירוס בדילול מלא על קרח כל הזמן. </li></ol> 4. הרכבת חיסון שפעת וירוס דרך כביש allantoic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של חיסון וירוס (יום 10 או 11), נר הביצים שוב ולחסל את כל עוברים מתים. להבחין עוברים חיים על ידימחפש תנועה בתוך הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שלוש ביצים מן החממה, ולסדר את הביצים בבעל נפרד עם שק האוויר למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את המרחב האווירי של הביצים עם סמן קבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את קליפת הביצה מעל המרחב האווירי עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הביצים עם החלל עד האוויר בקרטון ביצים ולמכסת מנוע בטיחות ביולוגי (BSL-2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט 18G סטרילי אגרוף חור קטן בקליפה מעל שק האוויר של כל ביצה. היזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי, כדי למנוע דקירת העובר או חלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את נגיף השפעת המדולל לתוך מזרק 1 מיליליטר סטרילי ולצרף מחט 22g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדם בזהירות את המזרק עם מחט בזווית של 45 מעלות לתוך חלל allantoic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.2 מיליליטר של נגיף שפעת בדילול מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הזריקה עם שתי ביצים האחרות, ואז להשליך את המזרק ומחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החור עם ירידה של דבק מאקדח דבק (או שעוות פרפין נמס). Bדואר זהיר כי דבק לא ידלוף בתוך הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצים בחזרה לתוך חממת הביצה עם המרחב האווירי הצביע כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.2-4.12 עד שכל הביצים כבר מחוסנת. </li></ol> 5. דגירה זמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים נגועות מבלי להפוך על 37 מעלות צלזיוס ולחות ~ 60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זמן דגירה אופטימלי בהתאם לסוג וירוס שפעת. דגירה שפעת במשך 48 שעות; דגירה השפעת B ו- C למשך 72 שעות. </li></ol> 6. וירוס שפעת קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה, לצנן את הביצים על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 4 שעות (או O / N) כדי להרוג את העובר ולהצר את כלי הדם כדי להפחית את הסיכון של זיהום נוזל allantoic הנגוע בדם. לעשות את זה כדי למנוע את תאי דם האדומים מפני ספיגת הווירוס, אשר מפחית את התשואה. לחלופין, ביצי צינה למשך 30 דקות ב -20 ° C; אולם זה מגביר את הסיכון לזיהום בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הביצים היו מספיק קרות, להעביר את הביצים למכסת מנוע בטיחות ביולוגית. מניחים את הביצה לתוך בעל משרד עם שק האוויר פונה כלפי מעלה. נקה את משטח הביצה עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי סטרילי כדי לפתוח את קליפת הביצה מעל שק האוויר. הסר את הקליפה סביב שק האוויר והקפד לא להרוס את קרום chorioallantoic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קרום chorioallantoic עם מלקחיים בוטים סטרילי. בעדינות להזיז הצידה את העובר וצק החלמון עם מרית קטנה או כף. יש להיזהר שלא לקרוע את החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה Eppendorf 1 מיליליטר, לאסוף בזהירות את נוזל allantoic. במידת הצורך, להטות את הביצה קצת לצד כדי לאסוף כנוזל עד כמה שניתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את נוזל allantoic מכל הביצים לתוך צינור חרוטי פלסטיק 50 מיליליטר. שמרו צינורות על קרח בכל העת במהלך קציר וירוס. תשואות ביצה אחת 5 - 10 מיליליטר של נוזל צהבהב במקצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין נוזל allantoic המכיל וירוס XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 46; C עד גלולה פסולת. העבר את הנוזל השקוף לתוך צינור 50 מיליליטר חדש כל הזמן על קרח. השלך ביצים לתוך מיכל פסולת BSL-2. </li></ol> 7. חפצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד aliquot הנוזל הבהיר allantoic (למשל, 50, 100 או 500 aliquots ul) וsnap-הקפאה בחנקן נוזלי. העבר את מניות וירוס קפוא ל-80 ° C במקפיא לאחסון לטווח ארוך. </li></ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States,+1976-2007.">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li><li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus.">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li><li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus:+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice.">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li><li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+and+the+challenge+for+immunology.">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li><li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuing+challenges+in+influenza.">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+15G.1+Influenza:+propagation,+quantification,+and+storage.+.">Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. .</a> Current protocols in microbiology. , (2006).</li><li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome.">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li><li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection.">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li><li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses.">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells).">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שפעת גורמת לניטל עולמי גדול של מחלה, ועבודה נמשכת להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות 7. למחקר הקל במחלה קטלנית, שיטות שונות פותחו כדי להפיץ את נגיף שפעת 6. כאן אנו מתארים טכניקה לייצר וירוס שפעת בביצי תרנגולת. היתרון של שיטה זו הוא שזה מאוד לשחזור ותוצאות בכמויות גדולות של מניות וירוס שפעת הגבוהה titer, שלעתים קרובות יש צורך במחקרים במבחנה. רוב המעבדות תהיה מסוגלים לפתח פרוטוקול זה במהירות ובקלות עם start-up עלויות מינימליות. למרות שאנו ממליצים על השקעה בחממת ביצה עם טרנר האוטומטי, פרוטוקול זה יכול להסתיים בלי ציוד כזה, אבל יהיה קשה יותר. כמו כן, אנו ממליצים על שימוש בספקי מחקר מסחריים לרכישת ביצים מופרות כדי להבטיח עקביות ועקרות של הביצים. משרד Laboratפרשנות אורי צער בעלי החיים (OLAW) של מדיניות שירות לבריאות הציבור (PHS) על צער בעלי חיים טיפול ושימוש בחי מעבדה קובעת לשימוש מחקר של ביצי עופות embryonated חיות שמדיניות PHS ישימה רק לאחר הבקיעה. לכן, רוב המוסדות לא ידרשו אישור IACUC לפרוטוקול זה. עם זאת, מדיניות משתנות בין מוסדות, ואישור ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית יידרש לפני ביצוע פרוטוקול זה. כאשר עובדים עם הווירוס, זה הוא בעל חשיבות עליונה לשמור על הווירוס ב 4 C לאחר קצירת נוזל allantoic מהנגוע ביצת embryonated. כל ביצה צפויה לייצר בין 5-10 מיליליטר של נוזל allantoic, וכייל תלוי בזן של נגיף שפעת. המעבדה שלנו משמשת באופן שגרתי בשיטה זו כדי להפיץ זן H1N1 של שפעת מותאמת עכבר (/ יחסי ציבור / 8/34). גם פרוטוקול זה יכול לשמש לדגימות קליניות, אבל במצב הזה, חיסון של החלל מי השפיר עשוי להיות עדיף בשל presence של חומצות sialic 2,6 צמודות דרוש למחייב בתוך מי שפיר הבטנה 8,9. שיקול נוסף הוא ששיטה זו לא יכולה להיות אידיאלית לאיתור וירוסי התפשטות שפעת עופות (למשל, זני H5N1) בשל פתוגניות לעובר. שיטות שונות של titering וירוס השפעת פותחו כולם יש יתרונות וחסרונות שלהם. ואכן, כימות ויראלי יכול להיות מבוסס חלבון (לדוגמא, assay hemagglutinin, ELISA), (לדוגמא, assay פלאק נגיפי) גרעין מבוסס חומצה (PCR למשל, כמותי), או פונקציונלי 6. מבחני שאינם פונקציונליים יקבעו titers ויראלי הכולל, ללא קשר אם הם חיים או מתים חלקיקים נגיפיים. לכן, הבדיקה לפעילות המדבקת של נגיף השפעת תמדוד חיים וירוסים ולאפשר לשקילות פונקציונליות דומות ממגרש למגרש. Assay יוצרי פלאק הוא assay נפוץ שיכול להעריך titers של vir שפעת החישלנו, אבל יכול להיות איטי ומסורבל לביצוע 10. לשם השוואה, assay hemagglutinin הוא פשוט וברור, אבל לא להעריך את הכדאיות וקובע את כל חלקיקי השפעת. במסמך זה, אנו מספקים שיטה קלה יחסית כדי להפיץ וירוס שפעת גבוה כייל. ייזום דה נובו של פרוטוקול זה במעבדה הוא פשוט, וחומרי המוצא והציוד זולים יחסית.

השפעת ממשיך להיות איום גדול לבריאות אדם. זוהי מחלה בדרכי הנשימה שעלול להיות הרסנית עם נטל גלובלי גדול גורם עד 500,000 מקרי המוות בעולם בשנה 1. נגיפי שפעת נמצאים במשפחת Orthomyxoviridae ולבצע RNA חד-גדילי 8 תחושה שלילית בגנום שלהם 1,2. הניוון הגבוה (כלומר &quot;להיסחף&quot;, אנטיגני) של הגנום הנגיפי מונע חסינות לטווח ארוך. יתר על כן, השפעת היא עמידה יותר ויותר לתרופות אנטי-ויראליות 3. מגיפת שפעת שפעת H1N1 2009 הדגישה את כל הנושאים המאתגרים הקשורים למחלת שפעת (זן מגפה, התנגדות אנטי-נגיפית, ייצור חיסון מתעכב). ניסוח החיסון נקבע מדי שנה על ידי ארגון הבריאות העולמית לזני שפעת הסביר ביותר פתוגניים (אחד עבור כל H1N1, H3N2 ושפעת B) 4. מכיוון ששיטה זו מבוססת על זן שפעת חזהים, זנים פתוגניים מעת לעת באופן שגוי שזוהו ויעילות חיסון יורדת באופן דרמטי. יתר על כן, את המראה של זני שפעת רומן יכול לעקוף תוכניות המניעות אלה גורמים למחל מגיפת 2. יצירת חיסון נגד שפעת אוניברסלית כבר חמקמקה 5. לכן, מחקר חייב להמשיך להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות. למחקר במעבדה מתקן, במספר שיטות פותחו עבור בידוד וריבוי 6 ויראלי. יכולים להיות מוגברים נגיפי שפעת אנושיים במגוון רחב של מצעי תאים יונקים. עם זאת, וירוסים גבוה כייל יצירה בכמויות גדולות מושגות הטובות ביותר בביצי embryonated. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקה לשפעת התפשטות וירוס ואחסון ממניות וירוס קיימות.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Cellgro&amp;nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs&amp;nbsp;</td><td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>humidified egg incubator&amp;nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>automatic egg turner</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3200</td><td></td></tr><tr><td>egg candler</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3300&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>diluted to 70% using water</td></tr><tr><td>glue gun &quot;Ad tech Hi Temp Project Pro&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Model 1105</td><td></td></tr><tr><td>glue &quot;Ad tech MINI SIZE, Multi Temp&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>MDCK cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

influenza virus propagation in embryonated chicken eggs

זיהום שפעת קשור על 36,000 מקרי מוות ויותר מ -200,000 אשפוזים מדי שנה בארצות הברית. הופעתה המתמשכת של זני נגיף שפעת חדשים עקב מוטציה ומחדש מבחר מסבכת את השליטה של ​​הנגיף ומחייבת פיתוח הקבוע של תרופות וחיסונים רומן. המחקר מבוסס המעבדה של שפעת דורש שיטה אמינה וחסכונית להתפשטות של הווירוס. כאן, פרוטוקול מקיף מסופק לשפעת התפשטות וירוס בביצי תרנגולת פורה, אשר מניבה באופן עקבי מניות נגיפיות גבוה כייל. בקיצור, ביצי סרום הפתוגן ללא (SPF) מופרה עוף טופחו על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 במשך 10 - 11 ימים. במהלך תקופה זו, פיתוח עובר יכול להיות במעקב בקלות באמצעות קנדלר ביצה. חיסון וירוס מתבצע על ידי הזרקה של מניות וירוס לתוך חלל allantoic באמצעות מחט. אחרי 2 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, הביציםמצונן לפחות 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס. קליפת הביצה מעל שק האוויר וקרום chorioallantoic לאחר מכן פתחה בזהירות, ונוזל allantoic המכיל את הנגיף שנקטפו. הנוזל מנוקה מפסולת על ידי צנטריפוגה, aliquoted והועבר ל-80 ° C לאחסון לטווח ארוך. הכמות הגדולה (5-10 מיליליטר של נוזל לביצה המכיל וירוס) כייל נגיף וגבוה אשר בדרך כלל מושגת עם פרוטוקול זה הפכה את השימוש בביצים להכנת וירוס השיטה נוחה שלנו, בפרט ללימודים במבחנה הדורשים כמויות גדולות של וירוס שבמינונים גבוהים של אותו מניות הווירוס יש צורך.

מספר שיטות פותחו כדי כייל נגיף שפעת. שיקול אחד בעת בחירת שיטה מתאימה הוא שחלק לקבוע חלקיקים כולל, ללא קשר ליכולת קיום (למשל, assay hemagglutinin) ואילו אחרים מבוססים על infectivity, אשר יהיה להעריך virions קיימא (למשל, assay פלאק) 6. כאן, כייל הנגיף של נוזל allantoic נאסף מביצי תרנגולת מחוסנת עם נגיף שפעת מותאם עכבר (/ יחסי ציבור / 8/34) נקבע על ידי assay פלאק (איור 1) וassay hemagglutination (איור 2). זיהום בנגיף שפעת גורם לאפקט cytopathic שיגרום ללוחות (אזורים מעגליים של תאי lysed) כדי ליצור על monolayer של תאים. לוחות היו דמיינו ידי מכתים את התאים עם סגול גביש, ו -65 לוחות נספרו בהיטב עם 10 -12 הדילול של וירוס (איור 1). בגלל 500 L של מניית ויראלי מדוללת wכמונח על התאים, כייל הסופי הוא 1.3 x 10 14 PFU / מיליליטר. Assay hemagglutination הוא שיטה לtiter בסיסי נגיף שפעת על יכולתו של הנגיף להיצמד אל פני השטח של תאי דם אדומים. השעיה ויראלי תהיה לְהִצְטָמֵד תאי דם האדומים, ובכך מונעת מהם היישוב מהשעיה. על ידי שימוש בדילולי סדרתי של נגיף בצלחת 96-היטב (או V- או תחתונה עגול) והוספת סכום קבוע של תאי דם אדומים, ניתן לקבוע כייל הנגיף. תוצאה ברורה שלילית נצפתה עם 1: 2 10 הדילול של וירוס ב -50 μl (איור 2). לכן, כייל הסופי הוא 2.1 x 10 4 HAU / מיליליטר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52421/52421fig1highres.jpg" /> איור 1. כימות כייל נגיף PR8 ידי הרובד Assay. Monolayer של תאי MDCK היה נגוע בסריה של פי 10דילולים l של PR8 (10 -1 - 10 -12) במשך שעה 1, שטפו, ולאחר מכן מצופה בפתרון agarose 0.6%. לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, אגר הוסר בזהירות, ותאים קובעו ונצבעו עם 0.25% סגולים גביש. היווצרות רובד הייתה להשוות לשליטה נגוע (CTR). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52628/52628fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52421/52421fig2highres.jpg" /> Assay איור 2. Hemagglutination (HA) לוירוס שפעת PR8 נגזר ביצת כייל. וירוס PR8 היה סדרתי מדולל פי 2 בPBS ומעורבב עם 50 l של תאי דם אדום טורקיה 0.5%. דילולים נערכו quadruplicates, ותמונות צולמו לאחר הדגירה שעה 1 בRT. תוצאות שליליות מופיעות כנקודות במרכז הבארות ואילו תוצאות חיוביותיוצר צבע אדמדם אחיד על פני היטב. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52628/52628fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs at JoVE.com

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

influenza-virus-propagation-in-embryonated-chicken-eggs

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.0K Views.  Cedars-Sinai Medical Center. Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Video: Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Cancer Research

Using Chicken Embryo as a Powerful Tool in Assessment of Developmental Cardiotoxicities

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is well-defined, and it is relatively easy to achieve precise and timely exposure via multiple methods. Moreover, the process of heart development in chicken embryos is similar to mammals, also resulting in a four-chambered heart, making it a valuable alternative model in the assessment of developmental cardiotoxicities. In our lab, the chicken embryo model is routinely used in the assessment of developmental cardiotoxicities following exposure to various environmental pollutants, including per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), particulate matter (PMs), diesel exhaust (DE) and nano materials. The exposure time can be freely selected based on the need, from the beginning of development (embryonic day 0, ED0) all the way to the day prior to hatch. The major exposure methods include air-cell injection, direct microinjection, and air-cell inhalation (originally developed in our lab), and the currently available endpoints include cardiac function (electrocardiography), morphology (histological assessments) and molecular biological assessments (immunohistochemistry, qRT-PCR, western blotting, etc.). Of course, the chicken embryo model has its own limitations, such as limited availability of antibodies. Nevertheless, with more laboratories starting to utilize this model, it can be used to make significant contributions to the study of developmental cardiotoxicities.

Chicken embryos, as a classical developmental model, are used in our lab to assess developmental cardiotoxicities following exposure to various environmental contaminants. Exposure methods and morphological/functional assessment methods established are described in this manuscript.

שימוש בעובר עוף ככלי רב עוצמה להערכת לב-קרדיוקסיות התפתחותית

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is ...

Developmental Biology

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

תא יחיד transfection בעוברים צ&#39;יק

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Biology

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering exogenous materials into chicken embryos has a great advantage for studying gene function, transgenic breeding, and chimera preparation during embryonic development. Here we show the method of in ovo intravascular injection whereby exogenous materials such as plasmid vectors or modified primordial germ cells (PGCs) can be transferred into donor chicken embryos at early developmental stages. The results show that the intravascular injection through the dorsal aorta and head allows injected materials to diffuse into the whole embryo through the blood circulatory system. In the presented protocol, the efficacy of exogenous plasmid and lentiviral vector introduction, and the colonization of injected exogenous PGCs in the recipient gonad, were determined by observing fluorescence in the embryos. This article describes detailed procedures of this method, thereby providing an excellent approach to studying gene function, embryo and developmental biology, and gonad-chimeric chicken production. In conclusion, this article will allow researchers to perform in ovo intravascular injection of exogenous materials into chicken embryos with great success and reproducibility.

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

The overall goal of this paper is to describe how to perform in ovo intracellular injection of exogenous materials into chicken embryos. This approach is very useful to study the developmental biology of chicken embryos.

באובו הזרקה תוך-וסקולרית בעוברי עוף

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

נוקלאופלוט ובהפצת Vivo של העופות האימריריה טפילים

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...