Filamentli Mantarlar ile Polimer Hidrolitik Hücre Dışı Enzim Üretimi için Katı Hal Fermantasyon Sistemlerinin Tasarımı

Bu protokol, enzim üretimini artırmak için döner bir katı hal fermantasyon sisteminde buğday kepeğini kullanır. Kitin gibi indükleyicilerle desteklenen substrat, kontrollü koşullar altında mantar büyümesini destekler. Sonuçlar, daldırılmış fermantasyona kıyasla 4-6 kat daha yüksek enzim verimini göstererek, yöntemin çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için uyarlanabilirliğini ve etkinliğini göstermektedir.

Katı hal fermantasyonu (SSF), sulu bir ortamda çözünmeyen katı bir substrat kullanan bir biyodönüşüm işlemidir. Mikroorganizmalar substratın yüzeyinde büyür ve gelişimleri için gerekli besinleri çıkarmak için katı matrisine nüfuz eder. SSF,% 70'in üzerinde tutulan bir substrat nem içeriği ile minimum serbest su ile karakterize edilir ve gaz, sıvı ve katı olmak üzere birbirine bağlı üç faz içerir. Bu protokol, tarımsal endüstriyel bir yan ürün olan buğday kepeğinin döner bir sistemde enzim üretimi için temel substrat olarak kullanımını açıklar. Substrat, hidrolitik proteinlerin sentezini teşvik etmek için kitin, kitosan, nişasta veya selüloz gibi bir indükleyici ile desteklenir. Sistem son derece uyarlanabilir ve miselyum, sporlar veya peletler dahil olmak üzere farklı mantar formlarının kullanımına izin verir. Açıklanan metodolojide, indükleyici ve substrat 1:100 (a/a) oranında karıştırılır, otoklavlama yoluyla sterilize edilir ve steril su ile istenen nem seviyesine ayarlanır. Mantar aşısı daha sonra eklenir ve döner sistem, yeterli karıştırma ve oksijenasyonu sağlamak için 10 rpm'de çalışır. Sistem, mezofilik veya termofilik/termotolerant mantarlar için en uygun büyüme koşulları altında 6-8 gün inkübe edilir ve çok yönlülüğü arttırılır. İnkübasyondan sonra enzim, enzim tipine bağlı olarak uygun bir soğuk tampon (örneğin asetat, sitrat veya fosfat) kullanılarak kolayca ekstrakte edilir. Ekstrakt, hücresiz bir süpernatan elde etmek için santrifüjleme ve filtreleme yoluyla arıtılır. Enzim daha sonra gerektiği gibi daha fazla konsantre edilebilir veya saflaştırılabilir. Sonuçlar, batık fermantasyona (SmF) kıyasla enzim aktivitesinde 4-6 kat artış gösterdi ve bu da sistemin etkinliğini vurguladı. Farklı substratlara, indükleyicilere ve mantar türlerine uyarlanabilirliği, onu çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için değerli bir araç haline getirir.

Katı hal fermantasyonu (SSF), yüksek değerli enzimler, biyoaktif bileşikler ve ikincil metabolitler üretmek için umut verici ve sürdürülebilir bir biyodönüşüm teknolojisi olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, mikroorganizmaların minimum serbest su ile katı substratlar üzerinde büyümesini içerir, doğal ortamlarını simüle eder ve verimli metabolik aktivite sağlar¹. Bu protokolün birincil amacı, gelişmiş substrat kullanımı, oksijen difüzyonu ve proses ölçeklenebilirliği sağlayan döner bir SSF sistemi aracılığıyla enzim üretimini optimize etmektir. Bol miktarda bulunan bir tarımsal-endüstriyel yan ürün olan buğday kepeğinin temel substrat olarak kullanılması, tarımsal kalıntıların değerlendirilmesine katkıda bulunur ve döngüsel biyoekonomi uygulamalarını teşvik eder².

SSFdaha düşük enerji ve su tüketimi, daha yüksek ürün konsantrasyonu ve buğday kepeği, pirinç kabuğu ve şeker kamışı küspesi gibi çok çeşitli ucuz tarımsal kalıntılarla uyumluluk dahil olmak üzere batık fermantasyona (SmF) göre önemli avantajlara sahiptir³. Büyük hacimlerde su ve pahalı besin ortamı gerektiren SmF'den farklı olarak, SSF sistemleri, yalnızca mikrobiyal büyüme yüzeyleri olarak hizmet etmekle kalmayıp aynı zamanda mikrobiyal aktivite için gerekli besinleri de sağlayan katı matrislerden yararlanır. Ek olarak, SSF'deki sınırlı serbest su, kontaminasyon risklerini en aza indirerek onu endüstriyel ortamlarda enzim üretimi için daha sağlam bir seçenek haline getirir⁴. Operasyonel avantajlarına ek olarak,SSFbatık fermantasyona (SmF) kıyasla önemli çevresel ve ekonomik faydalar sunar. Çalışmalar, SSFsürekli çalkalama ve havalandırma gerektiren büyük su hacimlerinin olmaması nedeniyle su tüketimini %50-70 oranında azalttığını ve enerji maliyetlerini %30'dan fazla azalttığını bildirmiştir. Ayrıca, tarımsal-endüstriyel kalıntıların substrat olarak kullanılması, hammadde maliyetlerini en aza indirir ve tarımsal yan ürünleri yeniden kullanarak döngüsel ekonomi uygulamalarını teşvik eder ^2,4.

SSFverimliliği ve ölçeklenebilirliği açısından kapsamlı bir şekilde doğrulanmıştır. Örneğin, çalışmalar, SmF'ye kıyasla SSF kullanarak enzim aktivitesinde 4-6 kat artış bildirmiştir^ve bu tekniğin ekonomik ve çevresel avantajlarını vurgulamaktadır ^2,5. Ek olarak, enzim ekstraksiyonu tipik olarak daha az su ve daha az saflaştırma adımı gerektirdiğinden, aşağı akış prosesi basitleştirilmiştir. Bu, SSFoperasyonel maliyetleri ve çevresel etkiyi azaltmayı amaçlayan endüstriler için özellikle çekici⁶.

Bu protokolde açıklanan döner SSF sistemi, geleneksel statik SSF yöntemlerine göre çeşitli iyileştirmeler sunar. Statik sistemler genellikle düzensiz substrat kolonizasyonu ve oksijen sınırlaması gibi zorluklarla karşı karşıya kalırken, döner konfigürasyon kapsamlı karıştırma ve havalandırma sağlayarak tek tip mikrobiyal büyümeyi teşvik eder ^7,8,9. Örneğin, bu sistem, Aspergillus ve Trichoderma² gibi mantar türlerini kullanarak kitinazlar, amilazlar ve proteazlar gibi hidrolitik enzimler üretmek için başarıyla kullanılmıştır.

Bunun önemli bir özelliği SSF sistem uyarlanabilirliğidir. Buğday kepeğinin temel substrat olarak kullanılması, tarımsal-endüstriyel kalıntıların uygun maliyetli biyodönüşüm için potansiyelini göstermektedir³. Ayrıca, substratın kitin, kitosan ve nişasta gibi indükleyicilerle takviyesi, spesifik metabolik yolları^uyararak enzim sentezini daha da geliştirir ^2,10. Sistem ayrıca sporlar, miselyum ve peletler dahil olmak üzere farklı mantar formlarıyla uyumludur ve kullanıcıların süreci kendi özel gereksinimlerine göre uyarlamasına olanak tanır².

SSFgıda biyoteknolojisi, biyoyakıt üretimi ve çevresel iyileştirme gibi çeşitli alanlarda uygulama için geniş bir potansiyel sunar¹¹. Uygun maliyetli substratların, olağanüstü enzim verimlerinin ve yüksek proses esnekliğinin entegrasyonu, SSF'yi endüstriyel ölçekli biyoteknolojik yenilikler için temel bir yaklaşım olarak belirler.

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yüzey hazırlığı

NOT: Alt tabaka özelliklerindeki önemli değişiklikleri en aza indirmek için ticari bir marka buğday kepeği kullanın. Her bir buğday kepeği partisi, birden fazla faktöre bağlı olarak değişir, bu da onu standartlaştırılması zor olan heterojen bir malzeme haline getirir ve bileşen içeriğinde dalgalanmalara yol açar. Standartlaştırılmış bir malzeme gerekiyorsa, alternatif bir matris seçin veya ihtiyaca göre ayarlamak için her bir buğday kepeği partisinin yakın bir kimyasal analizini yapın.

1. Organik madde kalıntılarını, kalıntıları ve tozu temizlemek için buğday kepeğini steril damıtılmış suyla üç kez yıkayın. Bu aynı zamanda fermantasyona müdahale edebilecek basit şekerleri de ortadan kaldırır.
2. Yıkanmış kepeği alüminyum bir tepsiye yayın ve 60 °C fırında 24 saat kurutun.
3. Kuruduktan sonra buğday kepeğini 50 mL'lik steril bir konik tüpe yerleştirin.

2. Aşının hazırlanması

NOT: Bu protokol, aşı hazırlama için üç yöntemi tanımlar: spor süspansiyonu, miselyum diskleri ile doğrudan aşılama ve hücresel süspansiyon. Doğru verim hesaplamaları için ilk aşı konsantrasyonunu belirleyin ve protein seviyelerini ölçün.

1. Spor süspansiyonunun hazırlanması
   1. Miselyum ile doyurulmuş 5 mm çapında bir agar diskini taze bir patates dekstroz agar plakasına aktarın. Plakayı 28 ° C'de 5-7 gün veya miselyum ortamı doyurana kadar inkübe edin. Bazı mantarlar daha uzun bir kuluçka süresi gerektirebilir.
   2. Plakaya 5 mL steril damıtılmış su ekleyin ve steril bir halka kullanarak sporları mekanik olarak ayırın.
   3. Spor süspansiyonunun 1:100 oranında seyreltilmesini hazırlayın. Bir Neubauer odasının ortasına 10 μL yerleştirin ve mikroskop altında sporları sayın. Odanın faktörüne ve seyreltmesine bağlı olarak spor konsantrasyonunu (sporlar / mL) hesaplayın.
2. Sıvı ortamda miselyum yetiştiriciliği
   1. Miselyum ile doyurulmuş 5 mm'lik bir agar diskini taze bir patates-dekstroz-agar plakasına aktarın ve doygunluğa kadar 28 ° C'de inkübe edin.
   2. Steril 125 mL'lik bir şişede ve otoklavda 25 mL patates-dekstroz suyu hazırlayın.
   3. Doymuş plakadan 5 mm'lik bir miselyum diskini steril et suyuna aktarın.
   4. Şişeyi, mantar suşuna bağlı olarak 24-48 saat boyunca 125 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Yavaş büyüyen mantarlar için kuluçka süresini uzatın.
   5. İnokulum için 2 mL ve kuru ağırlık tayini için 2 mL toplayın.
3. Miselyum disklerinin doğrudan aşılanması
   1. Miselyum ile doyurulmuş 5 mm'lik bir agar diskini taze bir patates-dekstroz-agar plakasına yerleştirin. Doygunluğa kadar 28 °C'de inkübe edin.
   2. Kuru ağırlığı belirlemek için bir miselyum diskini inokulum olarak ve diğerini kullanın.

3. SSF sisteminin hazırlanması

NOT: İndükleyiciler doğal veya ticari olabilir. Fermantasyon verimliliğini değiştirebilecek safsızlıkları en aza indirmek için saflaştırılmış ticari indükleyiciler tercih edilir. En az %90 bağıl nemi korumak için su ilavelerini ayarlayın.

1. Aşağıdaki bileşenleri 50 mL'lik steril bir konik tüpte birleştirin: 5 g kuru buğday kepeği; 0.2 g indükleyici (ör., ticari kitin); 5,5 mL su (indükleyicinin su emme kapasitesine göre ayarlayın); 16 g/L monobazik potasyum fosfat, 4 g/L sodyum sülfat, 2 g/L potasyum klorür, 1 g/L kalsiyum klorür, 400 mg/L çinko klorür, 60 mg/L borik asit, 40 mg/L sodyum molibdat, 150 mg/L magnezyum klorür, 100 mg/L demir klorür ve 400 mg/L bakır sülfat içeren 5 mL steril tuz çözeltisi.
2. Elektrot tabanlı bir higrometre kullanarak bağıl nemi ölçün ve minimum %90 nem sağlayın. Nem dağılımının temsili bir ölçümünü elde etmek için elektrot probunu doğrudan reaktöre değişen derinliklerde yerleştirin.
   1. %90'ın altındaysa nemi ayarlamak için aşağıdaki adımları izleyin:
      1. 10 g substrat başına 1 mL'lik artışlarla yavaş yavaş steril damıtılmış su ekleyin. Her eklemeden sonra, nemin eşit dağılımını sağlamak için iyice karıştırın.
      2. Alt tabakanın 10-15 dakika dengelenmesine izin verin. Nem seviyesini yeniden ölçün.
      3. %90'lık hedef neme ulaşılana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın. İşlem boyunca alt tabakayı aşırı ıslatmaktan kaçının.
   2. %90'ın üzerindeyse nemi ayarlamak için aşağıdaki adımları izleyin:
      1. Alt tabakayı steril bir ortamda ince bir şekilde yayın. (1) Alt tabakayı laminer hava akışına maruz bırakarak veya (2) 10-15 dakika boyunca 30 °C'de bir kurutma odasına yerleştirerek fazla nemi alın.
      2. Alternatif olarak, nemin eşit şekilde yeniden dağılmasını sağlamak için alt tabakayı nazikçe karıştırın. Tedaviden sonra nem seviyesini tekrar değerlendirin.
      3. Nem %90'a ulaşana kadar kurutma veya karıştırma adımını gerektiği kadar tekrarlayın. Fermantasyona yalnızca hedef neme ulaşıldığında devam edin.
3. Tüpü 15 psi'de 15 dakika otoklavlayın.
4. Soğuduktan sonra, substratı aşağıdakilerden biriyle aşılayın: 1 mL spor süspansiyonu (1 x 10^6-1 x 10⁷ spor / mL), 2 mL hücresel süspansiyon veya bir 5 mm miselyum diski.

4. Katı hal fermantasyon (SSF) prosedürü

NOT: Farklı zamanlarda kinetik etütler veya parametre değerlendirmeleri için, temsiliyeti sağlamak için her zaman noktası için ayrı tüpler hazırlayın.

1. Tüpleri 1 dakikalık döngülerde 5 dakika boyunca maksimum hızda girdaplayarak alt tabaka topaklanmasını önleyin.
2. Tüpleri yatay eksenli bir döner karıştırıcıya yerleştirin. Alt tabakanın tüplerin içinde serbestçe hareket ettiğinden emin olun. Mikseri 10 rpm'de çalışacak şekilde ayarlayın.
3. Karıştırıcıyı, mikroorganizmanın optimum büyüme sıcaklığında bir inkübatörde inkübe edin. Isıya duyarlı indükleyiciler kullanırken optimum enzimatik aktivite için bildirilen sıcaklığı koruyun.

5. Enzimlerin ekstraksiyonu

NOT: Ekstraksiyon temelleri, hücre dışı enzimin çözünürlüğüne ve pH-maksimum aktivitesine dayanmaktadır. SSF su ortamından kaçınırken, hücre dışı enzim katı matrisi çevreleyen suda yer alır, bu da konsantrasyonun SmF'den daha yüksek olduğu anlamına gelir. Bu bağlamda, en iyi ekstraksiyon tamponunun seçimi, istenen aktivitenin bilgisine bağlıdır. Ekstraksiyonların optimizasyonu, nihai enzim konsantrasyonuna ve kullanılan ekstraksiyon tamponunun tipine bağlıdır.

1. İstenen fermantasyon süresinden sonra, substratı 20 mL önceden soğutulmuş tamponda yeniden süspanse edin. Örnekler şunları içerir: kitinaz ekstraksiyonu için 0.1 M asetat tamponu, pH 5.6; Amilaz ekstraksiyonu için 0.02 M fosfat tamponu, pH 6.9.
2. Tüpleri döngüler halinde girdaplayın: maksimum hızda 1 dakika, ardından buz üzerinde 1 dakika. 10 kez tekrarlayın.
3. Süspansiyonu kağıt filtreler kullanarak filtreleyin ve bastırarak süpernatanı mekanik olarak çıkarın.
4. Süpernatanı, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyerek berraklaştırın.
5. Ham ekstraktı doğrudan kullanın veya enzimi kolon kromatografisi veya santrifüj filtreler aracılığıyla daha fazla saflaştırın. Michaelis sabitini (Km) ve maksimum enzimatik dönüşüm oranını (Vmax) belirlemek için kinetik çalışmalar da ^önerilir.12.

6. Optimizasyon süreci

NOT: İndükleyicilerin kalitesini ve konsantrasyonunu ve ayrıca aşının türünü ve konsantrasyonunu değerlendirerek ve ayarlayarak bu protokolü optimize edin.

1. İdeal fermantasyon süresini belirleyin ve verimliliği artırmak için ekstraksiyon adımlarını iyileştirin.
2. Sıcaklık, pH ve havalandırma dahil olmak üzere çevresel koşulları kontrol edin ve ince ayar yapın.
3. Enzim verimini ve stabilitesini artırmak için çeşitli tamponları ve ekstraksiyon koşullarını test edin.
4. En etkili değişkenleri belirlemek ve optimum enzim üretimini elde etmek için yanıt yüzeyi metodolojisi gibi istatistiksel analizler gerçekleştirin.

Şekil 1A , 50 mL'lik altı konik tüp kapasitesine sahip olan bu sistemde kullanılan döner karıştırıcının şematik gösterimini sunmaktadır. Şekil 2B , katı hal fermantasyon işlemine girmeden önce şartlandırma sırasında buğday kepeğinde meydana gelen değişiklikleri göstermektedir. Görüldüğü gibi önemli bir yapısal değişiklik gözlenmedi.

Şekil 2, bu sistemdeki Trichoderma harzianum mantarı tarafından kitinaz üretimi için 6 günlük katı hal fermantasyonundan sonra buğday kepeğinin doygunluğunu göstermektedir ve indükleyici olarak ticari kitin kullanılmaktadır. Şekil 2A , fermantasyon işleminden önceki orijinal malzemeyi göstermektedir. Mikrograflar, substratın mantar tarafından kullanıldığını doğrular, bu aynı zamanda geçirdiği modifikasyonlara da yansır ve mantarla etkileşime bağlı olarak fraktal benzeri yapısını kaybeder.

Şekil 3'teki sonuçlar, katı hal fermantasyonu (SSF) ve batık fermantasyon (SmF) sistemlerini karşılaştırırken, sırasıyla T. harzianum ve Aspergillus lentulus'tan elde edilen kitinaz aktivitesinde (Şekil 3A) ve amilaz aktivitesinde (Şekil 3B) önemli bir artış olduğunu göstermektedir. Veriler, SigmaPlot yazılımı kullanılarak p < 0.05 olan tek yönlü ANOVA ve Tukey testi ile doğrulanmıştır. Bu bağlamda, bu sistemin farklı enzimatik aktivitelere ve mantarlara uygulanabilir olduğu görülmektedir. A. lentulus, 40 ° C'de inkübe edilen ve amilaz aktivitesinde önemli bir artış gösteren, termotolerant bir mantar olarak karakterize edildi. Hem sıvı hem de katı fermantasyondaki T. harzianum'dan elde edilen kitinaz aktivitesi sonuçları daha önce araştırma grubumuz ^2,5 tarafından ayrı ayrı rapor edilmişti, bu çalışma AMİLAZ aktivitesine benzer şekilde SmF'ye kıyasla SSF'de önemli bir artışı doğruladı ve karşılaştırdı. Grubumuz, mezofilik ve termofilik koşullar altında proteaz ve amilaz üretimi için 50'den fazla mantar suşu ile çalışmıştır ve sonuçlar tutarlıdır.

Sonuçlar, katı hal fermantasyonunun batık fermantasyona kıyasla daha yüksek çıktılar vermesiyle, enzim aktivitesinde önemli artışlar göstererek protokolün başarısını doğrulamaktadır. Bu, SSF'nin hem kitinaz hem de amilaz üretimini arttırmadaki etkinliğini gösterir. Daha önce yayınlanan şekiller, uygun yeniden baskı izni ile yeniden kullanılmıştır.

Şekil 1: Döner katı hal fermantasyon (SSF) sistemine ve buğday kepeği ön işlem sürecine genel bakış. (A) Döner SSF sisteminin şematik gösterimi. (B) Buğday kepeği ön işlem prosesindeki değişiklikler: (I) İlk hammadde, (II) Yıkama aşamasını takiben nemli buğday kepeği, (III) Kurutulmuş buğday kepeği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Trichoderma harzianum ile substrat doygunluğu. (A) SSF'den önceki alt tabaka. (B,C) Farklı büyütmelerde mantar miselyumu ile doyurulmuş substrat. Ölçek çubukları: (A), 50 μm; (B), 200 μm; (C), 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: SSF'de enzimatik aktivite ve T. harzianum ve A. lentulus tarafından batık fermantasyon (SmF). (A) SSF ve SmF'de Trichoderma harzianum tarafından üretilen enzimler tarafından kitosanın hidrolizi yoluyla Glukozamin oluşumunun ve (B) SSF ve SmF'de elde edilen Aspergillus lentulus'un amilaz aktivitesinin karşılaştırılması. Hata çubukları, üç kopyanın standart sapmasını temsil eder. Yıldız işaretleri (*) veriler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir. İstatistiksel varyasyonun her bir enzim tipine özgü olduğunu ve (A) ile (B) arasındaki karşılaştırmalar için geçerli olmadığını unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, filamentli mantarlar için özel olarak tasarlanmış katı hal fermantasyon (SSF) sistemleri aracılığıyla enzim üretimini optimize etmek için ilgili bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Aşağıda, metodolojinin kritik yönleri, önemi, sınırlamaları ve potansiyel uygulamaları ile birlikte tartışılmaktadır.

Protokolün başarısı büyük ölçüde substratın ve aşının hazırlanması gibi önemli adımlara bağlıdır. Buğday kepeğinin uygun şekilde yıkanması ve kurutulması, mantar büyümesine veya enzim üretimine müdahale edebilecek safsızlıkların giderilmesi için gereklidir. Ek olarak, bağıl nemi %90'ın üzerinde tutmak için alt tabaka neminin dikkatli bir şekilde ayarlanması, optimum mantar kolonizasyonu ve aktivitesi^{sağlar 13}. Döner sistemin 10 rpm'de çalışması, eşit karıştırma ve oksijenasyonu teşvik ettiği, substrat topaklanmasını önlediği ve homojen mantar büyümesi sağladığı için bir diğer önemli parametredir¹⁴.

Bu protokolün uyarlanabilirliği, çeşitli mantar türleri ve indükleyicileri ile uyumluluğunda yatmaktadır. Örneğin, bu çalışmada indükleyici olarak ticari kitin ve nişasta kullanılırken, hedef enzime bağlı olarak lignin, selüloz veya kitosan gibi diğer substratlar ikame edilebilir. Eşit olmayan substrat kolonizasyonu gibi yaygın zorlukların giderilmesi, karıştırma parametrelerinin rafine edilmesini veya aşı konsantrasyonunun ayarlanmasını^{içerir 2}. Ayrıca, substrat hazırlama ve aşılama sırasında sterilitenin sağlanması, özellikle endüstriyel ölçekli uygulamalarda kontaminasyonu önlemek için kritik öneme sahiptir¹⁵.

SSFdaldırılmış fermantasyona (SmF) göre çeşitli avantajlar sunarken, sınırlamaları da yoktur¹⁶. En büyük zorluklardan biri, döner SSF'nin ölçeğini büyütmektir.th substrat karıştırma, oksijen difüzyonu veya doğru biyokütle belirleme işleminden ödün vermeden sistem, SSF^17,18. Ek olarak, protokolün buğday kepeği gibi tarımsal-endüstriyel kalıntılara dayanması, partiler arasında substrat bileşimindeki farklılıklar nedeniyle sonuçlarda değişkenliğe neden olabilir. Bu sınırlamalar, büyük ölçekli üretime geçerken daha fazla optimizasyon ihtiyacını vurgulamaktadır^19,20.

Açıklanan döner SSF sistemi, geleneksel statik SSF ve SmF yöntemlerine göre önemli avantajlar göstermektedir. Statik SSF ile karşılaştırıldığında, döner sistem daha düzgün mikrobiyal büyüme sağlayarak oksijen sınırlamalarıyla ilgili sorunları azaltır. Ek olarak, sistemin uyarlanabilirliği, çeşitli mantar formlarına ve enzim türlerine uygulanmasına izin vererek, onu çok yönlü hale getirir¹⁸. SSF sistemleri, metabolit verimliliğini artırmak için çeşitli konfigürasyonlara sahip olabilir. Her sistem türünün, en iyi konfigürasyonu belirlemek için derinlemesine analiz edilmesi gereken avantajları ve dezavantajları vardır. Döner SSF sistemi, geleneksel statik SSF ve SmF'ye göre çeşitli avantajlar sunar; ancak, tepsi ve paket yataklı biyoreaktörler gibi diğer SSF sistemleriyle karşılaştırıldığında zorluklarla karşı karşıyadır. Büyük ölçekli SSF için yaygın olarak kullanılan tepsi biyoreaktörleri, basitlik ve düşük enerji tüketimi sunar, ancak sınırlı oksijen transferi ve nem dağılımı ile ilgili zorluklarla karşı karşıyadır, bu da eşit olmayan mikrobiyal büyümeye ve düşük enzim verimlerine yol açar. Öte yandan, paketlenmiş yataklı biyoreaktörler, cebri hava akışı yoluyla havalandırmayı iyileştirir, ancak özellikle uzun sütunlarda basınç düşüşleri ve eşit olmayan sıcaklık dağılımı ile ilgili sorunlarla karşılaşabilir. Buna karşılık, döner SSF sistemi, anaerobik bölgeleri azaltarak ve enzim verimliliğini artırarak sürekli karıştırma ve homojen koşulları teşvik eder. Bununla birlikte, sürekli rotasyondan kaynaklanan enerji tüketimi ve mekanik aşınma, işletme maliyetlerini artırabilir²¹.

Tepsi biyoreaktörleri gibi statik katı hal fermantasyon sistemleri, sınırlı ısı ve kütle transferi ile kısıtlanır, bu da genellikle 30 °C'nin üzerinde iç sıcaklık gradyanlarına yol açar ve bu da optimal olmayan mikrobiyal performansa neden olur. Bu sistemler genellikle küçük hacimlerde (0.15-0.25 m³) çalışır ve heterojen mikrobiyal kolonizasyondan muzdariptir, çalışmalar substrat gözeneklerinin sadece yaklaşık %34'ünün etkin bir şekilde kullanıldığını göstermektedir. Buna karşılık, dönen biyoreaktörler, 13 m³'e kadar daha büyük çalışma hacimlerini ve %40'a (a/h) ulaşan alt tabaka yüklerini desteklerken, oksijen dağılımını ve substrat homojenliğini artıran mekanik çalkalama sunar. Dikkate değer bir örnek, 49 ° C'de tutulan ve 5 L / dak kg'da havalandırılan dönen bir SSF reaktörünün 14.098 IU / g enzim aktivitesi verdiği Thermoascus aurantiacus tarafından selülaz üretimini içerir - statik koşullar altında elde edilen 4.212 IU / g'dan üç kat daha yüksektir²².

Katı hal fermantasyonunun ölçeklendirilmesi, mikrobiyal kinetiğin korunması ve giderek daha büyük sistemlerde etkili kütle ve ısı transferinin sağlanması arasında hassas bir denge gerektirir. Geleneksel aşamalı yaklaşım, laboratuvar (5-20 kg), pilot (50-5.000 kg) ve endüstriyel (25-1.000 ton) aşamaları içerir. Ölçek büyütme sırasındaki ana zorluklardan biri, 3.200 kcal/kg kuru malzemeye ulaşabilen metabolik ısının dağılmasıdır ki bu özellikle statik veya yetersiz havalandırılan sistemlerde sorunludur. Bunu ele almak için, ölçek büyütme stratejileri genellikle boyutsuz tasarım parametrelerinin kontrolüne ve farklı ölçeklerde oksijen mevcudiyeti ve substrat nem tutma gibi temel değişkenleri korumak için kütle ve enerji dengesi denklemleri dahil olmak üzere matematiksel modelleme yaklaşımlarının uygulanmasına dayanır. Pilot ölçekli sistemler (örn. 150 L ve 6 m³), proses tekrarlanabilirliğini iyileştirmek ve tutarlı ürün randımanı sağlamak için su ceketleri, kavisli karıştırma bıçakları ve kontrollü nem gibi mühendislik özelliklerini başarıyla birleştirmiştir 18,21,22.

Sunulan protokol, küçük bir laboratuvar ölçeğinde enzim üretimi için etkinlik gösterdi. Bununla birlikte, endüstriyel uygulamalar için prosesin ölçeklendirilmesi, öncelikle daha büyük hacimlerde verimli karıştırma ve havalandırmanın sürdürülmesiyle ilgili önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu sınırlamaları ele almak için umut verici bir yaklaşım, katı substrat boyunca sürekli karıştırmayı ve gelişmiş oksijenasyonu teşvik ederek dikey bir karıştırıcının işlevini taklit eden sürekli vidalı bir reaktörün kullanılmasıdır. Bu tasarım, anaerobik bölgelerin oluşumunu azaltır ve endüstriyel ölçekte katı hal fermantasyonunun başarısı için kritik faktörler olan kütle transferini arttırır ^2,15. Bununla birlikte, potansiyel zorluklar arasında katı matrisin yapısal bütünlüğünün korunması ve reaktör boyunca sıcaklık gradyanlarının oluşumunun önlenmesi yer alır. Daha ileri çalışmalar, prosesin fizibilitesini ve verimliliğini sağlamak için operasyonel parametreleri optimize etmeye ve ölçeklendirilmiş koşullar altında enzim verimlerini doğrulamaya odaklanmalıdır.

Bu protokolün potansiyel uygulamaları, gıda biyoteknolojisi, biyoenerji ve çevresel iyileştirme dahil olmak üzere birçok sektöre uzanmaktadır. Örneğin, kitinazlar ve amilazlar gibi hidrolitik enzimlerin gelişmiş üretimi, tarım ve endüstride biyodönüşüm süreçlerini destekleyebilir. Ayrıca, buğday kepeği gibi tarımsal-endüstriyel yan ürünlerin kullanımı, sürdürülebilir uygulamalarla uyumludur, atıkların değerlendirilmesini teşvik eder ve döngüsel bir biyoekonomiye katkıda bulunur²⁰.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, Instituto Politécnico Nacional'ın (SIP-IPN) Secretaría de Investigación y Posgrado tarafından GGS'ye verilen 20220487, 20230676, 20240793 ve 20251269 ve DROH'a verilen 20220492, 20230427, 20240335 ve 20251139 hibe/proje numaraları aracılığıyla desteklenmiştir. Yazarlar, daha önce Consejo Nacional de Ciencia olarak bilinen Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación de México (Secihti), Humanidades y Tecnología (CONAHCyT) ve BEIFI programının yanı sıra Instituto Politécnico Nacional'ın Centro de Nanociencias y Micro y Nanotecnologías'ına paha biçilmez destekleri için şükranlarını sunarlar. López-García, yüksek lisans bursu için Secihti'ye (daha önce CONAHCyT) ve SIP-BEIFI bursu için IPN'ye teşekkür eder. Legorreta-Castañeda, daha önce CONAHCyT olarak bilinen Secihti'nin "Estancias Posdoctorales por México" programından doktora sonrası burs aldı.