Design von Festkörperfermentationssystemen für die polymerhydrolytische extrazelluläre Enzymproduktion durch filamentöse Pilze

Bei diesem Protokoll wird Weizenkleie in einem rotierenden Festkörperfermentationssystem verwendet, um die Enzymproduktion zu verbessern. Das Substrat, ergänzt mit Induktoren wie Chitin, unterstützt das Pilzwachstum unter kontrollierten Bedingungen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Enzymausbeute im Vergleich zur submersen Fermentation 4-6-mal höher ist, was die Anpassungsfähigkeit und Wirksamkeit der Methode für verschiedene biotechnologische Anwendungen zeigt.

Die Festkörperfermentation (SSF) ist ein Biokonversionsverfahren, bei dem ein festes Substrat verwendet wird, das sich nicht in einem wässrigen Medium auflöst. Mikroorganismen wachsen auf der Oberfläche des Substrats und dringen in dessen feste Matrix ein, um essentielle Nährstoffe für ihre Entwicklung zu extrahieren. SSF zeichnet sich durch ein Minimum an freiem Wasser mit einem Feuchtigkeitsgehalt des Substrats von über 70 % aus und umfasst drei miteinander verbundene Phasen - gasförmig, flüssig und fest. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Weizenkleie, einem agroindustriellen Nebenprodukt, als Basissubstrat für die Enzymproduktion in einem Rotationssystem. Das Substrat wird mit einem Induktor wie Chitin, Chitosan, Stärke oder Cellulose ergänzt, um die Synthese hydrolytischer Proteine zu fördern. Das System ist sehr anpassungsfähig und ermöglicht die Verwendung verschiedener Pilzformen, einschließlich Myzel, Sporen oder Pellets. Bei der beschriebenen Methodik werden Induktor und Substrat im Verhältnis 1:100 (w/w) gemischt, durch Autoklavieren sterilisiert und mit sterilem Wasser auf den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt eingestellt. Dann wird das Pilzinokulum hinzugefügt, und das Rotationssystem arbeitet mit 10 U/min, um eine ausreichende Durchmischung und Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Das System wird 6-8 Tage lang unter optimalen Wachstumsbedingungen für mesophile oder thermophile/thermotolerante Pilze inkubiert, was seine Vielseitigkeit erhöht. Nach der Inkubation wird das Enzym je nach Art des Enzyms leicht unter Verwendung eines geeigneten Kältepuffers (z. B. Acetat, Citrat oder Phosphat) extrahiert. Der Extrakt wird durch Zentrifugation und Filtration geklärt, um einen zellfreien Überstand zu erhalten. Das Enzym kann dann je nach Bedarf weiter konzentriert oder gereinigt werden. Die Ergebnisse zeigten eine 4-6-fache Steigerung der Enzymaktivität im Vergleich zur submersen Fermentation (SmF), was die Wirksamkeit des Systems unterstreicht. Seine Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Substrate, Induktoren und Pilzarten macht es zu einem wertvollen Werkzeug für verschiedene biotechnologische Anwendungen.

Die Festkörperfermentation (SSF) hat sich zu einer vielversprechenden und nachhaltigen Biokonversionstechnologie für die Herstellung hochwertiger Enzyme, bioaktiver Verbindungen und Sekundärmetaboliten entwickelt. Bei dieser Technik werden Mikroorganismen auf festen Substraten mit minimalem freiem Wasser gezüchtet, wodurch ihre natürliche Umgebung simuliert und eine effiziente Stoffwechselaktivität ermöglicht^{wird 1}. Das Hauptziel dieses Protokolls ist die Optimierung der Enzymproduktion durch ein rotierendes SSF-System, das eine verbesserte Substratausnutzung, Sauerstoffdiffusion und Prozessskalierbarkeit gewährleistet. Die Verwendung von Weizenkleie, einem reichlich vorhandenen agroindustriellen Nebenprodukt, als Basissubstrat trägt zur Verwertung landwirtschaftlicher Reststoffe bei und fördert zirkuläre Bioökonomiepraktiken².

SSF hat gegenüber der Unterwasserfermentation (SmF) erhebliche Vorteile, darunter einen geringeren Energie- und Wasserverbrauch, eine höhere Produktkonzentration und die Kompatibilität mit einer Vielzahl von kostengünstigen landwirtschaftlichen Reststoffen wie Weizenkleie, Reishülsen und Zuckerrohr-Bagasse³. Im Gegensatz zu SmF, das große Mengen an Wasser und teuren Nährmedien benötigt, nutzen SSF-Systeme feste Matrices, die nicht nur als mikrobielle Wachstumsoberflächen dienen, sondern auch Nährstoffe liefern, die für die mikrobielle Aktivität unerlässlich sind. Darüber hinaus minimiert das begrenzte freie Wasser in SSF das Kontaminationsrisiko, was es zu einer robusteren Option für die Enzymproduktion in industriellen Umgebungen macht⁴. Zusätzlich zu seinen betrieblichen Vorteilen bietet SSF im Vergleich zur Unterwasserfermentation (SmF) erhebliche ökologische und wirtschaftliche Vorteile. Studien haben gezeigt, dass SSF den Wasserverbrauch um 50 % bis 70 % senkt und die Energiekosten um mehr als 30 % senkt, da keine großen Wassermengen vorhanden sind, die ein ständiges Rühren und Belüften erfordern. Darüber hinaus minimiert die Verwendung agroindustrieller Reststoffe als Substrate die Rohstoffkosten und fördert Praktiken der Kreislaufwirtschaft durch die Wiederverwendung landwirtschaftlicher Nebenprodukte ^2,4.

SSF wurde umfassend auf seine Effizienz und Skalierbarkeit validiert. So haben Studien beispielsweise eine 4- bis 6-fache Steigerung der Enzymaktivität mit SSF im Vergleich zu SmF berichtet, was die wirtschaftlichen und ökologischen Vorteile dieser Technik hervorhebt ^2,5. Darüber hinaus wird der nachgelagerte Prozess vereinfacht, da die Enzymextraktion in der Regel weniger Wasser und weniger Reinigungsschritte erfordert. Dies macht SSF besonders attraktiv für Branchen, die darauf abzielen, Betriebskosten und Umweltauswirkungen zu senken⁶.

Das in diesem Protokoll beschriebene rotierende SSF-System bietet mehrere Verbesserungen gegenüber herkömmlichen statischen SSF-Methoden. Während statische Systeme oft mit Herausforderungen wie ungleichmäßiger Substratbesiedlung und Sauerstoffbegrenzung konfrontiert sind, gewährleistet die rotierende Konfiguration eine gründliche Durchmischung und Belüftung und fördert so ein gleichmäßiges mikrobielles Wachstum ^7,8,9. Zum Beispiel wurde dieses System erfolgreich eingesetzt, um hydrolytische Enzyme wie Chitinasen, Amylasen und Proteasen unter Verwendung von Pilzspezies wie Aspergillus und Trichoderma² herzustellen.

Ein wesentliches Merkmal dieses SSF-Systems ist seine Anpassungsfähigkeit. Die Verwendung von Weizenkleie als Basissubstrat zeigt das Potenzial agroindustrieller Reststoffe für eine kostengünstige Biokonversion³. Darüber hinaus verbessert die Supplementierung des Substrats mit Induktoren wie Chitin, Chitosan und Stärke die Enzymsynthese weiter, indem spezifische Stoffwechselwege stimuliert^{werden 2,10}. Das System ist auch mit verschiedenen Pilzformen kompatibel, einschließlich Sporen, Myzel und Pellets, so dass der Benutzer den Prozess an seine spezifischen Anforderungen anpassen kann².

SSF bietet ein breites Anwendungspotenzial in verschiedenen Bereichen wie Lebensmittelbiotechnologie, Biokraftstoffproduktion und Umweltsanierung¹¹. Die Integration kostengünstiger Substrate, außergewöhnliche Enzymausbeuten und eine hohe Prozessflexibilität machen SSF zu einem unverzichtbaren Ansatz für biotechnologische Innovationen im industriellen Maßstab.

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Untergrunds

HINWEIS: Verwenden Sie eine handelsübliche Weizenkleiemarke, um signifikante Schwankungen der Substrateigenschaften zu minimieren. Jede Charge Weizenkleie variiert aufgrund mehrerer Faktoren, was sie zu einem heterogenen Material macht, das schwer zu standardisieren ist, was zu Schwankungen im Gehalt an Bestandteilen führt. Wenn ein standardisiertes Material benötigt wird, wählen Sie eine alternative Matrix oder führen Sie eine chemische Analyse jeder Charge Weizenkleie durch, um sie an die Bedürfnisse anzupassen.

1. Waschen Sie die Weizenkleie dreimal mit sterilem destilliertem Wasser, um Rückstände von organischen Stoffen, Schmutz und Staub zu entfernen. Dadurch werden auch einfache Zucker entfernt, die die Gärung beeinträchtigen könnten.
2. Die gewaschene Kleie auf einem Alublech verteilen und im Backofen bei 60 °C 24 h trocknen.
3. Nach dem Trocknen die Weizenkleie in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen geben.

2. Vorbereitung des Inokulums

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt drei Methoden zur Inokulumvorbereitung: Sporensuspension, direkte Inokulation mit Myzelscheiben und zelluläre Suspension. Ermitteln Sie die anfängliche Inokulumkonzentration und quantifizieren Sie den Proteingehalt für genaue Ausbeuteberechnungen.

1. Herstellung der Sporensuspension
   1. Übertragen Sie eine mit Myzel getränkte Agarscheibe mit einem Durchmesser von 5 mm auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 5-7 Tage oder bis das Myzel das Medium gesättigt hat. Einige Pilze benötigen möglicherweise eine längere Inkubationszeit.
   2. Geben Sie 5 ml steriles destilliertes Wasser auf die Platte und lösen Sie die Sporen mechanisch mit einer sterilen Schlaufe.
   3. Bereiten Sie eine Verdünnung der Sporensuspension im Verhältnis 1:100 vor. Legen Sie 10 μL in die Mitte einer Neubauer-Kammer und zählen Sie die Sporen unter dem Mikroskop. Berechnen Sie die Sporenkonzentration (Sporen/ml) basierend auf dem Faktor der Kammer und der Verdünnung.
2. Kultivierung von Myzel in flüssigem Medium
   1. Eine mit Myzel gesättigte 5 mm Agarscheibe auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Agar-Platte geben und bei 28 °C bis zur Sättigung inkubieren.
   2. Bereiten Sie 25 ml Kartoffel-Dextrose-Brühe in einem sterilen 125-ml-Kolben und Autoklaven zu.
   3. Übertragen Sie eine 5 mm große Myzelscheibe von der gesättigten Platte in die sterile Brühe.
   4. Inkubieren Sie den Kolben auf einem Schüttler bei 125 U/min für 24-48 h, je nach Pilzstamm. Verlängern Sie die Inkubationszeit für langsam wachsende Pilze.
   5. Entnehmen Sie 2 mL für das Inokulum und 2 mL für die Bestimmung des Trockengewichts.
3. Direkte Inokulation von Myzelscheiben
   1. Legen Sie eine 5 mm dicke, mit Myzel getränkte Agarscheibe auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Agarplatte. Bei 28 °C bis zur Sättigung inkubieren.
   2. Verwenden Sie eine Myzelscheibe als Inokulum und eine andere, um das Trockengewicht zu bestimmen.

3. Vorbereitung des SSF-Systems

HINWEIS: Induktoren können natürlich oder kommerziell sein. Gereinigte kommerzielle Induktoren werden bevorzugt, um Verunreinigungen zu minimieren, die die Fermentationseffizienz beeinträchtigen könnten. Passen Sie die Wasserzugabe an, um eine relative Luftfeuchtigkeit von mindestens 90 % aufrechtzuerhalten.

1. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen: 5 g trockene Weizenkleie; 0,2 g des Induktors (z. B. kommerzielles Chitin); 5,5 ml Wasser (je nach Wasseraufnahmekapazität des Induktors anpassen); 5 ml einer sterilen Salzlösung mit 16 g/l monobasischem Kaliumphosphat, 4 g/l Natriumsulfat, 2 g/l Kaliumchlorid, 1 g/l Calciumchlorid, 400 mg/l Zinkchlorid, 60 mg/l Borsäure, 40 mg/l Natriummolybdat, 150 mg/l Magnesiumchlorid, 100 mg/l Eisenchlorid und 400 mg/l Kupfersulfat.
2. Messen Sie die relative Luftfeuchtigkeit mit einem elektrodenbasierten Hygrometer und stellen Sie eine Luftfeuchtigkeit von mindestens 90 % sicher. Führen Sie die Elektrodensonde in unterschiedlichen Tiefen direkt in den Reaktor ein, um eine repräsentative Messung der Feuchtigkeitsverteilung zu erhalten.
   1. Befolgen Sie die Schritte, um die Luftfeuchtigkeit einzustellen, wenn sie unter 90 % liegt:
      1. Fügen Sie nach und nach steriles destilliertes Wasser in Schritten von 1 ml pro 10 g Substrat hinzu. Nach jeder Zugabe gründlich mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Feuchtigkeit zu gewährleisten.
      2. Lassen Sie das Substrat 10-15 Minuten lang äquilibrieren. Messen Sie die Luftfeuchtigkeit erneut.
      3. Wiederholen Sie die obigen Schritte, bis die Zielluftfeuchtigkeit von 90 % erreicht ist. Vermeiden Sie eine Überbenetzung des Substrats während des gesamten Prozesses.
   2. Befolgen Sie die Schritte, um die Luftfeuchtigkeit einzustellen, wenn sie über 90 % liegt:
      1. Verteilen Sie das Substrat dünn in einer sterilen Umgebung. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit, indem Sie (1) das Substrat einer laminaren Luftströmung aussetzen oder (2) es für 10-15 Minuten in eine Trockenkammer bei 30 °C legen.
      2. Alternativ können Sie das Substrat vorsichtig mischen, um eine gleichmäßige Feuchtigkeitsverteilung zu fördern. Beurteilen Sie nach der Behandlung die Luftfeuchtigkeit neu.
      3. Wiederholen Sie den Trocknungs- oder Mischschritt nach Bedarf, bis die Luftfeuchtigkeit 90 % erreicht. Fahren Sie mit der Gärung erst fort, wenn die gewünschte Feuchtigkeit erreicht ist.
3. Autoklavieren Sie das Rohr 15 Minuten lang bei 15 psi.
4. Beimpfen Sie das Substrat nach dem Abkühlen mit einem der folgenden Mittel: 1 ml Sporensuspension (1 x 10^6-1 x 10⁷ Sporen/ml), 2 ml zelluläre Suspension oder eine 5 mm Myzelscheibe.

4. Verfahren der Feststofffermentation (SSF)

HINWEIS: Für kinetische Studien oder Parameterauswertungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten sind für jeden Zeitpunkt separate Röhrchen vorzubereiten, um die Repräsentativität zu gewährleisten.

1. Vermeiden Sie das Verklumpen des Substrats, indem Sie die Schläuche 5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in 1-Minuten-Zyklen vortexen.
2. Legen Sie die Röhrchen in einen Rotationsmischer mit einer horizontalen Achse. Stellen Sie sicher, dass sich das Substrat frei in den Rohren bewegt. Stellen Sie den Mischer auf 10 U/min ein.
3. Inkubieren Sie den Mischer in einem Inkubator bei der optimalen Wachstumstemperatur des Mikroorganismus. Halten Sie die angegebene Temperatur für eine optimale enzymatische Aktivität aufrecht, wenn wärmeempfindliche Induktoren verwendet werden.

5. Extraktion von Enzymen

HINWEIS: Die Grundlagen der Extraktion basieren auf der Löslichkeit und der pH-maximalen Aktivität des extrazellulären Enzyms. Da SSF das Medium Wasser meidet, ist das extrazelluläre Enzym an dem Wasser beteiligt, das die feste Matrix umgibt, was bedeutet, dass die Konzentration höher ist als bei SmF. In diesem Zusammenhang hängt die Auswahl des besten Extraktionspuffers von der Kenntnis der gewünschten Aktivität ab. Die Optimierung der Extraktionen hängt von der endgültigen Enzymkonzentration und der Art des verwendeten Extraktionspuffers ab.

1. Nach der gewünschten Fermentationszeit wird das Substrat in 20 ml vorgekühltem Puffer resuspendiert. Beispiele hierfür sind: 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,6, für die Chitinase-Extraktion; 0,02 M Phosphatpuffer, pH 6,9, für die Amylase-Extraktion.
2. Wirbeln Sie die Röhren in Zyklen: 1 min bei maximaler Geschwindigkeit, danach 1 min auf Eis. 10 Mal wiederholen.
3. Die Suspension mit Papierfiltern filtrieren und den Überstand durch Pressen mechanisch herausziehen.
4. Der Überstand wird durch Zentrifugieren bei 3000 x g für 15 min bei 4 °C geklärt.
5. Verwenden Sie den Rohextrakt direkt oder reinigen Sie das Enzym über Säulenchromatographie oder Zentrifugalfilter weiter. Kinetische Studien werden auch empfohlen, um die Michaelis-Konstante (Km) und die maximale Rate der enzymatischen Transformation (Vmax) zu ^bestimmen12.

6. Optimierungsprozess

HINWEIS: Optimieren Sie dieses Protokoll, indem Sie die Qualität und Konzentration der Induktoren sowie die Art und Konzentration des Inokulums bewerten und anpassen.

1. Bestimmen Sie die ideale Fermentationszeit und verfeinern Sie die Extraktionsschritte, um die Effizienz zu verbessern.
2. Kontrollieren und optimieren Sie die Umgebungsbedingungen, einschließlich Temperatur, pH-Wert und Belüftung.
3. Testen Sie verschiedene Puffer und Extraktionsbedingungen, um die Enzymausbeute und -stabilität zu verbessern.
4. Führen Sie statistische Analysen durch, wie z. B. die Reaktionsoberflächenmethodik, um die einflussreichsten Variablen zu identifizieren und eine optimale Enzymproduktion zu erreichen.

Abbildung 1A zeigt die schematische Darstellung des in diesem System verwendeten Rotationsmischers, der ein Fassungsvermögen von sechs konischen Röhrchen von 50 mL hat. Abbildung 2B veranschaulicht die Veränderungen, die in der Weizenkleie während der Konditionierung vor dem Eintritt in den Festkörperfermentationsprozess auftreten. Wie zu sehen ist, wurden keine signifikanten strukturellen Veränderungen beobachtet.

Abbildung 2 zeigt die Sättigung der Weizenkleie nach 6 Tagen Feststofffermentation für die Chitinase-Produktion durch den Pilz Trichoderma harzianum in diesem System, wobei kommerzielles Chitin als Induktor verwendet wurde. Abbildung 2A zeigt das Ausgangsmaterial vor dem Fermentationsprozess. Die Schliffbilder bestätigen die Nutzung des Substrats durch den Pilz, was sich auch in den Veränderungen widerspiegelt, die es erfährt und durch die Wechselwirkung mit dem Pilz seine fraktalartige Struktur verliert.

Die Ergebnisse in Abbildung 3 zeigen einen signifikanten Anstieg der Chitinase-Aktivität (Abbildung 3A) und der Amylase-Aktivität (Abbildung 3B) aus T. harzianum bzw. Aspergillus lentulus, wenn man die Systeme der Festkörperfermentation (SSF) und der Unterwasserfermentation (SmF) vergleicht. Die Daten wurden durch einen Einweg-ANOVA- und Tukey-Test mit p < 0,05 unter Verwendung der SigmaPlot-Software validiert. In diesem Zusammenhang wird beobachtet, dass dieses System auf verschiedene enzymatische Aktivitäten und Pilze anwendbar ist. A. lentulus wurde als thermotoleranter Pilz charakterisiert, der bei 40 °C inkubiert wurde und einen signifikanten Anstieg seiner Amylaseaktivität zeigte. Die Chitinase-Aktivitätsergebnisse von T. harzianum sowohl in flüssiger als auch in fester Fermentation wurden zuvor von unserer Forschungsgruppe^{getrennt berichtet 2,5}, wobei diese Arbeit einen signifikanten Anstieg von SSF im Vergleich zu SmF bestätigt und vergleicht, ähnlich wie die Amylase-Aktivität. Unsere Gruppe hat mit mehr als 50 Pilzstämmen für die Produktion von Proteasen und Amylasen unter mesophilen und thermophilen Bedingungen gearbeitet, und die Ergebnisse sind konsistent.

Die Ergebnisse bestätigen den Erfolg des Protokolls, indem sie eine signifikante Steigerung der Enzymaktivität zeigen, wobei die Festkörperfermentation im Vergleich zur Unterwasserfermentation höhere Ergebnisse liefert. Dies deutet auf die Wirksamkeit von SSF bei der Steigerung der Chitinase- und Amylaseproduktion hin. Bereits veröffentlichte Abbildungen wurden mit entsprechender Nachdruckgenehmigung weiterverwendet.

Abbildung 1: Überblick über das rotierende Festkörperfermentationssystem (SSF) und den Vorbehandlungsprozess der Weizenkleie. (A) Schematische Darstellung des rotierenden SSF-Systems. (B) Änderungen im Vorbehandlungsprozess der Weizenkleie: (I) Ausgangsrohstoff, (II) Feuchte Weizenkleie nach dem Waschschritt, (III) Getrocknete Weizenkleie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Substratsättigung durch Trichoderma harzianum. (A) Substrat vor SSF. (B,C) Substrat mit Pilzmyzel in verschiedenen Vergrößerungen gesättigt. Maßstabsleisten: (A), 50 μm; (B) 200 μm; (C), 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Enzymatische Aktivität in SSF und submerser Fermentation (SmF) durch T. harzianum und A. lentulus. Vergleich von (A) Glucosaminbildung durch Hydrolyse von Chitosan durch Enzyme, die von Trichoderma harzianum in SSF und SmF produziert werden, und (B) Amylaseaktivität von Aspergillus lentulus , erhalten in SSF und SmF. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei Replikaten dar. Sternchen (*) zeigen einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Daten an. Es ist zu beachten, dass die statistische Variation für jeden Enzymtyp spezifisch ist und nicht für Vergleiche zwischen (A) und (B) gilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diese Studie skizziert ein relevantes Protokoll zur Optimierung der Enzymproduktion durch Festkörperfermentationssysteme (SSF), die speziell für filamentöse Pilze entwickelt wurden. Im Folgenden werden kritische Aspekte der Methodik sowie ihre Bedeutung, Grenzen und Anwendungsmöglichkeiten diskutiert.

Der Erfolg des Protokolls hängt stark von wichtigen Schritten wie der Vorbereitung des Substrats und des Inokulums ab. Das richtige Waschen und Trocknen der Weizenkleie ist unerlässlich, um Verunreinigungen zu beseitigen, die das Pilzwachstum oder die Enzymproduktion beeinträchtigen können. Darüber hinaus gewährleistet die sorgfältige Anpassung der Substratfeuchtigkeit, um die relative Luftfeuchtigkeit über 90 % zu halten, eine optimale Pilzbesiedlung und -aktivität¹³. Der Betrieb des Rotationssystems mit 10 U/min ist ein weiterer entscheidender Parameter, da er eine gleichmäßige Durchmischung und Sauerstoffversorgung fördert, das Verklumpen des Substrats verhindert und ein gleichmäßiges Pilzwachstum gewährleistet¹⁴.

Die Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls liegt in seiner Verträglichkeit mit verschiedenen Pilzarten und Induktoren. Während in dieser Studie beispielsweise kommerzielles Chitin und Stärke als Induktoren verwendet wurden, konnten je nach Zielenzym andere Substrate wie Lignin, Cellulose oder Chitosan substituiert werden. Die Fehlerbehebung bei häufigen Herausforderungen, wie z. B. ungleichmäßiger Substratbesiedlung, erfordert die Verfeinerung der Mischparameter oder die Anpassung der Inokulumkonzentration². Darüber hinaus ist die Gewährleistung der Sterilität während der Substratvorbereitung und -beimpfung von entscheidender Bedeutung, um eine Kontamination zu verhindern, insbesondere bei Anwendungen im industriellen Maßstab¹⁵.

SSF bietet zwar mehrere Vorteile gegenüber der submersen Fermentation (SmF), ist aber nicht ohne Einschränkungen¹⁶. Eine große Herausforderung besteht darin, das rotierende SSF-System zu skalieren, ohne die Substratmischung, die Sauerstoffdiffusion oder die genaue Biomassebestimmung zu beeinträchtigen, ein weiteres häufiges Problem bei SSF^17,18. Darüber hinaus kann die Abhängigkeit des Protokolls von agroindustriellen Rückständen wie Weizenkleie aufgrund von Unterschieden in der Substratzusammensetzung zwischen den Chargen zu Variabilität der Ergebnisse führen. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit weiterer Optimierungen beim Übergang zur Großproduktion^19,20.

Das beschriebene rotierende SSF-System zeigt signifikante Vorteile gegenüber herkömmlichen statischen SSF- und SmF-Methoden. Im Vergleich zu statischem SSF sorgt das Rotationssystem für ein gleichmäßigeres mikrobielles Wachstum und reduziert Probleme im Zusammenhang mit Sauerstoffbeschränkungen. Darüber hinaus ermöglicht die Anpassungsfähigkeit des Systems die Anwendung auf verschiedene Pilzformen und Enzymtypen, was es sehr vielseitig macht¹⁸. SSF-Systeme können verschiedene Konfigurationen haben, um die Produktivität der Metaboliten zu steigern. Jeder Systemtyp hat Vor- und Nachteile, die eingehend analysiert werden müssen, um die beste Konfiguration zu ermitteln. Das rotierende SSF-System bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen statischen SSF und SmF. Im Vergleich zu anderen SSF-Systemen, wie z. B. Tray- und Packbett-Bioreaktoren, steht es jedoch vor Herausforderungen. Tablett-Bioreaktoren, die üblicherweise für großtechnische SSF verwendet werden, bieten Einfachheit und geringen Energieverbrauch, stehen jedoch vor Herausforderungen im Zusammenhang mit begrenztem Sauerstofftransfer und Feuchtigkeitsverteilung, was zu ungleichmäßigem mikrobiellem Wachstum und verringerten Enzymausbeuten führt. Packbett-Bioreaktoren hingegen verbessern die Belüftung durch erzwungene Luftströmung, können jedoch Probleme mit Druckabfällen und ungleichmäßiger Temperaturverteilung haben, insbesondere bei hohen Säulen. Im Gegensatz dazu fördert das rotierende SSF-System ein kontinuierliches Mischen und homogene Bedingungen, wodurch anaerobe Zonen reduziert und die Enzymproduktivität gesteigert werden. Nichtsdestotrotz können der Energieverbrauch und der mechanische Verschleiß aufgrund der kontinuierlichen Rotation die Betriebskosten erhöhen²¹.

Statische Festkörperfermentationssysteme, wie z. B. Tray-Bioreaktoren, sind durch einen begrenzten Wärme- und Stofftransport eingeschränkt, was oft zu internen Temperaturgradienten von über 30 °C führt, was zu einer suboptimalen mikrobiellen Leistung führt. Diese Systeme arbeiten in der Regel mit kleinen Volumina (0,15-0,25 m³) und leiden unter einer heterogenen mikrobiellen Besiedlung, wobei Studien zeigen, dass nur etwa 34 % der Substratporen effektiv genutzt werden. Im Gegensatz dazu bieten rotierende Bioreaktoren ein mechanisches Rühren, das die Sauerstoffverteilung und die Homogenität des Substrats verbessert und gleichzeitig größere Betriebsvolumina von bis zu 13 m³ und Substratlasten von bis zu 40 % (w/v) unterstützt. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Cellulaseproduktion durch Thermoascus aurantiacus, bei der ein rotierender SSF-Reaktor, der bei 49 °C gehalten und bei 5 l/min·kg belüftet wurde, eine Enzymaktivität von 14.098 IE/g ergab - mehr als dreimal so hoch wie die 4.212 IE/g, die unter statischen Bedingungen erzielt wurden²².

Die Skalierung der Festkörperfermentation erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Aufrechterhaltung der mikrobiellen Kinetik und der Gewährleistung eines effektiven Stoff- und Wärmetransfers in immer größeren Systemen. Der traditionelle schrittweise Ansatz umfasst Labor- (5-20 kg), Pilot- (50-5.000 kg) und industrielle (25-1.000 Tonnen) Phasen. Eine der größten Herausforderungen beim Scale-up ist die Ableitung von Stoffwechselwärme, die bis zu 3.200 kcal/kg trockenes Material erreichen kann, was besonders in statischen oder schlecht belüfteten Systemen problematisch ist. Um dies zu erreichen, stützen sich Scale-up-Strategien oft auf die Kontrolle dimensionsloser Designparameter und die Anwendung mathematischer Modellierungsansätze, einschließlich Massen- und Energiebilanzgleichungen, um Schlüsselvariablen wie Sauerstoffverfügbarkeit und Feuchtigkeitsspeicherung des Substrats über verschiedene Skalen hinweg zu erhalten. Systeme im Pilotmaßstab (z. B. 150 l und 6 m³) haben erfolgreich technische Merkmale wie Wassermäntel, gebogene Rührflügel und kontrollierte Luftfeuchtigkeit integriert, um die Reproduzierbarkeit des Prozesses zu verbessern und konsistente Produktausbeuten zu gewährleisten 18,21,22.

Das vorgestellte Protokoll zeigte die Wirksamkeit für die Enzymproduktion im kleinen Labormaßstab. Die Skalierung des Verfahrens für industrielle Anwendungen stellt jedoch erhebliche Herausforderungen dar, die vor allem mit der Aufrechterhaltung einer effizienten Mischung und Belüftung in größeren Volumina zusammenhängen. Ein vielversprechender Ansatz, um diese Einschränkungen zu überwinden, ist die Verwendung eines kontinuierlichen Schneckenreaktors, der die Funktion eines vertikalen Mischers nachahmt, indem er eine kontinuierliche Durchmischung und eine verbesserte Sauerstoffversorgung des gesamten festen Substrats fördert. Diese Konstruktion reduziert die Bildung anaerober Zonen und verbessert den Stofftransport, die für den Erfolg der Festkörperfermentation im industriellen Maßstab entscheidend sind ^2,15. Zu den potenziellen Herausforderungen gehören jedoch die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der festen Matrix und die Verhinderung der Bildung von Temperaturgradienten entlang des Reaktors. Weitere Studien sollten sich auf die Optimierung der Betriebsparameter und die Validierung der Enzymausbeute unter hochskalierten Bedingungen konzentrieren, um die Machbarkeit und Effizienz des Prozesses sicherzustellen.

Die Anwendungsmöglichkeiten dieses Protokolls erstrecken sich auf mehrere Sektoren, darunter Lebensmittelbiotechnologie, Bioenergie und Umweltsanierung. So kann beispielsweise die verstärkte Produktion von hydrolytischen Enzymen wie Chitinasen und Amylasen Biokonversionsprozesse in Landwirtschaft und Industrie unterstützen. Darüber hinaus steht die Verwendung agroindustrieller Nebenprodukte wie Weizenkleie im Einklang mit nachhaltigen Praktiken, fördert die Verwertung von Abfällen und trägt zu einer zirkulären Bioökonomie^{bei 20}.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Diese Arbeit wurde von der Secretaría de Investigación y Posgrado des Instituto Politécnico Nacional (SIP-IPN) durch die Förder-/Projektnummern 20220487, 20230676, 20240793 und 20251269 an GGS und 20220492, 20230427, 20240335 und 20251139 an DROH vergeben. Die Autoren danken dem ENCB-IPN, der Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación de México (Secihti), ehemals Consejo Nacional de Ciencia, Humanidades y Tecnología (CONAHCyT), und dem BEIFI-Programm sowie dem Centro de Nanociencias y Micro y Nanotecnologías des Instituto Politécnico Nacional für ihre unschätzbare Unterstützung. López-García dankt Secihti (ehemals CONAHCyT) für das Masterstipendium sowie IPN für das SIP-BEIFI-Stipendium. Legorreta-Castañeda ist Stipendiatin eines Postdoktorandenstipendiums des Programms "Estancias Posdoctorales por México" der Secihti, ehemals CONAHCyT.