Name: isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. Herstellung von Bibliotheken <ol><li> Um Bibliotheken von Hsp104 mit domänenspezifischen fehleranfällige PCR konstruieren zunächst verstärken die Domäne von Interesse mit einem fehleranfälligen DNA-Polymerase 20. </li><li> Reinige den PCR-Produkt durch Gel-Extraktion. </li><li> Führen Megaprimer-Extensionsschritt unter Verwendung einer Standardortsgerichtete Mutagenese-Protokoll: Kombinieren 50 ng Templat-Plasmid, 250 ng Megaprimer, 200 uM dNTPs und High-Fidelity-DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und mit Wasser auf 50 &amp; mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser 20 . Führen Sie einen Standard-PCR-Programm. HINWEIS: Spezifische Primer verwendet wird, basierend auf dem bestimmten Bereich des Gens, das zu amplifizierende variieren. <ol><li> Nach der PCR verdauen Eltern Template DNA mit 1 &amp; mgr; l DpnI-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Verwandeln Sie die Bibliothek durch Elektroporation oder andere Mittel in ultrakompetente E. coli und reinigen es durch Miniprep. HINWEIS: Bibliothek Generationvariiert im wesentlichen von den Zielen einer gegebenen Experiment basiert. Hsp 104 ist ein sehr großes Protein, so dass es unpraktisch ist, das gesamte Gen, weshalb wir nutzen domänenspezifischen fehleranfällige PCR zufällig ist. Darüber hinaus bleibt die Struktur des Hsp104 schlecht verstanden, dass das Design von gerichteten Bibliotheken anspruchs 21. Bibliotheken können mit gerichteten oder zufälligen Ansätze zur Mutagenese konstruiert werden, mit der einzigen Einschränkung, dass die Templat-Plasmid-Rückgrat ist das URA3-Gen für die 5-FOA Gegen Selektion auf Dextrose-Medium erlauben. </li></ol> 2. Transformation des Hsp104 Bibliothek <ol><li> Integrieren Sie die krankheitsassoziierten Substrat in W303aΔ hsp104 Hefe mit einem Standard-Lithium-Acetat / PEG Transformationsprotokoll 22. Wählen einzelne Kolonien zu screenen, und sie für Toxizität, einen Stamm mit einer hohen Toxizität der Krankheit assoziiert Substrat 23 zu isolieren. HINWEIS: Verwenden Sie eine integrierte Belastung und isolate einer Einzelkolonie auf Gleich Expression in allen Zellen zu gewährleisten. Klonen Sie die Krankheit Substrat in ein Plasmid ermöglicht die Integration des Gens unter einem anderen als Uracil-Marker (wir verwenden Histidin) und dem Hsp104 Bibliothek in das pAG416GAL Plasmid (Uracil-Marker) 24. Für 5-FOA Gegenselektion zu ermöglichen, sicherzustellen, dass die Bibliothek aus einem Plasmid mit der Uracil-Marker exprimiert. Andere Hefe-Stämme können ebenfalls verwendet werden. Wir haben eine ähnliche Toxizität Unterdrückung Phänotyp mit W303a und BY4741 Hefestämme in beiden WT und Δ hsp104 Hintergründe (MEJ und JS, unveröffentlichte Beobachtungen) festgestellt. </li><li> Transformieren Sie das Hsp104 Bibliothek in diesen Stamm mit dem gleichen Lithiumacetat / PEG Transformationsprotokoll 22. Scale up die Transformation entsprechend dem Sequenzraum der Bibliothek zu erhalten und um die vorhergesagte Größe der Bibliothek zu erhalten. </li><li> Platte der Transformationsansatz auf noninducing, Selektivplatten (zB SD-His-Ura) mit genug Plattensicherzustellen Wachstum einer großen Anzahl von Kolonien. Verwenden Sie große Petrischalen (150 mm), die Anzahl der Platten erforderlich minimieren. Gewinnen Anten unter Verwendung von Platten ermöglicht Transformationseffizienz zu bewerten. </li><li> Trans Hsp104 WT und Vektor Negativkontrollen parallel. </li></ol> 3. Screening zur Unterdrückung von proteotoxicity <ol><li> Verwendung Raffinose ergänzt Dropout Medien (zB sraff-His-Ura) Waschen Sie die Kolonien von den Platten. Verwenden Sie eine serologische Pipette und sterilen Holz Applikatoren, die Kolonien von den Platten lösen. Übertragen Sie die Flüssigkeit wäscht auf eine 50 ml konischen Röhrchen und vortexen, um alle Klumpen von Zellen zu trennen. Verdünnen, um eine leicht trübe Kultur, OD 600 ~ 0,025. HINWEIS: Hier Raffinose dient dazu, die Zellen Glucose-vermittelte Unterdrückung der Induktion zu entlasten, damit die Zellen Grundierung für Galaktose-vermittelte Induktion. </li><li> Wachsen die verdünnte Kultur über Nacht in Raffinose Dropout Medien mit 3 Schütteln0 ºC. Wachsen die Hsp104 WT und Vektorkontrollen parallel. </li><li> Am folgenden Morgen, Platte eine Reihe von Konzentrationen auf einzelne Galactose (zB SGal-His-Ura) Platten (1 ul bis 2 ml in 400 ul Gesamtvolumen konzentriert Kultur). Plattieren eines breiten Konzentrationsbereich wird sichergestellt, dass eine Platte wird einzelne Kolonien haben. Die tatsächliche erforderliche Konzentration hängt von der Toxizität des Krankheits Substrat von Interesse. </li><li> Normalisierung des Vektors und Hsp104 WT Kulturen der OD 600 der Bibliothek und der Platte gleichen Volumina, um das Wachstum der Bibliothek relativ zu den Kontrollen zu vergleichen. </li><li> Um die Auswahl Stringenz zu bewerten, Plate Die Bibliothek auf Glukose (Repression) Medien. Inkubation erfolgt für 2-3 Tage bei 30 ° C, bis Kolonien erscheinen (Abbildung 2). Bewerten Sie die resultierenden Kolonien und im Vergleich zu den Kontrollen. HINWEIS: Oft große und kleine Kolonien erhalten werden, aber keine Korrelation zwischen Koloniegröße und handelnduktivität beobachtet. Bildschirm diese potenziellen Hits mit einem 5-FOA Gegenselektionstechnik (Schritt 4), um die Sequenzierung übertragenen Fehlalarme zu minimieren. </li></ol> 4. 5-FOA Gegenselektion und Spek, Fehlalarme zu eliminieren <ol><li> Streak aus Einzelkolonien in zweifacher Ausfertigung auf Doppel- und Einzel Dropout Medien (zB SD-His-Ura und SD-His-Platten) und über Nacht wachsen bei 30 ºC. Wiederholen Sie mit Vektor- und Hsp104 WT Kontrollen. Plattieren auf SD-His vor 5-FOA erhöht die Effizienz der 5-FOA Schritt durch die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen das Hsp104-Plasmid verloren haben, wenn sie auf 5-FOA plattiert sind. </li><li> Um Platten vor dem Austrocknen zu verhindern, wickeln Sie das SD-His-Ura Platten in Parafilm und bei 4 ºC während der Durchführung der 5-FOA-Bildschirm. Diese Platten werden schließlich für die Sequenzierung verwendet werden. </li><li> Streak die Kolonien von der SD-His-Platten, um einzelne Kolonien auf 5-FOA-Platten (YPD media + 1g / L 5-FOA) und Inkubation für 1-2 Tage bei 30 &amp;# 186; C, bis einzelne Kolonien erscheinen. Dabei wird 5-FOA in einen toxischen Stoff (5-Fluordeoxyuridin) in Zellen, die das URA3-Gen enthalten, umgewandelt. Somit werden alle Zellen noch beherbergen die Hsp104 Plasmid sterben. </li><li> Streak die Einzelkolonien aus den 5-FOA-Platten in doppelter Ausführung auf SD-Ura und SD-His-Platten. Test 3 Kolonien für jede getroffen, um die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens einer Kolonie, für jeden Treffer wird das Hsp104-Plasmid verloren haben, zu erhöhen. Inkubation für 1-2 Tage bei 30 ° C. Kolonien, die Hsp104 Plasmid wird auf SD-His-Platten, aber nicht SD-Ura Platten wachsen verloren haben. </li><li> Wachsen die Stämme, die Hsp104 Plasmide für Spek Assays verloren haben. Wachsen die Stämme in Raffinose Dropout Mediensättigung (zB sraff-His) in 96 Deepwell 2 ml Platten über Nacht bei 30 ºC unter Schütteln. Achten Sie darauf, um die 5-FOA behandelten Kontrollstämme gehören. </li><li> Bereiten Platten für Spotting-Assay. Mit einer Mehrkanalpipette, aliquoten 200 ul Raffinose Dropout Medien (zB sraff-His) proVertiefung einer 96-Well-Platte, Reservierung Spalten 1 und 7 für die gepflegte Kulturen. Aliquots von 250 &amp; mgr; l von jeder der 16 gesättigten Kulturen in den Spalten 1 und 7 der Platte. </li><li> Seriell verdünnten Kulturen 5-fach in jeder Spalte der Platte, gründliches Mischen mit einer Mehrkanalpipette. Entfernen 50 ul der verdünnten Kultur aus den Spalten 6 und 12, um das Endvolumen jeder Vertiefung 200 ul gewährleisten. Dies ist unerlässlich, um auch Schmierblutungen zu gewährleisten. </li><li> Mit einem 96-Loch-Replikator-Werkzeug (Frogger), vor Ort die Kulturen in zweifacher Ausfertigung auf SD-His und SGal-His-Platten. Die Inkubation bei 30 ° C für 2-3 Tage. </li><li> Wählen Sie für die Sequenzierung Stämme, die Toxizität auf den SGal-His-Platten ähnlich dem der Kontrollen zeigen. Verwerfen als Fehlalarme Stämme, die nicht so giftig wie die Kontrollen sind. 5-FOA ist auch häufig auf eine eigene giftig, so verwerfen Stämme, die einen Wachstumsdefekt auf SD-His-Platten oder dass eine wesentlich größere Toxizität aufweisen als die Krankheit Substrat allein ( <strong&gt; 3). </li></ol> 5. Sequenzierung des Hsp104 Varianten durch Kolonie-PCR <ol><li> Scrape ~ 10 ul Hefe aus den SD-His-Ura-Platten in 3 ul 20 mM NaOH in PCR Streifen Rohren und Lyse der Zellen durch Einfrieren und Auftauen. Legen Sie die Streifen Röhrchen in einem -80 ° C Gefrierschrank für 10 min oder in flüssigem Stickstoff, dann bei 99 ° C inkubieren in einem Thermocycler für 10 min. Verdünnen Sie die Stämme bis 100 &amp; mgr; l mit PCR-Wasser. </li><li> Bereiten PCR-Reaktionen: 5 ul PCR-Matrize, 0,5 ul 100 uM jeder Primer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,25 ul DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und stellen bis zu 25 &amp; mgr; l Gesamtvolumen mit PCR-Wasser. Design-Primer, die randomisierten Bereich plus etwa 100 bp an beiden Enden zu verstärken. Minimierung der Größe des amplifizierten Region, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Amplifikation erhöhen. Führen Sie einen Standard-PCR-Programm. </li><li> Analyse Proben durch Agarosegelelektrophorese zur Amplifikation eines PCR-Produkt der geeigneten siz bestätigene. Wiederholen PCR, wenn keine vorhanden ist. HINWEIS: PCR Ausfall ist in der Regel durch zu viel Hefe in Schritt 5.1 verwendet. </li><li> Vorbereitung der Proben für die DNA-Sequenzierung. Entfernen PCR-Primer entweder durch PCR Aufreinigung oder unter Verwendung eines PCR-Produkt Bereinigung Reagens wie Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase-Enzym (ExoSAP-IT), um einzelsträngige DNA abzubauen. Dieses Reagenz enzymatisch abbaut unincorporated Primern und dNTPs, so dass für einen höheren Durchsatz. </li><li> Sequenz, die die PCR-Produkte. Achten Sie darauf, gründlich zu analysieren Sequenzierung Chromatogramme für Mutationen. Mutationen können als Mischung von zwei Nukleotiden an einer bestimmten Stelle (4) beobachtet werden, wie Hefe häufig beherbergen mehreren Plasmiden. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier präsentieren wir unseren Ansatz zur Isolierung potenziert Hsp104-Varianten, die die Toxizität von krankheitsassoziierten Substraten unter Verwendung von Hefe proteinopathy Modelle zu unterdrücken. Mit diesem Ansatz können große Bibliotheken von Varianten im Hochdurchsatz untersucht werden, wobei die einzige Einschränkung ist die Anzahl der Varianten, die das 5-FOA sekundären Sieb passieren. Durch Durchführen dieser Schritte in 96-Well-Format, routinemäßig auf die wir bis zu 200 Zugriffe zu einem Zeitpunkt in der 5-FOA Schritt im Verlauf von 1-2 Wochen. Die Anzahl der Treffer in der ersten Screening-Schritt erhalten wird variieren weitgehend je nach Substrat Toxizität und das Make-up des jeweiligen Bibliothek. Bei der Sequenzierung Hits, ist es wichtig, sorgfältig zu analysieren, alle Sequenzierung Chromatogramme seit Mischungen von Plasmiden sind in der Regel in jeder Zelle vorhanden ist. Wir haben manchmal bemerkt ein großer Prozentsatz der Hsp104 WT als &#39;Hits&#39; isoliert. Dies ist wahrscheinlich auf die Anwesenheit von spontanen genetischenUnterdrücker oder sehr schwache Aktivität. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir festgestellt, dass das Screening bei erhöhten Temperaturen (zB 34 ° C) kann der Prozentsatz der &quot;Hits&quot;, die Hsp104 WT sind zu verringern. Es ist auch wieder Klon keine sequenzierten Treffern unabhängig überprüfen die Tätigkeit jedes neue Varianten und Plasmid Reinheit zu gewährleisten unerlässlich. Sobald neue Hits identifiziert sind, können sie für die Unterdrückung der Aggregation in Hefe untersucht und biochemisch charakterisiert werden. Wir haben diese Methoden zur Isolierung potenzierten Hsp104 Varianten gegen TDP-43, FUS und α-Synuclein und überprüft ihre Aktivität mit reinen Proteinbiochemie Assays 17. Letztendlich könnten diese Methoden verwendet werden, um Protein-Bibliotheken gegen jede Substrat von Interesse, die in Hefe giftig ist screenen.

Hefe proteinopathy Modelle wurden für Proteinfehlfaltung Störungen, einschließlich amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Parkinson-Krankheit (PD) 1-3 entwickelt. Expression der Proteine ​​TDP-43 und FUS, die in ALS-Patienten misfold, sind toxisch und mislocalize cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe 1,2 bilden. Ebenso Expression von α-Synuclein (α-syn), die in PD gebracht wird, ist toxisch und mislocalizes cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe 3 zu bilden. Diese Merkmale rekapitulieren Phänotypen bei Patienten mit diesen Erkrankungen 4,5. So, Hefe-Modelle bieten eine nützliche Plattform für das Screening für Proteine ​​oder kleine Moleküle, die verhindern oder rückgängig diese Phänotypen 2,6-13. Wir interessieren uns für die Entwicklung von Proteinen, die in der Lage umzukehren Aggregation und Toxizität durch TDP-43, FUS und α-syn sind. Wir konzentrieren uns auf Hsp104, ein AAA + Protein aus Hefe, die einzigartig in der Lage Disaggregieren Proteine ​​sowohl fr istom amorphen Aggregaten und Amyloid in Hefe, es hat noch keine menschliche Homolog 14,15. Hsp104 fein abgestimmt, um endogene Hefe Prionen zerlegen und hat nur begrenzte Fähigkeit, Substrate in menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die es nie gewöhnlich begegnet 16,17 zerlegen. So wollen wir verbesserte Versionen von Hsp104, die in der Lage, wirksam zu zerlegen diese menschlichen Substrate sind Ingenieur. Dazu konstruieren wir große Bibliotheken Hsp104 Varianten mit fehleranfällige PCR; Diese Bibliotheken können mit den Hefe proteinopathy Modelle 17 zu sehen sein. Wir haben eine Domain-bezogenen Ansatz zur Konstruktion und Screening-Bibliotheken angenommen, wie Hsp104 ist sehr groß 17. Wir konzentrierte sich zunächst auf die Mitteldomäne (MD) von Hsp104 17, obwohl ähnliche Ansätze können verwendet werden, um andere Bereiche zu screenen. Diese Modelle ermöglichen für disaggregase Aktivität direkt Screening, im Gegensatz zu alternativen Techniken wie Oberflächen Display, das andere istricted zur Überwachung Bindungs ​​18 verwenden. Unser Protokoll auf zwei Screeningschritte (Abbildung 1). Zunächst werden Hsp104-Varianten, die die Toxizität der Krankheit Substrat in Hefe unterdrücken, ausgewählt ist. Um dies zu tun, Varianten der Hsp104 und krankheitsassoziierten Substrat in Δ hsp104 Hefe kotransformiert. Wir beschäftigen Δ hsp104 Hefe Hsp104 Sequenzraum in Abwesenheit von Wildtyp (WT) Hsp104 17 zu erkunden. Wichtig ist, dass das Löschen von Hsp104 nicht beeinträchtigt α-syn, FUS oder TDP-43 Toxizität in Hefe und die Expression von Hsp104 WT eine minimale Rettungs 1,13,17. Die Hefe wird dann auf induzierenden Medium, um die Expression der beiden Proteine ​​induzieren plattiert. Hefe beherbergen Hsp104 Varianten Toxizität der Krankheit assoziierten Substrat confer Wachstum der Kolonie zu unterdrücken. Diese Varianten werden zur weiteren Analyse ausgewählt, während Kolonien aufrechterhalten Varianten, die Toxizität sterben nicht unterdrücken müssen. JedochFehlalarme sind ein wesentliches Problem in diesem Bildschirm. Expression des TDP-43, FUS und α-syn hoch toxisch, was einen starken Selektionsdruck für das Auftreten von spontanen genetischen Suppressoren der Toxizität nicht mit dem Hsp104 Variante erstellt exprimiert. Somit haben wir einen zweiten Bildschirm, der auch relativ hohen Durchsatz, diese unspezifischen Toxizität Drücker 17 zu eliminieren. In diesem zweiten Bildschirm werden ausgewählte Hefe mit 5-Fluorootic Säure (5-FOA) behandelt, um entgegenzuwirken Select für den Hsp104 Plasmid 19. Die Stämme werden dann auf Substrat (TDP-43, FUS oder α-syn) Toxizität gegen Fleckentest, um sicherzustellen, dass die Toxizität des Substrats nach dem Verlust des Hsp104 Plasmid wieder bewertet. Somit Hefe toxisch ist in diesem Sekundärbild wiederhergestellt vermutlich ursprünglich angezeigte Toxizität Unterdrückung aufgrund der Anwesenheit des Hsp104-Variante. Diese Hefe werden als &quot;Hits&quot; bezeichnet, und die Hsp104 Plasmid sollte danngewonnen und sequenziert, um die Mutationen in der Hsp104-Gens 17 (Figur 1) zu identifizieren. Alle Treffer soll dann durch den Bau die Mutation unabhängig unter Verwendung ortsgerichtete Mutagenese und dann erneute Prüfung auf Toxizität Unterdrückung rückbestätigt werden. Die Anwendungsmöglichkeiten für dieses Protokoll sind breit. Mit Hilfe dieser Methoden können Bibliotheken von jeder Art von Proteinvarianten, die zur Toxizität von jedem Substrat Protein, das in Hefe toxisch ist drücken gescreent werden.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorootic Acid</td><td>Research Products International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Plates</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 bold replicator tool</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Wir haben eine Bibliothek von Hsp104 Varianten in der Mitteldomäne randomisiert konstruiert und gesiebt es zur Unterdrückung von TDP-43 Toxizität. Die Bibliothek wurde transformiert und auf Glucose und Galactose-Platten (2) überzogen, um die Stringenz der Bildschirm zu bewerten. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und die Stämme wurden Zähler mit 5-FOA die Hsp104 Plasmid beseitigen ausgewählt. Diese Stämme wurden dann bewertet, diese Toxizität zu bestätigen war auf TDP-43 allein, ohne den Hsp104 Varianten. Spotting Assays aus einer Teilmenge der in der Anfangsbildschirm ausgewählten Varianten zeigte, dass der 4 Kolonien ausgewählt, 2 angezeigt Hsp104-vermittelte TDP-43 Toxizität Unterdrückung, 1 war ein Fehlalarm, und 1 angezeigt verstärkte Toxizität folgenden 5-FOA-Behandlung (Abbildung 3). Die 2 gilt Treffern wurden dann durch Kolonie-PCR sequenziert, um die Mitteldomäne Mutationen (4) zu identifizieren. Sobald diese Mutationen wurden identifiziert, die Hsp104 Mutation konstruiert wurde<html> neu im elterlichen Hsp104 Plasmid durch ortsgerichtete Mutagenese Toxizität Unterdrückung zu bestätigen. Varianten mit diesen Methoden ausgewählt wurden später bestätigt, um die Aggregation in Hefe, klar vorgeformte Aggregate in biochemischen Assays zu unterdrücken, und dopaminerge Neurodegeneration unterdrücken in einem C. elegans Modell der PD 17. <img alt="Figur 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52089/52089fig1highres.jpg" width="700" /> Abb. 1: Flussdiagramm zur Isolierung potenziert Hsp104 Varianten Hsp104 Bibliotheken (URA3-Marker, GAL1-Promotor) in Hefe, die die Krankheit Substrate (HIS3 Marker, GAL1 Promotor) transformiert und zur Toxizität Drücker abgeschirmt durch Plattierung auf Induktion Medien. Mögliche Treffer werden dann wieder mit einem 5-FOA Gegenselektion Schritt, um unspezifische Toxizität Unterdrücker zu beseitigen gescreent. Varianten in diesem zweiten Schritt ausgewählt werden dann durch Kolonie-PCR sequenziert.<html> href = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52089/52089fig2highres.jpg" /> Abbildung 2:. Screening auf Toxizität Drücker Hefe mit pAG303GAL-TDP-43 und der pAG416GAL-Hsp104 Bibliothek kotransformiert wurden auf Glukose (Repression) oder Galaktose (Induktion) Medien plattiert. TDP-43 ist hochgiftig, so sehr wenige Hsp104 Varianten sind in der Lage zu unterdrücken diese Toxizität und dieser Bildschirm ist sehr streng. Einzelne Kolonien werden ausgewählt, wie Hits aus der Galactose Platte für den 5-FOA sekundären Bildschirm. Sowohl große als auch kleine Kolonien werden in der Regel erhalten, aber wir haben keine Trends, die vorschreiben, wie Koloniegröße korreliert mit Aktivität beobachtet. s.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: 5.-FOA sekundären Bildschirm Hefe mit 5-FOA behandelt, um entgegenzuwirken Select für den Hsp104 Plasmid wurden durch Spotting-Test beurteilt. Die Stämme wurden in sraff-His Medien auf SD-His und SGal-His-Platten gezüchtet, seriell verdünnt 5-fach und in zweifacher Ausfertigung gesichtet. Hsp104 A503V ist ein echter Hit, die wir zuvor überprüft und zeigen hier als Kontrolle zusammen mit Vektor allein 17. Zeilen 3 und 4 sind Bibliothek Hits, die TDP-43-Toxizität nach Verlust des Hsp104 Suppressor behalten. Reihe 5 zeigt ein falsch positives, wo TDP-43 ist nicht mehr giftig, so dass eine unspezifische Toxizität Suppressor vorliegt. Zeile 6 zeigt eine Belastung, die giftiger ist als TDP-43 ist typischerweise, möglicherweise aufgrund 5-FOA Toxizität. Dieser Stamm konnte noch sequenziert werden, aber nicht ein gültiger Hit. <img alt="Figur 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52089/52089fig4highres.jpg" width="300" /> Abbildung 4. Analyzing Sequenzierungsergebnisse. Ausgewählte Hefe enthält oft mehrere Plasmide. Daher folgenden Sequenzierung der Kolonie-PCR-Produkte, muss darauf geachtet werden, damit alle Mutationen in den Chromatogrammen sehen. In diesem Chromatogramm, zwei potentielle Mutationen (durch * gekennzeichnet) übersehen werden. Im ersten Fall gibt es eine Mischung von A und T und in der zweiten ein Gemisch aus T und C

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Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Aufrufe.  Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania. Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Serie: Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Forschung

Krebsforschung

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Genetik

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunologie und Infektion

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biologie

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy bodies containing misfolded and aggregated &#945;-synuclein. &#945;-synuclein is an abundant presynaptic protein that regulates synaptic vesicle trafficking, but the accumulation of its proteinaceous inclusions results in neurotoxicity. Recent studies have revealed that various genetic factors, including bacterial chaperones, could reduce the formation of &#945;-synuclein aggregates in vitro. However, it is also important to monitor the anti-aggregation effect in the cell to apply this as a potential treatment for the patients. It would be ideal to use neuronal cells, but these cells are difficult to handle and take a long time to exhibit the anti-aggregation phenotype. Therefore, a quick and effective in vivo tool is required for the further evaluation of in vivo anti-aggregation activity. The method described here was used to monitor and analyze the anti-aggregation phenotype in the humanized yeast Saccharomyces cerevisiae, which expressed human &#945;-synuclein. This protocol demonstrates in vivo tools that could be used for monitoring &#945;-synuclein-induced cellular toxicity, as well as the formation of &#945;-synuclein aggregates in cells.

An in vivo physiological model of &#945;-synuclein is required to study and understand the pathogenesis of Parkinson's disease. We describe a method to monitor the cytotoxicity and aggregate formation of &#945;-synuclein using a humanized yeast model.

Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Zusammenfassung

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