Bu çalışma SZ (FS / 08/063 ve FS / 15/30/31494) İngiliz Kalp Vakfı Bursu ile desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor.">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li><li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels.">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li><li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors.">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li><li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors.">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li><li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail.">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li><li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interactions:+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations.">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li><li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast:+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits.">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li><li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies:+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system.">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li><li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system.">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li><li>Elion, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8,+Detection+of+protein-protein+interactions+by+coprecipitation.">Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9,+Calcium+phosphate+transfection.">Chapter 9, Calcium phosphate transfection.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2003).</li><li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+(TPC)-binding+protein.">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li><li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain.">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li><li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease.">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes.">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li><li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaraldehyde:+behavior+in+aqueous+solution,+reaction+with+proteins,+and+application+to+enzyme+crosslinking.">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li><li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis.">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li><li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6.">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li><li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin.">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li><li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein.">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li><li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart.">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li><li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+oligomerization:+how+and+why.">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li><li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+oligomerization,+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states.">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li><li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration:+lessons+from+the+Alzheimer's+amyloid+beta-peptide.">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).</li><li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution:+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation.">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li><li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization.">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li><li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors:+biochemical+and+biophysical+methods.">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li></ol>

Yazarlar beyan etmek bir şey var.

Protein Homo-oligomer oluşumu transkripsiyon faktörleri, enzimler, iyon kanalları ve reseptörleriyle 25,26 aktivitesini düzenleyen bir temel biyolojik bir süreçtir. Önemlisi, protein oligomerizasyon da nörodejenerasyon ve aritmojenik kalp hastalığı 4,27 dahil patolojik etkileri vardır. Bu makalede açıklanan yöntemler, protein öz dernek ve oligomerizasyon aracılık etki-alanı etkileşimlerini tanımlamak için kullanılır. Aşağıda, her protokol dahilinde kritik adımlar işaret ve biz önemli hususlar, sınırlamalar ve sorun giderme tartışmak. Y2H sistemi potansiyel etkileşimli protein nedeniyle nispeten yüksek verimli tarama ortakları, kullanım kolaylığı ve yüksek oranda yeniden üretilebilir sonuçlar taranması ilk olarak kullanılabilir. Y2H prosedürler standart (plaka veya çalkalayıcı) kuvöz ve oda çevreleme tesisleri ile bir mikrobiyoloji laboratuvarında yürütülmektedir. fr kullanımıβ-Gal deneylerinde iyi sonuçlar için, taze (eski 5 güne kadar) maya kolonileri yetiştirilen (adım 1.2.3) kullanılması gerektiğini, oysa eshly hazırlanan kompetan hücreler (adım 1.1.8), yüksek verim maya dönüşüm için kritik öneme sahiptir. GAL4 ve / veya ek / alternatif muhabir genler dışındaki transkripsiyon faktörlerine dayalı sistemler mevcuttur ve bu nedenle yem ve av plazmidler uygun Y2H suşu ile uyumlu olmalıdır. Bazı türler HIS3 raportör geninin 7,8 herhangi konstitütif ekspresyonunu bastırmak için, 3-amino-1,2,4-triazol, HIS3 proteininin rekabetçi inhibitörün varlığında kültürlenen olmalıdır. Yem ve hedef füzyon proteinlerinin ekspresyonu 17 immunoblotting doğrulanmalıdır. durumda yem / av füzyon proteinleri, maya için toksik, daha kabul edilebilir protein seviyeleri yem / av sentezleme farklı promotör ile tahrik edilir, farklı vektörler içinde klonlanması ile elde edilebilir. Bundan başka, t sağlamak için gereklidirşapka yem / av füzyon proteinleri özerk bir raportör gen aktivitesini göstermek yok. Özerk raportör gen aktivasyonu ya da iki test edilen proteinlerin GAL4 DNA-BD ve AD füzyonlarının değiştirerek sorumlu bölgeyi kaldırmak için yapıyı değiştirerek tarafından kurtarıldı edilebilir. hücre içi membran bölümlerinde yanlış katlanmasına ya da füzyon proteinlerinin mislocalization neden olabilir, çünkü Ayrıca, zar-ötesi alanlar daha yem / av yapılardan atlanmıştır. Gerçekten de, Y2H sistemin en büyük dezavantajı yem ve hedef proteinler-yanlış pozitif ya da yanlış negatif etkileşimleri 6-9 sonuçlanan belirli bir post-translasyonel modifikasyonlar yoksun uzaklıkta fizyolojik hücre altı konumdan ve potansiyel olarak maya çekirdekte lokalize olmasıdır . Memeli heterolog sentezleme sistemleri konformasyon, post-translasyonel modifikasyonlar ve hücre içi lokalizasyonu açısından memeli bütün zar proteinleri çalışma için daha uygundur.En yaygın olarak kullanılan hücre transfeksiyonu yöntemlerden biri esas olarak en az ekipman, kalsiyum fosfat çökeltme ve reaktifler 11,15 gerektirir. Alternatif yöntemler, yani elektroporasyon, lipozomlar, katyonik lipidler ve polimerleri, hücre hattına bağlı olarak daha yüksek transfeksiyon verimi elde ve kullanılmış oluşturabilirler. Genel olarak, transfeksiyon verimliliğini etkileyen başlıca faktörler plazmid DNA kalitesi ve hücre sağlığı / canlılığı bulunmaktadır. En yüksek saflıkta (arasında 260nm / 280nm absorbans oranı ~ 1.8) ve aktif olarak bölünen hücrelerin plazmid DNA kullanıldığında en iyi sonuçlar elde edilir. Yabancı DNA&#39;yı alma yeteneği ortamı 11 maruz kalan hücre yüzey alanı ile ilgili olduğu için,% 70 izdiham (aşama 2.1.2) - Hücreler bu nedenle en fazla 60 transfekte olmalıdır. Ayrıca, transfeksiyon (aşama 2.1.3) süresince kültür ortamında antibiyotik dahil artan hücre ölümü 15 nedeniyle tavsiye edilmez. Fkalsiyum fosfat 2x HBS çözeltisi (adım 2.1.1) özellikle dikkatli hazırlanması ve (tam 7.05 kadar) pH ayarlaması yağış ve plazmid DNA / kalsiyum / kuvvetli karıştırma (adım 2.1.5) ile fosfat komplekslerinin doğru oluşum ya da yüksek verimli transfeksiyon için kritik bir adım. Tipik olarak, 24 içinde geçici transfeksiyon zirveleri ile protein ekspresyonu - 72 saat. Hücreler hasat edildikten sonra, daha sonraki işlemler proteaz aktivitesini azaltmak için 4 ° C sıcaklıkta yapılması gerekir, ve proteaz inhibitörlerinin ilave edilmesi tavsiye edilir. Hücre homojenleştirme kromozomal DNA solüsyonu viskozitesini arttırır ve spesifik olmayan geliştirmek çünkü, çekirdeklerini uzaklaştırmak üzere bir santrifüjleme aşaması takip edilmelidir. Bu durumda, bir izo-ozmotik bir tampon maddesi içinde mekanik yollarla homojenleştirme, genellikle (0.3 M) sükroz veya (150 mM) NaCl içinde tercih edilir. Genel olarak, sakroz-esaslı tamponlar, protein stabilitesini arttırmak ve potansiyel doğal olmayan bir protein agregasyonunu azaltmak için bilinen, ancak p nedeniyleProtein yüzeyinde başvuru hidrasyon, elektrostatik protein-protein etkileşimleri tercih edilmektedir. Bunun tersine, tuz bazlı tamponlar böylece daha fazla hidrofobik bazlı etkileşimleri 28 doğru bir eğilimi olan, proteinin yüzeyi üzerinde yüklü amino asit yan gruplarının net yükü etkilemektedir. Eş IP özellikle doğal doku protein-protein etkileşimlerini belirlemek için en yaygın olarak kullanılan biyokimyasal deneyidir. Bu dezavantajı IP kullanımı ve 10,16,18 immün için geçerli son derece spesifik antikorlar için bir gerekliliktir. Bu nedenle, yeniden birleştirici proteinler, sıklıkla bir peptid epitopu ile etiketlenmiş, örn., Influenza hemaglutinin (YPYDVPDYA) ya da insan Myc&#39;nin (EQKLISEEDL), bunun için yüksek affiniteli spesifik antikorlar ticari olarak temin edilebilmektedir. İstenirse, imüno antikor kimyasal ko-Çöken pr gizleyebilir immünoblotting aşamasında olan elüsyon ve algılama önlemek için Protein-A reçine üzerine konjuge edilebilirotein 16; Bunu başarmak için, biz başarılı kimyasal çapraz bağlayıcı 3,3&#39;-ditiyobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24 kullandık. Uygun bir deterjan IP tampon maddesi dahil edilir ve homojenize hücrelerin çözünmeyen malzeme spesifik olmayan bağlanma (aşama 3.1.3) en aza indirmek için, santrifüj ile çıkarılır zorunludur. esasen bağlayıcı olmayan spesifik azaltacaktır güçlü deterjanlar ve / veya yüksek konsantrasyonlarda değil, aynı zamanda X ortadan kaldırmak olabilir: seçim ve deterjan konsantrasyonu önemli konuları olan zayıf bir etkileşim görülebilir izin verebilir Y proteini etkileşim, düşük konsantrasyonlarda veya hafif deterjan oysa ama olabilir aşırı spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanabilir. .% 1 konsantrasyonda - orta derecede güçlü deterjanlar, örneğin Triton X-100 0.5 de tercih edilir. Bundan başka, spesifik olmayan bağlanma nötr protein azaltmak için (örneğin, 100 ug / ml&#39;de inek serum albümini), IP tampon maddesi dahil edilebilir, ve / veya hücre lisatı-Cleare ön edilebilirsadece protein-bir reçine ile inkübasyondan önce d. yıkama sayısı X için optimize edilmelidir: Y çifti test, IP tampon (adım 3.1.9) ile tipik olarak üç 10 dakika yıkar. Her durumda, imüno antikoru olmayan bağışıklık IgG ile birlikte bir IP her zaman bu negatif kontrol olarak (aşama 3.1.6) hizmet paralel işlenmelidir. Kimyasal zıt-bağlantı en önemli avantajı, protein homo-oligomer stoikiometrik bileşimine bilgilendirmesidir. Hiçbir özel ekipman gerektirir ve etkileşen proteinlerin 19,20 arasındaki termal ve kimyasal olarak dengeli çapraz bağlantılar oluşturur, çünkü Glutaraldehit yaygın olarak kullanılan bir çapraz bağlayıcıdır. bunlar kimyasal reaksiyonu söndürmek çünkü serbest amino grupları olan bileşikler tahlil tampon (aşama 3.2.1) ihmal edilmelidir. Glutaraldehit konsantrasyonu ve reaksiyon süresi de (aşama 3.2.4) Çevrede oligomerik protein kompleksi için optimize edilmelidir. Bu teknik, especi büyük dezavantajıbütün hücre preparatları üzerinde gerçekleştirilen ally zaman biyolojik önemi eksikliği yapay protein agregatları elde olabilir kimyasal reaksiyonun özgün olmaması yatmaktadır. In vivo olarak alternatif (örn., Flüoresan rezonans enerji transferi, iki molekül flüoresan veya lüminesans tamamlama) ve in vitro teknikleri (örn., Boy dışlama kromatografisi, analitik ultrasantrifügasyon, izotermal titrasyon kalorimetrisi) proteini kendi içinde birleşmeye ve değerlendirme karakterizasyonu için kullanılabilir oligomerizasyon stokiyometri 29,30 arasında. Her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır, ve protein arıtma / kararlılık ve ekipmanlar / reaktif durumuna bağlı olarak özel bir protein çalışmaları için daha uygun olabilir. ayrıntılı olarak, yani Y2H, CO-IP ve çapraz bağlama burada tarif edilen üç tamamlayıcı yöntemler, RyR2 homo-oligomer için ikna edici bir kanıt sağlamak üzere kombinasyon halinde kullanılmaktadırizolasyon ve canlı bir hücrenin içinde r oluşumu.

İskelet ve kalp kası kasılma RYR aracılık sarkoplazmik retikulum Ca 2 + salınımı ile tetiklenir. dört aynı alt birimden oluşan fonksiyonel kanalı üç memeli RyR izoformu vardır. Her bir alt-birimi RyR büyük sitoplazmik düzenleme, N-terminal kısmı ve bir yüksek-iletkenliği Ca 2 + gözenek oluşturan transmembran içeren küçük bir C-ucu kısmı oluşmaktadır. Anormal içi ve arası altbirim etkileşimleri RyR kanal disfonksiyonu altında yatan ve nöromusküler ve kardiyak bozukluklar 1 sonuçlanır. RyR yapısı katılan belirli alanlar belirlenmesi ve karakterizasyonu: fonksiyon ilişkisinin RyR patofizyoloji anlaşılması için çok önemlidir. Geleneksel biyokimyasal, protein-protein etkileşimi teknikleri genellikle bakterilerde üretilen saflaştırılmış proteinin büyük miktarlarda gerektirir. Bu RyR, çok büyük bir zar s durumunda mümkün değildirbunun yeniden bir araya fragmanları bakteriyel ekspresyon ve saflaştırma kolayca uygun değildir oysa rotein, ~ 5000 amino asitten oluşan. Bu nedenle, ökaryotik konakçı hücreleri içeren alternatif sentezleme sistemleri, memeli integral membran proteinleri için gereklidir. Daha önce hep birlikte N-terminal tetramerizasyon Üç memeli RyR 2,3 izoformları arasında muhafaza edilir yapısal özellik olduğunu göstermeye Y2H, CO-IP ve çapraz bağlama deneyleri kullanmışlardır. Daha da önemlisi, aritmojenik kalp hastalığı ile ilişkili tek bir nokta mutasyonu N-ucu kendi kendine birleşmesini ve işlevsiz RyR kanalı 4 sonuçları bozan bulduk. Ayrıca RyR sitoplazmik Cı-terminal kuyruğu 5 ve homolog hücre içi Ca2 + serbest bırakma kanalının N-terminalinde, inositol 1,4,5 trifosfat reseptörü 2 oligomerizasyon çalışmaları için bu teknikleri uyguladık. Y2H deneyinde, etkileşimleri içinilgili arasında iki protein (X ve Y) bir fonksiyonel bir transkripsiyon faktörü (GAL4) ve raportör genlerin 6-9 ardından gelen aktivasyon yeniden oluşturulması ile ölçülür. DNA-bağlama alanını (DNA-BD) / protein X füzyon (yem) ve aktivasyon alanı (AD) / protein Hasılat: İki farklı klonlama vektörleri GAL4 iki fiziksel olarak ayrılamaz, bağımsız bir etki alanları ile test edilen iki protein füzyonları oluşturmak için kullanılan füzyon (hedef). Y2H bir protein GAL4 DNA BD aynı proteinin AD füzyonlarının üreterek kendisi ile etkileşime test etmek için de kullanılabilir. Genetiği Y2H suşları (GAL80 proteini GAL4 bir baskılayıcı olan) eksik GAL4 ve GAL80 modifiye yanı TRP1 ve yetersiz LEU2 olarak (sırasıyla, yem ve yem plazmidler beslenme seçim sağlamak için). Maya çekirdeğinde, yeniden birleştirici DNA, BD AD peptidler sadece füzyonları &#39;X ile hibrid GAL4 transkripsiyon faktörü üretme yakın fiziksel temas haline getirilir: Y interaction. Bu yaklaşım, raportör gen (β-galaktosidaz (β-Gal) için LacZ kodlama) ve kromojenik (bir histidin biyosentezi için gerekli enzim için HIS3 kodlayan) prototropik paralel transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için hızlı bir genetik tarama sağlar. Y2H başlıca avantajı, daha zayıf ya da geçici protein-protein etkileşimlerini tespit in vivo deney olmasıdır. Ayrıca, saptama yem ve hedef proteinlerin saflaştırılması veya spesifik antikorların üretimi için gerek basit (ortam histidin olarak) bir büyüme seçimi kullanımını ya da bir kolorimetrik bölgesinin (β-Gal) deneyi içerir. Buna ek olarak, Y2H da kütüphane protein cDNA doğrudan erişim sağlayan bir yem protein yeni bağlanma ortakları, rasgele bilinmiyor klonlar (GAL4 AD kaynaşık cDNA kütüphanesi klon) oluşan bir koleksiyon taranması için kullanılabilir. Y2H gözlemleri uzatmak için, independENT biyokimyasal teknikler kullanılabilir. Eş IP ve immunoblotting ile birlikte çapraz bağlama deneyleri karmaşık örnek karışımları protein ilişkilerini tespit etmek için kullanılan yöntemler, örneğin., Bütün hücre lizatları 10 vardır. Ana avantajları rekombinant proteinlerin kullanımını gerektiren diğer yöntemlerin aksine, doğal doku ile ilgili protein-protein etkileşimleri hakkında rapor olmasıdır. Yeniden birleştirici proteinler, genellikle kendi doğru konformasyonu ve post-translasyonel değişikliklere sahip olasıdır, memeli hücre hattı, hem de hücre içi lokalizasyonu ifade kullanılabilir. CO-IP ve çapraz bağlama vitro deneyler, homojenize hücrelerden yararlanılarak bulunmaktadır Bununla birlikte, iki protein ortakları sağlam hücre 11 içinde bir arada lokalize olmadığını teyit etmek için gereklidir. Rutin geçici kalsiyum fosfat çökeltme yöntemi 2 kullanılarak memeli integral membran ve sitosolik proteinleri ifade etmek için, memeli HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu kullanma-4,12-14, Burada detaylı olarak tarif. Bu etkin bir hücre içinde plazmid DNA teslim için ucuz bir yöntemdir ancak, özellikle kullanılan hücre hattı ve hücre izdiham yanı sıra plasmid DNA 11,15 saflığına bağlıdır. CO-IP deney farazi etkileşimi mümkün 10,16 eş saflaştırılmasını sağlayan denatüre edici olmayan koşullar altında, hücre lizatları ilgi doğal veya yeniden birleştirici proteinin izole edilmesini gerektirmektedir. İki farklı epitop ile iki farklı füzyonlarının üreterek, bir protein kendi etkileşim olmadığını test etmek için bu kullanılabilecek iki bağımsız antikorların kullanımını protein X izolasyonu için immüno-çökeltilmesinin antikor ve protein ortağı Y saptanması için immünoblot antikoru gerektiren etiketleri (örn., HA ve Myc&#39;nin). immüno-çökeltilmesinin antikoru, Protein-A, Fc bölgesi vasıtasıyla bağlanmış (Protein-G, antikor, yükseltilmiş hayvan türlerine bağlı olarak ya da) olanagaroz (veya sefaroz) reçinesi konjuge edilir. Protein X antikoru ile çökeltilir: Protein-reçine, hücre lizatı Homojenleştirilmiş hücrelere, yani, deterjan çözünebilen fraksiyonu ile inkübasyonu takiben. Protein immüno-kompleksler tampon SDS-ihtiva eden ve daha sonra SDS-PAGE ile analiz edildi ve proteinin varlığını Y&#39;nin 17 tespit etmek için bir antikor kullanılarak immün ile elüt edilmiştir. Eş IP fazla spesifik olmayan bağlanma bilmek deterjanda eriyen proteinler ile yapılmalıdır. Y&#39;nin çift 10,16,18: deterjan ve konsantrasyonu seçimi, hem de yıkama sayısı, her bir X için optimize edilmelidir. Çapraz bağlanma oligomerik protein kompleksi stokiyometri belirlemek için kullanılır. Bitişik etkileşim protomerlerin arasında kovalent bağlar oluşturmak için bir kimyasal reaksiyon göre, ve bu yüzden, SDS-PAGE ayrılması sırasında proteinin oligomerik durumunun korunmasını mümkün kılmaktadır. Çok sayıda çapraz bağlama reage varproteinler, tipik haliyle, birincil aminler, karboksilik veya tiol grupları üzerinde farklı reaktif grup hedefleyen çeşitli uzunluklarda ve kimya NTS. Burada, glutaraldehid kullanımını tarif (OHC (CH2) 3, CHO), lizin kalıntılarının 19,20 bulunan serbest amino grupları ile reaksiyona giren iki ucundaki iki aldehit grubu ile, bir homo-iki fonksiyonlu çapraz bağlayıcı. Çapraz bağlanma adükt oluşumu ile sonuçlanan bir konsantrasyon veya zaman bağımlı bir şekilde takip eder. Glutaraldehit Reaksiyon hidrazin (H 2 NNH 2) ve protein örnekleri daha sonra, SDS-PAGE ile analiz edildi ve bunların oligomerizasyon durumunu değerlendirmek için 17 immün edilir durdurulmuştur. Bu oligomerizasyon başlatmadığı da çapraz bağlama not ancak sadece önceden varolan protein kompleksleri arasında sabit köprüler dönüşmesine neden olabilir. Çapraz bağlama deneyleri gerçekleştirilmesi önemli hususlar çapraz bağlayıcı, konsantrasyonu ve reaksiyon süresi 19,20 seçimi bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;PART 1 yeast two-hybrid&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate incubator</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Used at 30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Used at 30 &amp;deg;C with shaking at 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>To measure OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&amp;nbsp; and yeast strain Y190&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Herring testes carrier DNA&amp;nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>For yeast transformation</td></tr><tr><td>Whatman filter paper Grade 5&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>for use in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 2. Protein expression in a mammalian cell line&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;&amp;nbsp;CRL-1573&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator (5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>To culture mammalian cells</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Needle 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (Complete)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>To prevent proteolysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 3. In vitro biochemical methods&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&amp;nbsp;</td><td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>For electrophoretic transfer</td></tr><tr><td>Compact X-ray film processor</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>For use in chemical cross-linking</td></tr><tr><td>Protein-A sepharose beads&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5280-01&amp;nbsp;</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Non-immune rabbit IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-40</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce (ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>For use in immunoblotting</td></tr></tbody></table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Y2H sisteminde, yem: av etkileşimi ilk yoksun ortam içinde maya gelişimi seçimi (triptofan, lösin ve) histidin ile test edilir ve daha sonra β-Gal enzimatik aktivite deneyleri (Şekil 1) ile değerlendirildi. av protein etkileşimi: orta eksik histidin içinde kültüre maya yem gücüne bağlıdır yavaş büyüme oranına sahiptir. β-Gal deney maya içinde gerçekleştirilmektedir ikinci verimli niceliksel sonuçlar, ya katı bir destek üzerinde (agar plakaları) ya da sıvı kültür içinde büyüyen (ortamında kültürlendi yalnızca triptofan ve lösin eksik). Biz başarıyla RyR2 içinde etki-alanı etkileşimleri yanı sıra yeni protein ortakları 2-4,12,21,22 tanımlamak için Y2H kullandık. Örneğin, bir N-terminal parçası ile etkileşim için RyR2 peptid dizisinin tüm uzunluğu kapsayan yapılar bir dizi örtüşen taranmıştır (AD4L: RyR2 kalıntıları 1-906 GAL4 AD kaynaşık). 906 GAL4 ile birleştirilmiş - AD4L kendisi ile, yani BT4L 1 (RyR2 tortuları oluşturmak etkileşim gösteren, AD4L çifti (Şekil 2A): 3 koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal deneyleri parlak mavi renkli, sadece BT4L maya kolonileri üretilen DNA-BD). Maya başka bir yapı ile birlikte transforme edilmiş ise, AD4L çift uç C-terminal alanı (BT8) ile ikincil bir zayıf ilişkiyi ortaya beyaz ve yem için, bu nedenle negatif kaldı: soluk mavi koloniler BT8 için tespit edilmiştir av protein etkileşimi. Sıvı β-Gal deneyleri (Şekil 2B), elde edilen nicel sonuçlar, sağlıklı BT4L belirtilmedikçe: p53 proteini (pVA3) ve SV40 büyük T antigen (pTD1) arasındaki bilinen Derneği gücü AD4L etkileşimi eşdeğer BT8 ise: AD4L etkileşimi önemli ölçüde daha zayıf (&lt;% 10 kontrol ile karşılaştırıldığında) eklenmiştir. Biz rutin ko-IP deneyleri (Şekil 3) f yürütmekbağımsız bir biyokimyasal deneyde olduğu gibi, bir memeli hücre hattı (HEK293) geçici ifade ollowing Y2H bulguları 2-4,12-14,21-24 güçlendirmek için. RyR2 N-terminali kendini etkileşim doğrulamak için, RyR2 artıkları için kodlayan iki ayrı plazmid 1-906, ya Myc&#39;nin veya HA peptit epitopu (sırasıyla BT4L ve AD4L) ile etiketlenmiş, kalsiyum fosfat çökeltme yöntemini kullanarak HEK 293 hücrelerinde birlikte transfekte edildi 3.. Homojenleştirilmiş hücrelere sonrası nükleer fraksiyon deterjan CHAPS ile çözünür ve çözünmeyen malzemenin hücre lizatı elde etmek santrifüj ile uzaklaştırılmıştır. Indirgeyici madde ditiotreitol ile muamele hücre lizatı, daha sonra HA-etiketli AD4L immünopresipitasyon Ab HA ve Protein-A Sefaroz boncukları ile inkübe edildi. Tampon SDS-ihtiva eden ile elüt Co-IP örnekleri, Ab HA ve Ab c-myc, r immunoblotting yapılarak iki ayrı SDS-PAGE jelleri (1/10 ve 9/10 inci bölünmüş) üzerine yüklenmiş ve analiz edildiespectively. Ab HA AD4L başarıyla doğrudan IP (~ 100 kDa), ancak immün olmayan tavşan IgG (Şekil 4A) ile negatif kontrol olarak, immüno-lekeleme ile doğrulanmıştır. Önemli olarak, Myc&#39;nin-etiketli BT4L (~ 100 kDa) olup çökeltilir AD4L (Şekil 4B) yokluğunda negatif kontrol olarak, sadece Ab HA IP geri kazanılmıştır. Y2H ve ortak bir IP deneyler RyR2 N-terminali kendini etkileşim için tutarlı kanıtlar sağlamıştır, ancak bu sadece dimerleri ya da daha yüksek kompleksler oluşturan, yani ister N-terminal alanının oligomerizasyon durumuna bilgi yoktu. Kompleksler, ayrışacak unutulmamalıdır sadece içeren alt birimler, protein-protein etkileşimleri ortadan kaldırma için SDS-SDS-PAGE ve ısıya bağlı protein denatürasyonu ile tespit edilecektir. Bunun üstesinden gelmek için, kimyasal olarak ve kalıcı bir şekilde önceden var olan protein, birleştiği çapraz bağlanmasını (Şekil 5) kullanmakkimin molekül kütlesi daha sonra SDS-PAGE boyutu ayırma 2-5 incelenebilir n oligomerler. Örneğin, indirgeyici ajan ditiyotreitol ile muamele Myc&#39;nin-BT4L ifade eden HEK293 hücre homojenatı glutaraldehid ile reaksiyona sokuldu ve Ab c-myc (Şekil 6) kullanılarak SDS-PAGE ve bağışıklık-beneklemesi ile analiz edilmiştir. RyR2 N-terminali tetramer oluşumu 3 gösteren monomer (~ 100 kDa), zamana bağlı bir şekilde tespit edildi kDa&#39;lık 400 aralığında bir yüksek molekül ağırlıklı protein bandı, ilave olarak. Özellikle, tetramer az dimer ve trimer gözlenen bantları ile, baskın oligomerik türler oldu. % 15 gradyan SDS-PAGE jelleri 3 - görünür molekül kütlesi belirlemek için, BT4L oligomeri 4 boyunca ayrılmıştır. Biz 30 bir dizi protein standartları kullanılarak moleküler kütle / jel retardasyon standart eğri üretilen - 460 kDa, ve 358 kDa için 15 ila oligomeri hesaplanan (n = 4). Bu görünür moleküler kütlesi içinde düzenlenmiş bir BT4L tetrameri ile tutarlıdıryerli RyR2 kanal içindeki dört alt birimden düzenlemeden beklendiği gibi oldukça lineer formda daha kapalı dairesel moda. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Şekil 1. Y2H Akış Şeması. Maya, birlikte dönüştürülmüş yem ve hedef plazmid ile, orta eksik histidin büyüme için seçilmiş ve / veya β-Gal enzimatik aktivite için deneye tabi tutulur. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Şekil 2. Y2H RyR2 N-ucu Alan Öz-etkileşim önerir. (A) şematik için Y2H sisteminde test insan RyR2 örtüşen protein fragmanlarının (yem) serisi resmeden<html> RyR2 N-terminal AD4L (av) yapı ile etkileşimi. Koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal deneyleri ile elde edilen nitel sonuçlar &quot;+&quot; katları veya belirtilmiştir &quot;-&quot; negatif etkileşim için pozitif kontrol karşı normalize (B) Sayısal sıvı β-Gal deneyleri (pVA3 GAL4 DNA-BD için kodlar. p53 proteini ile bir füzyon; pTD1) SV40 büyük T antijeni, GAL4 AD füzyon için kodlar. 3 ila Modifiye. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Şekil 3. Co-IP Akış Şeması. Memeli hücreleri, birlikte transfekte plazmidler, X ve Y ile, homojenize edilir ve deterjan çözünebilir SDS-PAGE ve immunoblotting ardından eş IP tahlilde kullanılan hücre lizatı, üretirler.f = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Şekil 4. Eş IP memeli hücrelerinde RyR2 N-terminal alanı Kendinden etkileşimi gösterir. HEK293 hücreleri (BT4L) Myc&#39;nin-etiketli ve HA-etiketli (AD4L) RyR2 N-terminali alanının geçici ko-ekspresyonu (eş-transfekte edilmiştir kalıntıları 1-906). Negatif kontrol, CO-IP deneyleri olmayan immun tavşan IgG&#39;si ile gerçekleştirilmiştir ise AD4L, CHAPS içinde çözülebilir hale getirilmiş ve ditiotreitol ile muamele edilmiş HEK293 lizattan Ab HA ile imüno edildi. Çökeltilmiş proteinler, 5 dakika boyunca 85 ° C&#39;de ısıtıldı ve 1/10 veya IP örneklerinin 9/10 th yüklü ayrı% 6 SDS-PAGE jeli ile 3 saat 20 mA&#39;da çözüldü. polyviny üzerine 2 saat boyunca 80 V aşağıdaki protein transferiAb HA (A) ya da Ab Myc&#39;nin yabanturpu peroksidaz bağlı anti-fare IgG&#39;nin ve ardından sırası ile, (B), (1: 10,000 seyreltme) ve geliştirilmiş kimyasal aydınlatma: lidene diflorid zarı, immün analizi (1000 sulandırma 1) kullanılarak gerçekleştirildi (1 dk maruz kalma). Hücre lizatının bir tümböleni, IP örneklerde işlenen hacminin 1/50 inci, aynı zamanda moleküler kütle standart hizmet için dahil edilmiştir. 3 ila Modifiye. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Plazmid X ile transfekte Şekil 5. Çapraz bağlama Akış. Memeli hücreleri, SDS-PA, ardından homojenleştirilir ve çapraz bağlama deneyinde glutaraldehid ile reaksiyona tabi tutulurlarGE ve immunoblotting. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Şekil 6. Çapraz bağlanma RyR2 N-terminal alanı Tetramer oluşumunu göstermektedir HEK293 hücreleri Myc&#39;nin-etiketli (BT4L) RyR2 N-terminali alanının geçici ifade (kalıntılar 1-906) için transfekte edilmiştir.. indirgeyici madde ditiotreitol ile muamele hücre homojenatı, belirtilen zaman noktalarında glutaraldehid ile inkübe edilmiştir. Numuneler 5 dakika boyunca 85 ° C&#39;de ısıtıldı ve 3 saat 20 mA&#39;da SDS-PAGE (% 6 jel) çözüldü. Yaban turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-fare IgG (1, ardından (1000 sulandırma 1) AB c-myc poliviniliden diflüorür zar üzerine 2 saat için 80 V protein devri sonrasında immün analizleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir:10.000 seyreltme) ve geliştirilmiş kemilüminesans algılama (1 dk maruz kalma). Monomerik (E: ~ 100 kDa) ve dörtlü (T) formları oklar ile belirtilmiştir. 3 ila Modifiye. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study at JoVE.com

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.4K Görüntüleme.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Video: Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. However, there is still little information about how insoluble protein aggregates exert their toxic effects in vivo. Simple prokaryotic and eukaryotic model organisms, such as bacteria and yeast, have contributed significantly to our present understanding of the mechanisms behind the intracellular amyloid formation, aggregates propagation, and toxicity. In this protocol, the use of yeast is described as a model to dissect the relationship between the formation of protein aggregates and their impact on cellular oxidative stress. The method combines the detection of the intracellular soluble/aggregated state of an amyloidogenic protein with the quantification of the cellular oxidative damage resulting from its expression using flow cytometry (FC). This approach is simple, fast, and quantitative. The study illustrates the technique by correlating the cellular oxidative stress caused by a large set of amyloid-&#946; peptide variants with their respective intrinsic aggregation propensities.

Protein aggregation elicits cellular oxidative stress. This protocol describes a method for monitoring the intracellular states of amyloidogenic proteins and the oxidative stress associated with them, using flow cytometry. The approach is used to study the behavior of soluble and aggregation-prone variants of the amyloid-&#946; peptide.

Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Biyokimya

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Biyomühendislik

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, specifically to study the function of new genes/proteins associated with a disease, identified during the genetic diagnosis. For the development of such cell lines, two major issues have to be untangled: insertion of the CRISPR tools (the Cas9 and the guide RNA) with high efficiency into the chosen cells, and restriction of the Cas9 activity to the specific deletion of the chosen gene. The protocol described here is dedicated to the insertion of the CRISPR tools in difficult to transfect cells, such as muscle cells. This protocol is based on the use of lentiviruses, produced with plasmids publicly available, for which all the cloning steps are described to target a gene of interest. The control of Cas9 activity has been performed using an adaptation of a previously described system called KamiCas9, in which the transduction of the cells with a lentivirus encoding a guide RNA targeting the Cas9 allows the progressive abolition of Cas9 expression. This protocol has been applied to the development of a RYR1-knock out human muscle cell line, which has been further characterized at the protein and functional level, to confirm the knockout of this important calcium channel involved in muscle intracellular calcium release and in excitation-contraction coupling. The procedure described here can easily be applied to other genes in muscle cells or in other difficult to transfect cells and produce valuable tools to study these genes in human cells.

The protocol describes how to generate knock-out myoblasts using CRISPR/Cas9, starting from the design of guide-RNAs to the cellular cloning and characterization of the knock-out clones.

Lentivirüs Aracılı CRISPR / Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak Nakavt Kas Hücre Hatlarının Geliştirilmesi

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Genetik

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding disease that lacks effective treatment. We hypothesize that the cytotoxicity of the misfolded rhodopsin mutant can be alleviated by pharmacologically stabilizing the mutant rhodopsin protein. The P23H mutation, among the other Class II rhodopsin mutations, encodes a structurally unstable rhodopsin mutant protein that is accumulated in the endoplasmic reticulum (ER), whereas the wild type rhodopsin is transported to the plasma membrane in mammalian cells. We previously performed a luminescence-based high-throughput screen (HTS) and identified a group of pharmacological chaperones that rescued the transport of the P23H rhodopsin from ER to the plasma membrane. Here, using an immunostaining method followed by a high-content imaging analysis, we quantified the mutant rhodopsin protein amount in the whole cell and on the plasma membrane. This method is informative and effective to identify true hits from false positives following HTS. Additionally, the high-content image analysis enabled us to quantify multiple parameters from a single experiment to evaluate the pharmacological properties of each compound. Using this assay, we analyzed the effect of 11 different compounds towards six RP associated rhodopsin mutants, obtaining a 2-D pharmacological profile for a quantitative and qualitative understanding about the structural stability of these rhodopsin mutants and efficacy of different compounds towards these mutants.

Here, we described a high-content imaging method to quantify the transport of rhodopsin mutants associated with retinitis pigmentosa. A multiple-wavelength scoring analysis was used to quantify rhodopsin protein on the cell surface or in the whole cell.

Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Kimya

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biyoloji

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43'ün Optogenetik Faz Geçişi

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Nörobilim

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Tıp

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes following physical activity, stress, or catecholamine challenge, which can deteriorate into potentially fatal ventricular fibrillation. The mouse heart is a widespread species for modeling inherited cardiac arrhythmic diseases, including CPVT. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential (Vm) and calcium transients (CaT) from Langendorff-perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying arrhythmogenesis. Compared with the cellular level investigation, the optical mapping technique can test some electrophysiological parameters, such as the determination of activation, conduction velocity, action potential duration, and CaT duration. This paper presents the instrumentation setup and experimental procedure for high-throughput optical mapping of CaT and Vm in murine wild-type and heterozygous RyR2-R2474S/+ hearts, combined with programmed electrical pacing before and during the isoproterenol challenge. This approach has demonstrated a feasible and reliable method for mechanistically studying CPVT disease in an ex vivo mouse heart preparation.

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

This protocol introduces dual-dye optical mapping of mouse hearts obtained from wild-type and knock-in animals affected by catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, including electrophysiological measurements of transmembrane voltage and intracellular Ca2+ transients with high temporal and spatial resolution.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler