Name: isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. Kütüphane Oluşturma <ol><li> Domain-spesifik hata eğilimli PCR kullanarak Hsp104 kütüphaneleri oluşturmak için, ilk önce bir hata eğilimli DNA polimeraz 20 ile ilgi alanını yükseltmek. </li><li> Jel ekstre PCR ürünü saflaştınlır. </li><li> Bir standart alana-yönlendirilmiş mutajenez protokolü kullanılarak bir megaprimer uzatma adımı gerçekleştirmek: PCR tamponu içinde 50 ng şablon plazmiti, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP, ve yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı birleştirmek, ve PCR dereceli su 20, 50 ul toplam hacme kadar seyreltin . Standart bir PCR programı çalıştırın. Not: amplifiye edilecek olan genin özel bir bölgesine göre değişir, kullanılan spesifik primerler. <ol><li> PCR sonra, 37 ° C&#39;de 2 saat süre ile, 1 ul Dpn I sınırlama enzimi ile ebeveyn hedef DNA sindirimi. </li></ol></li><li> Ultracompetent E. elektroporasyon veya diğer yollarla kitaplığı Transform coli Miniprep bunu arındırmak ve. NOT: Kütüphane oluşturmaesas olarak, belirli bir deney amaçlarına göre değişir. Hsp104 çok büyük bir protein olduğu, bu yüzden biz alanı özel hata eğilimli PCR kullanmak neden bütün geni, rastgele pratik değildir. Buna ek olarak, Hsp104 yapısı az 21 zorlu, yönlendirilmiş kitaplıkların tasarım, yapım anlaşılamamıştır. Kütüphane tek sınırlama, şablon plazmid omurgası dekstroz ortama 5-FOA karşı seçilmesine olanak sağlamak için, URA3 geni ihtiva etmesi olması ile, mutajenez için yönlendirilmiş veya rasgele yaklaşımlar kullanılarak yapılabilir. </li></ol> Hsp104 Kütüphanesi 2. Dönüşüm <ol><li> Standart bir lityum asetat / PEG transformasyon protokolü ile 22 W303aΔ hsp104 mayaya hastalıkla ilişkili alt-tabakanın entegre. Tek koloniler seçmek ve alt-tabakanın 23 ilgili hastalığın yüksek bir toksisite ile suşu izole toksisite için onları ekran. NOT: entegre bir gerginlik ve isola kullanınTüm hücreler eşit ekspresyonunu sağlamak için tek bir koloni te. PAG416GAL plazmid (urasil belirteç) 24 içine urasil dışında herhangi bir marker (biz histidin kullanın) ve Hsp104 kütüphane altında gen entegrasyonunu sağlayan bir plazmide hastalık tabakayı Clone. 5-FOA ters seçim olanak sağlamak için, kitaplık urasil markerinde bir plasmitten ifade olduğundan emin olun. Diğer maya suşları da kullanılabilir. Biz W303a hem WT ve Δ hsp104 kökenden BY4741 maya suşları (MEJ ve JS, yayınlanmamış gözlemler) kullanarak benzer bir toksisite bastırma fenotip kaydetti. </li><li> Aynı lityum asetat / PEG transformasyon protokolü 22 kullanarak bu tür haline Hsp104 kitaplığı dönüşümü. Kütüphanenin dizisi alanı muhafaza etmek için ve tahmin edilen kitaplık ebadını korumak için uygun dönüşümü büyütmek. </li><li> Kadar plakalar kullanılarak noninducing, seçici plakalar üzerine transformasyon karışımı (örneğin, SD-His-Ura) plakakoloniler, çok sayıda büyümesini sağlar. Gerekli plakaların sayısını en aza indirmek için büyük petri kapları (150 mm) kullanın. Plakalar kullanılarak transformantların kurtarma dönüşüm etkinliği değerlendirilir sağlar. </li><li> Paralel Hsp104 WT ve vektör negatif kontrolleri Transform. </li></ol> Proteotoxicity ve Önlenmesine 3. Eleme <ol><li> Rafınoz takviye bırakma ortamı (örn sraff-His-Ura) kullanarak plakaları kapalı koloniler yıkayın. Plakalardan koloniler gevşetmek için bir serolojik pipet ve steril ahşap aplikatörler kullanın. 50 ml konik bir tüp ve vorteks sıvı yıkama transfer iyice hücrelerin herhangi bir yığınının ayrı. Biraz bulutlu kültür, OD 600 ~ 0.025 sulandırmak. Not: Burada rafinoz ve böylece galaktoz aracılı indüksiyon hücreleri priming, indüksiyon glukoz aracılı baskı hücrelerini azaltmak için hizmet eder. </li><li> 3 çalkalanarak rafınoz bırakma medyada bir gecede seyreltilmiş kültür büyütün0 ºC. Paralel Hsp104 WT ve vektör kontrol büyür. </li><li> Sonraki sabah, tek tek galaktoz üzerine konsantrasyonları bir dizi plaka (örneğin SGAL-His-Ura) plakaları (400 ul toplam hacim içinde kültür konsantre edildi 2 ml için 1 ul). Konsantrasyonlarının geniş bir kaplama bir plaka tek koloniler sahip sağlayacaktır. Gerekli gerçek konsantrasyon yararlı hastalık substratın toksisite bağlıdır. </li><li> Kütüphanenin OD 600 vektör ve Hsp104 WT kültürleri normalize ve kontrol kütüphane nisbetle büyümesini karşılaştırma eşit hacimlerde plaka. </li><li> Seçim sertliğini değerlendirmek için, medya (bastırma) glukoz kütüphane plaka. Koloniler (Şekil 2) görünene kadar, 30 ° C&#39;de 2-3 gün inkübe. Çıkan koloniler değerlendirmek ve kontrollerle karşılaştırmak. NOT: Genellikle büyük ve küçük koloniler elde edilir, ancak koloni boyutu ve hareket arasında bir korelasyonivity görülmektedir. Sekanslamadan taşınan yanlış pozitif en aza indirmek için bir 5-FOA sayacı seçimi tekniği (Adım 4) kullanılarak bu potansiyel hit Ekran. </li></ol> 4. 5-FOA ters seçim ve lekelenme Hatalı Tesbiti ortadan kaldırmak için <ol><li> Çift ve tek terk medya üzerine suret tek koloniler (örn SD-His-Ura ve SD-His plakaları) ve 30 ºC&#39;de gece boyunca büyümeye dışarı Streak. Vektör ve Hsp104 WT kontrolleri ile tekrarlayın. Üzerine kaplama SD-His önce 5-FOA bir 5-FOA üzerine konuldukları zaman hücreler, Hsp104 plazmid kaybetmiş ihtimalini artırarak 5-FOA aşamasının verimini artırır. </li><li> 5-FOA ekran yaparken kurumasını plakaları önlemek için, 4 ºC&#39;de SD-His-Ura parafılm plakaların ve mağaza sarın. Bu plakalar, sonuçta, sıralamadan için kullanılacaktır. </li><li> Streak gelen koloniler SD-His 5-FOA plakaları üzerinde tek koloniler plakaları (YPD medya + 1 g / L 5-FOA) ve 30 1-2 gün inkübe186. C tek koloniler görünür kadar. Burada, 5-FOA, URA3 genini ihtiva eden hücrelerden bir toksik ürün (5-florodeoksiüridin) dönüştürülür. Böylece, hala Hsp104 plazmid herhangi hücreleri ölür. </li><li> Şerit, SD-Ura ve SD-His plakaları üzerine iki kez 5-FOA plakalardan tek koloniler. Her Testi 3 koloni Her hit için en az bir koloni Hsp104 plazmid yitirmiş olacağı olasılığını artırmak çarptı. 30 ° C&#39;de 1-2 gün süreyle inkübe edilir. SD-His plakaları değil SD-Ura plakalar üzerinde büyüyecek Hsp104 plazmid kaybettik Kolonileri. </li><li> Deneyleri tespit için Hsp104 plazmidler kaybetmiş suşları büyür. Çalkalama ile 30 ºC &#39;de gecede 96 derin kuyu, 2 ml plakaları (örneğin sraff-His) rafınoz bırakma medyada doyurma suşları büyür. 5-FOA ile tedavi edilen kontrol suşları dahil emin olun. </li><li> Tahlil tespit için tabak hazırlayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, kısım 200 ul rafınoz bırakma medya (örneğin sraff-His) başına96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu, ayırma sütunları saf kültürlerin 1 ve 7. Kısım 250 kolon 1 içinde 16 doymuş kültürlerin her ul ve plakanın 7. </li><li> Seri olarak çok kanallı bir pipet ile iyice karıştırılması, plakanın her sütuna Kültürler 5 kat seyreltilir. Her çukurdaki nihai hacmi sağlamak üzere sütun 6 ve 12 ile seyreltilmiş kültür 50 ul çıkarın 200 ul&#39;dir. Bu bile lekelenme sağlamak esastır. </li><li> 96-cıvata çoğaltıcı aracı (frogger) kullanılarak, SD-His ve SGAL-His plakalar üzerine nüsha halinde kültürleri nokta. 2-3 gün boyunca 30 ºC de inkübe. </li><li> Kontrollere benzer SGAL-His tabakalarına toksisite sergileyen suşları dizilenmesi için seçin. Kontroller gibi toksik değil gibi yanlış pozitif suşları atın. 5-FOA ayrıca kendi sık sık toksik, yani tek başına hastalık alt tabaka daha SD-His plakalar üzerinde bir büyüme kusur veya bu sergi önemli ölçüde daha yüksek toksisite gösterirler suşları (atın <stronG&gt; Şekil 3). </li></ol> 5. koloni PCR ile Hsp104 değişkenleri sequencing <ol><li> Pençe ~ 10 ul PCR şeridi tüplerinde 3 ul 20 mM NaOH içinde SD-His-Ura plakalardan maya ve dondurulup eritilerek hücreler lize edildi. Daha sonra 10 dakika boyunca bir PCR 99 ° C&#39;de inkübe edilir, 10 dakika süre ile ya da sıvı azot içinde bir -80 ° C dondurucu içinde şerit tüpler yerleştirin. PCR sınıf su ile 100 ul suşları sulandırmak. </li><li> PCR reaksiyonları hazırlayın: 5 ul PCR şablonu, 0.5 ul 100 uM her bir primer, 0.5 ul 10 mM dNTP, PCR tamponu içinde 0.25 ul DNA polimeraz, ve PCR dereceli su ile bir 25 ul toplam hacme tamamlanır. Tasarım primerler rastlantısal bölgeyi artı iki uçta da yaklaşık olarak 100 bp amplifiye etmek. Başarılı amplifikasyon olasılığını artırmak için güçlendirilmiş bölge boyutunu en aza indirmek. Standart bir PCR programı çalıştırın. </li><li> Uygun sIz bir PCR ürünü amplifikasyon teyit etmek için agaroz jel elektroforezi ile analiz numuneleriör. Hiçbir ürün varsa PCR tekrarlayın. Not: PCR, yetmezliği genellikle aşama 5.1&#39;de kullanılan çok fazla maya kaynaklanmaktadır. </li><li> DNA sekanslaması için numune hazırlayın. Böyle Ekzonükleaz I ve Karides Alkalin Fosfataz enzim olarak PCR saflaştırma veya bir PCR ürünü temizleme ajanı kullanılarak ya PCR primerleri Kaldır (ExoSAP-IT) tek iplikli DNA&#39;yı için. Bu reaktif enzimatik daha yüksek verim sağlayan, tüzel kişiliği olmayan astar ve dNTPs düşürür. </li><li> PCR ürünleri dizisi. Iyice mutasyonları için sıralama kromotogramlarını analiz emin olun. Genellikle birden plazmidleri barındıran maya gibi mutasyonlar, belirli bir site (Şekil 4), iki nükleotid bir karışımı olarak gözlemlenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases:+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs.">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress,+aging,+and+neurodegenerative+disease.">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity.">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models &amp; mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+reveal+a+'druggable'+Rsp5/Nedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons.">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li><li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein,+alpha-synuclein,+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms.">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models.">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104:+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders.">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li><li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders.">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li><li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients.">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li><li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events.">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li><li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).</li><li>Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Random+Mutagenesis+Libraries+by+Megaprimer+PCR+of+Whole+Plasmid+(MEGAWHOP).+Directed+Evolution+Library+Creation:+Methods+in+Molecular+Biology.">Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology.</a> eds FrancesH Arnold &amp; George Georgiou. 231, 23-28 (2003).</li><li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+machines+for+protein+folding,+unfolding+and+disaggregation.">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+toxicity+in+yeast.">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li><li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+Gateway&#174;+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A suite of Gateway&#174; cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada maya proteinopathy modellerini kullanarak hastalıkla ilişkili alt tabakaların toksisitesi bastırmak potansiyelize Hsp104 varyantları izole bizim yaklaşım sunmak. Bu yaklaşımı kullanarak, varyantlarının büyük kütüphanelerin, tek sınırlandırma, 5-FOA İkinci ekrana geçmek varyantları sayı olmak üzere, yüksek bir verimlilik de taranabilir. 96 kuyu formatında bu adımları gerçekleştirerek, rutin 1-2 hafta boyunca 5-FOA aşamasında bir anda 200 hit kadar ekran. Ilk tarama aşaması esnasında elde edilen isabet sayısı büyük ölçüde alt-tabaka, toksisite ve her bir kütüphanenin makyaj bağlı olarak değişecektir. Hit sequencing, bu plasmidlerin karışımları tipik olarak her bir hücrede mevcut olduğundan dikkatli bir şekilde bütün dizileme kromatogramlar analiz için esastır. Biz bazen Hsp104 WT büyük bir yüzdesi &#39;hit&#39; olarak izole ediliyor kaydetti. Bunun nedeni spontan genetik varlığı olasıdırbastırıcılar ya da çok zayıf bir aktivite. Bu sorunu aşmak için, yükseltilen sıcaklıklarda (örneğin, 34 ° C) tarama Hsp104 WT olan &quot;sonuç&quot; yüzdesini azaltabilir bulmuşlardır. Bu yeniden-klon herhangi sıralı hit bağımsız herhangi bir yeni varyantın aktivitesini değerlendirmek ve plazmid saflığı sağlamak için de önemlidir. Yeni isabet belirlendikten sonra, bunlar mayada toplanmasının önlenmesi için değerlendirildi ve biyokimyasal olarak karakterize edilebilir. Biz Hsp104 TDP-43, FUS ve α-sinüklin karşı varyantları kuvvetlendirilmiş izole etmek için bu yöntemleri kullanılmış ve saf protein biyokimyası analizleri 17 kullanarak kendi etkinliğini doğruladıktan. Sonuç olarak, bu yöntemler, mayada toksik ilgi konusu herhangi bir alt-tabakaya karşı bir protein kütüphaneleri taramak için kullanılabilir.

Maya proteinopathy modeller amiyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD) 1-3 içeren protein-yanlış katlanması bozuklukları için geliştirilmiştir. ALS hastalarında misfold protein TDP-43 ve FUS sentezlenmesi, maya 1,2 sitoplazmik agregatlar oluşturması için zehirli ve mislocalize bulunmaktadır. Benzer şekilde, PD karıştığı α-sinüklein (α-sin), ekspresyonu, toksik ve mislocalizes maya 3 sitoplazmik eden agregalar meydana getirir. Bu özellikler bu bozuklukların 4,5 olan hastalarda fenotipleri özetlemek. Bu nedenle, maya modelleri önlemek ya da bu fenotipleri 2,6-13 ters proteinler ya da küçük moleküllerin taranmasına yönelik yararlı bir platform sağlar. Biz nedeniyle TDP-43, FUS ve α-syn için toplanmasını ve toksisite geri yeteneğine sahip proteinlerin geliştirilmesinde ilgilendi. Biz Hsp104, hem fr proteinleri ayırmak olma eşsiz yeteneği olan mayadan AAA + protein odaklanmakmayada om amorf agrega ve amiloid, henüz hiçbir insan homolojunu 14,15 sahiptir. Hsp104 ince endojen maya prionları parçalamak için ayarlanmış ve normalde 16,17 karşılaştığında asla insan nörodejeneratif hastalıklarda rol yüzeylerde, parçalamak için sadece sınırlı bir yeteneği vardır. Böylece, biz birebir bu insan substratları ayrıştırmak mümkün Hsp104 gelişmiş versiyonlarını mühendisi hedefliyoruz. Hsp104 hata eğilimli PCR kullanarak varyantları Bunu yapmak için, biz büyük kütüphaneler inşa; bu kütüphaneler maya proteinopathy modelleri 17 kullanılarak taranabilir. Hsp104 17 çok büyük olduğu gibi biz, kütüphaneler oluşturmak ve tarama için bir etki alanı hedefli bir yaklaşım benimsemiştir. Benzer yaklaşımlar diğer etki taranması için kullanılabilecek olsa biz başlangıçta, orta etki Hsp104 17 (MD) odaklanmıştır. Bu tür geri kalanı yüzey gösterimi gibi alternatif teknikler karşıt olarak bu modeller, doğrudan Disaggregase aktivitesi için elenmesini sağlamak18 bağlama izlenmesi için kullanılacak ricted. Bizim protokol iki tarama aşaması (Şekil 1) dayanmaktadır. İlk olarak, mayada hastalık substratın toksisitesi bastırmak Hsp104 varyantları seçilir. Bunu yapmak için, Hsp104 varyantları ve hastalıkla ilişkili alt-tabaka Δ hsp104 maya içine ortak transforme edilir. Biz, vahşi tip yokluğunda (WT) Hsp104 17 Hsp104 dizisi alan araştırmak Δ hsp104 maya kullanılmaktadır. Önemlisi, Hsp104 silinmesi mayada α-sin, FUs, ya da TDP-43 toksisite etkilemez, ve Hsp104 WT ifadesi minimum kurtarma 1,13,17 sağlar. Maya her iki proteinlerin sentezlenmesinin uyarılması için ortam uyarılması üzerine yerleştirilir. Koloninin hastalıkla ilişkili substrat bahşedebilir büyüme toksisitesi bastırmak Hsp104 varyantlarını barındıran maya. Koloniler toksisite kalıbı bastıramaz varyantlarını korurken, bu varyantlar, daha fazla analiz için seçilmiştir. Bununla birlikte,yanlış pozitif Bu ekranda önemli bir sorun vardır. TDP-43, FUS ve α-syn sentezlenmesi ifade edilir Hsp104 varyant olmayan toksisite kendiliğinden genetik bastırma ortaya çıkması için güçlü bir seçici basınç oluşturur, oldukça zehirlidir. Bu nedenle, biz ayrıca spesifik olmayan toksisite bastırıcılar 17 ortadan kaldırmak için, nispeten yüksek miktarda olan ikincil bir ekran kullanmaktadır. Bu ikincil bir tarama, seçilen maya Hsp104 plazmidin 19 seçme karşı 5-Fluorootic asit (5-FOA) ile muamele edilir. Soy daha sonra alt-tabakanın toksisite Hsp104 plazmidin kaybından sonra geri sağlamak için tahlil lekelenme ile (TDP-43, FUS ya da α-sin) toksisite alt-tabaka açısından değerlendirilir. Bu nedenle, toksisitesi bu ikinci ekranda geri edildiği maya muhtemelen başlangıçta bağlı Hsp104 varyantın varlığını toksisite bastırma gösterilir. Bu maya &quot;sonuç&quot; olarak adlandırılan ve Hsp104 plazmid daha sonra olmalıdırgeri kazanılmış ve Hsp104 gen 17 (Şekil 1) &#39;de başkalaşımların teşhis edilmesi için dizilenmiştir. Herhangi bir hitleri daha sonra toksisite bastırılması için yeniden test daha sonra bağımsız bir şekilde mutasyona inşa yer yönlendirmeli mutajenezi kullanarak ve teyit edilmelidir. Bu protokol için potansiyel uygulamalar geniştir. Bu yöntemler kullanılarak, protein herhangi bir tür kütüphaneleri maya içinde toksik olan herhangi bir alt tabaka proteininin toksisitesi bastırmak varyantlar için taranabilir olabilir.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorootic Acid</td><td>Research Products International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Plates</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 bold replicator tool</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Biz orta etki randomize Hsp104 varyantlarının bir kütüphanesi inşa TDP-43 toksisite bastırılması için gösterildi. Kütüphane dönüştürülmüş ve ekranın darlığı değerlendirmek için glukoz, galaktoz levhaları (Şekil 2) üzerine kaplanmıştır. Tek tek koloniler seçilir ve suşlar karşı Hsp104 plazmid ortadan kaldırmak için 5-FOA kullanılarak seçilmiştir. Bu suşlar o toksisite onaylamak için değerlendirildi Hsp104 varyantları olmadan, TDP-43 tek başına nedeniyle oldu. Başlangıç ​​ekranında seçilen varyantları bir alt kümesi tespit tahlilleri seçilen 4 kolonilerinin, 2 1 yanlış pozitif olduğunu, Hsp104-aracılı TDP-43 toksisite bastırma görüntülenir ve 1 5-FOA tedavisinin ardından gelişmiş toksisite görüntülenir gösterdi (Şekil 3). 2 doğru hitleri daha sonra orta alan mutasyonlar (Şekil 4) tespit etmek için koloni PCR ile dizilenmiştir. Bu mutasyonlar belirlenmiştir sonra, Hsp104 mutasyon yapılmıştır<html> yeniden mevkiye-yönelik mutagenez ile parental Hsp104 plazmid toksisite bastırılması teyit etmek. Bu yöntemler kullanılarak seçilen Varyantlar daha sonra maya olarak toplanmasını, biyokimyasal analizlerde net, önceden oluşturulmuş agrega bastırmak ve C dopaminerjik nörodejenerasyonu bastırmak için teyit edilmiştir PH 17 C. elegans modeli. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52089/52089fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1:. Güçlendirilmis¸tir Hsp104 varyantlarının izole edilmesi için bir akış şemasını Hsp104 kitaplıkları (URA3 işaretleyici, GAL1 promotörü) hastalık tabakaları (HIS3 markör, GAL1 promotörü) içeren bira mayası içinde dönüştürüldü ve indükleyici ortama kaplama ile toksisite bastırma için taranır. Potansiyel vurur sonra spesifik olmayan toksisite bastırıcılara ortadan kaldırmak için bir 5-FOA ters seçim adımı kullanarak tekrar taranır. Bu ikinci adımda seçilen varyantlar daha sonra koloni PCR ile dizilir.<html> = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot; href&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52089/52089fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. PAG303GAL-TDP-43 ve pAG416GAL-Hsp104 kütüphane ile ortak transforme toksisite bastırıcılarının için tarama Maya glikoz üzerine (bastırma) veya galaktoz (uyarıcı) ortamını konuldu. TDP-43 yüksek toksik, yani çok az Hsp104 varyantlar bu toksisite bastırma yeteneğine sahip, ve bu ekran çok sıkı olduğunu. 5-FOA ikinci ekran için, galaktoz plakadan edecek şekilde Tek tek koloniler seçilir. Hem büyük hem de küçük koloniler tipik olarak elde edilir, ama biz koloni boyutu aktivitesi ile korelasyon nasıl dikte herhangi eğilimleri gözlenen değil. s.jpg &quot;/&gt; Şekil 3:. 5-FOA ikincil ekran Maya tahlil tespit değerlendirildi Hsp104 plazmid için seçin karşı 5-FOA ile tedavi. Suşlar, SD-His ve SGAL-His plakalar üzerine seri 5 kat sulandırılmış, sraff-His ortamında yetiştirildi ve iki kez tespit edildi. Hsp104 A503V daha önce doğrulanmış ve sadece 17 vektör ile birlikte bir kontrol olarak burada göstermek gelmiş gerçek bir hit olur. Satır 3 ve 4 Hsp104 bastırıcı TDP-43 izleyen toksisite kaybını korumak kütüphanesi isabet vardır. Satır 5 TDP-43 artık toksik olduğu, yanlış pozitif görüntüler, böylece spesifik olmayan bir toksisite baskılayıcı mevcuttur. Satır 6, tipik olarak muhtemelen 5-FOA toksisite, bir TDP&#39;lik-43 daha fazla toksik olan gerginlik göstermektedir. Bu tür, yine de dizilebilir olabilir ama geçerli bir isabet olmayabilir. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52089/52089fig4highres.jpg" width="300" /> Şekil 4. AnalDiziliş analizi sonuçlarından yzing. Seçilmiş maya, genellikle birden fazla plazmidi bulunmaktadır. Bu nedenle, söz konusu koloni PCR ürünlerinin dizi analizi, aşağıdaki bakım herhangi bir mutasyon, kromatogramlar göz ardı edilmemektedir emin olmak için dikkat edilmelidir. Kromatografta, (* ile gösterilmiştir) iki potansiyel mutasyonlar göz ardı edilebilir. İlk olarak, A ve T ve ikinci bir karışım, T ve C &#39;lik bir karışımı vardır

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Kuvvetlendiği Hsp104 Varyantlar kullanarak Maya Proteinopathy Modelleri Ayırma

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Görüntüleme.  Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania. Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Video: Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Kanser Araştırmaları

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Genetik

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biyoloji

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

Büyüme Tahliller Mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy bodies containing misfolded and aggregated &#945;-synuclein. &#945;-synuclein is an abundant presynaptic protein that regulates synaptic vesicle trafficking, but the accumulation of its proteinaceous inclusions results in neurotoxicity. Recent studies have revealed that various genetic factors, including bacterial chaperones, could reduce the formation of &#945;-synuclein aggregates in vitro. However, it is also important to monitor the anti-aggregation effect in the cell to apply this as a potential treatment for the patients. It would be ideal to use neuronal cells, but these cells are difficult to handle and take a long time to exhibit the anti-aggregation phenotype. Therefore, a quick and effective in vivo tool is required for the further evaluation of in vivo anti-aggregation activity. The method described here was used to monitor and analyze the anti-aggregation phenotype in the humanized yeast Saccharomyces cerevisiae, which expressed human &#945;-synuclein. This protocol demonstrates in vivo tools that could be used for monitoring &#945;-synuclein-induced cellular toxicity, as well as the formation of &#945;-synuclein aggregates in cells.

An in vivo physiological model of &#945;-synuclein is required to study and understand the pathogenesis of Parkinson's disease. We describe a method to monitor the cytotoxicity and aggregate formation of &#945;-synuclein using a humanized yeast model.

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Kuvvetlendiği Hsp104 Varyantlar kullanarak Maya Proteinopathy Modelleri Ayırma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler