Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Üç boyutlu (3D) hücre kültürleri, hücreler ve hücre dışı matris arasında gelişmiş etkileşimleri teşvik ettikleri için, in vivo mikro ortamın geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlere göre daha doğru bir temsilini sağlar. Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için yenilikçi bir damga tabanlı sistem kullanarak 3D hücre yapıları (sferoidler/organoidler) oluşturmak için verimli, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir metodoloji geliştirmeyi amaçlamıştır. 6 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 663 mikro kuyu üretmek için yeni bir damga kullanıldı ve hücre agregasyonu için ideal bir ortam sağlandı. Birincil domuz pankreas adacık hücreleri, bu mikro kuyulara ekildi ve burada sferoidler/organoidler oluşturmak üzere toplandılar. Kültürler 37 ° C'de% 5 CO₂ altında inkübe edildi ve ortam her 3 günde bir değiştirildi. Sferoid oluşumu periyodik olarak izlendi ve karakterizasyon için örnekler toplandı. Yöntem, deneysel değişkenliği azaltarak, manipülasyonu en aza indirerek ve hücre etkileşimlerini geliştirerek başarılı bir şekilde tek tip ve yüksek kaliteli sferoidler üretti. Agaroz bazlı mikro model kalıpların kullanımı, 3D kültürler için basitleştirilmiş, kontrollü bir ortam sağlayarak standartlaştırılmış ve uygun maliyetli bir çözüm sundu. Bu metodoloji, ilaç testi ve doku mühendisliği uygulamalarını destekleyerek, çeşitli laboratuvar ortamlarında kolayca uygulanabilen 3D hücre kültürü modelleri için pratik ve ölçeklenebilir bir platform sunar.

Son 50 yılda, çok sayıda hücre biyolojisi araştırması, iki boyutlu (2D) kültürlerin, hayvan modellerinde gözlemlenen in vivo koşulları doğru bir şekilde kopyalayamadığını göstermiştir¹. Yapısal olarak, 2D hücre kültürleri, hücrelerin üç boyutlu olarak düzenlenmesine ve in vivo sistemlerde gözlemlenen durumu kopyalamasına izin vermez. Ayrıca, hücresel sinyal yolakları, üç boyutlu (3D) kültürlere kıyasla 2D kültürlerde değiştirilir, bu da 2D kültürleri kullanan belirli ilaç taraması türlerinin neden bu kadar tutarsız olduğunu açıklayabilir². 3D kültür sistemlerinin tanıtılmasıyla hücre kültürü tekniklerinde önemli bir gelişme ortaya çıkmıştır. 3D sistemler, hücresel bileşime ve sitomimariye bağlı olarak karmaşıklık açısından önemli ölçüde değişir. Genel olarak, iki tür yapı üretilir, yani: sferoidler ve organoidler. Sferoidler, normal veya tümör dokularından, embriyoid cisimciklerinden ve hücre dizilerinden elde edilen basit hücre kümeleri olarak tanımlanır. 3D yapıların oluşumu, yapısal destek ve biyokimyasal ipuçları sağlayan hücre dışı matris (ECM) bileşenlerinin aracılık ettiği hücre-hücre etkileşimleri ve sinyal yolları dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden etkilenir. Bu elementler, doku organizasyonuna ve işlevine katkıda bulunan etkileşimleri düzenler³. Küresel kültür sistemi ilk olarak 1970'lerin başında, nodüler karsinomların bir modeli olarak V79 Çin hamster akciğer hücre hatları kullanılarak, yapışık olmayan koşullar altında büyüyen ve mükemmel küreler oluşturan tanımlanmıştır⁴. Organoidler, hücre sıralama ve soy spesifikasyonu gibi süreçler yoluyla mekansal olarak sınırlı bir şekilde kendi kendini organize eden ve in vivo gelişimi yansıtan kök veya progenitör hücrelerden türetilen organa özgü hücre tipleri kümeleri olarak tanımlanır⁵.

3D koşullar altında hücreleri kültürlemek için çeşitli mevcut yöntemler ve malzemeler mevcuttur. Şu anda 3D kültürler oluşturmak için kullanılan ana yöntemler şunlardır: 1) asılı damlalar; 2) dönen hücre kültürü ve düşük bağlı plastikler; 3) konik kuyular içeren piramit plakalar; 4) makro gözenekli iskeleler; 5) manyetik boncuklar; ve 6) iskele içermeyen hidrojeller.

Asılı damlalar, iskelesiz 3D kültürler elde etmek için kullanılan yöntemdir. Bu yöntem, kapsamlı taşıma ihtiyacı, düşük üretim verimliliği, küresel geometri ve yüksek kesme kuvvetlerine maruz kalma dahil olmak üzere belirli sınırlamalar sunar. Ayrıca, ortam değiştirme veya bileşik ekleme gibi özel prosedürler zor olabilir ve malzeme kaybına neden olabilir. Ayrıca, literatür raporları, bu yaklaşımı kullanırken bazı hücre hatlarının sıkıca paketlenmiş sferoidler üretemediğini göstermektedir⁶.

Dönen hücre kültürü ve düşük bağlı plastikler, hücrelerin substrata yapışmasını önlemek için kullanılır, bu da onların toplanmasına ve sferoidler oluşturmasına neden olur. Bu işlem, belirli şişeler ve/veya çalkalama/döndürme gerektirir. Bu, büyük ölçekli sferoidler veya organoidler üretimi için en basit yaklaşımlardan biri olmasına rağmen, özel ekipman ihtiyacı, düşük kültür ömrü, sferoidlerde boyut değişimi, hücrelerde mekanik hasar ve düşük verimlilik gibi dezavantajları da vardır⁶.

Konik kuyucuklar içeren piramit plakalar, bazı manipülasyonların sferoid/organoidlerin oluşumunu engelleyebileceği gerçeğine ek olarak, maliyetleri etkileyen ticari olarak temin edilebilen plakalardır⁷.

3D kültürleme için makro gözenekli iskeleler de kullanılır; Bununla birlikte, etkili hücre tohumlama ve homojen dağılımın elde edilmesinde büyük bir engel yatmaktadır. Bu sorun, gözenek boyutlarının hücre penetrasyonu için çok küçük veya hücreleri güvenli bir şekilde tutamayacak kadar büyük olması nedeniyle ortaya çıkar. Bu sorunu ele almak için, bu tekniğin karmaşıklığını ve maliyetini doğrudan etkileyen çeşitli stratejiler 8 araştırılmıştır.

Manyetik boncuk metodolojisi az sayıda sferoid/organoid üretir, yüksek bir maliyete sahiptir ve hücrelerin içinde nanopartikül kalıntıları bırakabilir⁹.

Sferoid yetiştirme sistemleri arasında, iskele içermeyen bir hidrojeli temsil eden yapışkan olmayan agaroz hidrojeller mevcuttur. Bu yaklaşım, 3D yapıların boyutu üzerinde hassas kontrol ve plaka başına bu yapılardan önemli sayıda üretme kapasitesi gibi dikkate değer faydalar sunar. Bu yöntemde, hücreler önceden şekillendirilmiş kuyucuklara sahip bir hidrojel içine sokulur, burada batar ve 3D sferoidlere¹⁰ kendi kendine monte edilirler.

Bu çalışmada, basit, verimli, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli bir şekilde bir mikro model kalıbı kullanarak agaroz mikro kuyuları oluşturmak için bir cihaz ve metodoloji sunuyoruz.

Bu damganın, yerçekimi yardımıyla agarozda mikro kuyular oluşturmak için bir kalıp olarak kullanılması, mikro kuyu ve hücresel organizasyon içindeki hücre etkileşimini geliştirmeyi, in vitro olarak basit, verimli, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli bir şekilde 3D yapılar (sferoidler / organoidler) üretmeyi, böylece araştırma süresinden ve laboratuvar kaynaklarından tasarruf etmeyi amaçlar.

Bu protokol, Kurumumuz CEUA-FMUSP: 1699/2021 İnsan Araştırmaları Etik Kurulu'nun 8 Eylül 2021'de onaylanan - "Domuz Pankreas adacıklarının İzolasyonu ve Kapsüllenmesi" yönergelerini takip eder ve Hücre ve Moleküler Terapi NUCEL Grubumuzun (www.usp.br/nucel), FAPESP Hibe No. 2016/05311-2, "Kronik-dejeneratif hastalıkların (kanser ve diyabet) tedavisini amaçlayan Rejeneratif Tıp" başlıklı Tematik Projesinin bir parçasıdır.

1. Damga cihazının imalatı

NOT: Bu Damga, NUCEL grubu (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/) tarafından özel olarak üretilmiştir. Damga cihazı, hassasiyeti ve gelişmiş üç boyutlu modelleme yetenekleri ile geniş çapta tanınan, referans verilen yazılım kullanılarak geliştirilmiştir.

1. Tasarlanan prototiplerin, sferoidler veya organoidler gibi eşdeğer sayıda üç boyutlu kültürün oluşturulmasını sağlamak için düzenlenmiş 663 mikropin içerdiğinden emin olun. Damganın T6 tepsi yüzeylerindeki stabilitesini sağlamak için, cihazın çevresi boyunca stratejik olarak beş destek noktası yerleştirin.
2. Mikro pimlerin, uzunlukları 1 ila 3 mm arasında değişen, ayarlanabilir boyutlara sahip konik bir tasarıma sahip olduğundan emin olun. Koninin taban çapı 0,7 ile 1,5 mm arasında değişirken, konik açısı 5° ile 10° arasında değişir.
3. Cihazın mikro pimlerin derinliğini tanımlayan "durdurma" yapısının, 10 ila 19 mm arasında ayarlanabilir bir uzunluğa ve 20 ila 40 mm çapa sahip olduğundan ve mikro pimlerin yüzeyi boyunca eşit olarak dağıtıldığından emin olun.
4. Ek olarak, kullanım sırasında pratikliği ve hassasiyeti artırmak için cihazı tek elle kullanıma uygun ergonomik bir tutamağa sahip olacak şekilde tasarlayın.
   NOT: Cihazın büyük ölçekli üretimini kolaylaştırmak için, 3D baskı işlemi için gerekli olan .stl formatındaki dijital dosya sağlanmıştır.
5. Uygun yazılımı kullanarak dilimleyin ve uyumlu bir 3D yazıcı ile yazdırın. Aşağıdaki yazdırma boyutlarını kullanın: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, işlevsellik ve yapısal kalite arasında ideal bir denge sağlar.
6. Cihazın üretimi için, optimum cihaz performansı için temel özellikler olan yüksek çözünürlüğe ve tek tip yüzey kalitesine sahip olması gereken UV ile kürlenebilen polimer reçine ile uyumlu, ışıkla sertleştirilebilir bir 3D yazıcı kullanın.
7. Seçilen 3D yazıcıyla uyumlu yazılımı kullanarak yazdırmak için dijital modeli dilimleyin.

2. Agaroz mikrokuyularının hazırlanması

1. Agaroz çözeltisini hazırlayın.
   1. Saf agaroz tozunu tartın ve %1-2'lik (a/h) bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün.
   2. Çözeltiyi tamamen eriyene kadar bir mikrodalga veya su banyosunda ısıtın, homojen ve şeffaf olduğundan emin olun.
      NOT: Agarozu bozabileceğinden aşırı ısınmadan veya aşırı yeniden ısıtmadan kaçının. Büyük miktarlarda stok çözeltisi hazırlamayın.
   3. Çözeltinin pipetleme için ideal sıcaklık olan ~ 40 ° C'ye soğumasını bekleyin.
2. Ismarlama damgayı hazırlayın.
   1. Kalıntıları gidermek için damgayı yumuşak kıllı bir sünger ve damıtılmış su ile yıkayın.
   2. Steriliteyi sağlamak için temizlenmiş damgayı 5-10 dakika UV ışığına maruz bırakın.
3. Mikro kuyuları oluşturun.
   1. 40 °C agaroz çözeltisinin ~3 mL'sini 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dökün/pipetleyin ve 2-3 mm'lik homojen bir derinlik sağlayın.
   2. Agaroz hala sıcakken ısmarlama damgayı kuyunun ortasına yerleştirin.
      NOT: Damga, hizalama ve stabilite sağlayan ve manuel destek ihtiyacını ortadan kaldıran yanal desteklere sahiptir. Her damga, kuyu başına ~ 663 mikro kuyu (~ 2 mm yüksekliğinde) oluşturur. Mikro pimlerde kabarcık olmadığından emin olun; Kabarcıklar oluşursa, onları ortadan kaldırmak için damgayı hafifçe hareket ettirin.
   3. Plakayı hareket ettirmeden agarozun oda sıcaklığında 5-10 dakika katılaşmasına izin verin.
      NOT: Mikrokuyu yapısındaki değişiklikleri önlemek için katılaşma sırasında agarozu rahatsız etmeyin.
   4. Mikro kuyucuklara zarar vermeden vakumu serbest bırakmak için hafif ileri geri hareketlerle damgayı çıkarın.
      NOT: Bu hareket hava girişini kolaylaştırarak jeli deforme etmeden düzgün bir şekilde damganın çıkarılmasını sağlar. Mikro kuyular sağlam kalmalıdır.
   5. Kalıntıları gidermek için mikro kuyuları 3x PBS solüsyonu ile yıkayın.
   6. Mikrobiyal kontaminasyonu ortadan kaldırmak için plakayı 10 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.
   7. 3 mL kültür ortamı ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 ° C'de bir CO₂ inkübatöründe inkübe edin.
      NOT: Bu inkübasyon, hücre tohumlamasından önce kontaminasyon olmadığını doğrular.

3. Mikro kuyularda hücre tohumlama

1. Hücre süspansiyonunu hazırlayın.
   1. Homojen bir süspansiyon elde etmek için hücreleri tripsinizasyon veya başka bir ayrışma yöntemi ile toplayın.
   2. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu mikro kuyu başına istenen sayıya göre ayarlayın.
      NOT: 663 mikro kuyuda mikro kuyu başına 5.000 hücreyi tohumlamak için en az 3.315 × 10⁶ toplam hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın. Merkezi nekrozu önlemek ve yeterli besin ve oksijen difüzyonunu sağlamak için hücre konsantrasyonunu optimize edin.
2. Hücreleri tohumlayın.
   1. Hazırlanan hücre süspansiyonunun ~3 mL'sini mikro kuyucukların üzerine pipetleyin ve plakayı hafifçe döndürerek eşit dağılımı sağlayın.
   2. Hücrelerin yerçekimi ile çökelmesine izin verin (~ 10-15 dakika) veya 5 dakika boyunca 100 × g'da hafif santrifüjleme yapın.
      NOT: Hücrelerin mikro kuyularda konsantre olmasını sağlamak için santrifüjleme kullanılabilir.
   3. Plakayı, nemlendirilmiş bir atmosfere sahip 37 ° C'de bir CO₂ inkübatörüne aktarın.

4. 3D hücre kültürlerinin bakımı

1. Kültür ortamını değiştirin.
   1. Ortamı her 2-3 günde bir değiştirin, eski ortamın %50'sini çıkarın ve yeni ortam ekleyin.
      NOT: Dehidrasyonu önlemek için mikro kuyucukların kültür periyodu boyunca su altında kaldığından emin olun.
2. 3D kültürlerin oluşumunu izleyin.
   1. 3D yapılar tamamen oluşana ve kompakt hale gelene kadar kültürlemeye devam edin (örneğin, birincil pankreas adacık kültürleri için 2-3 gün).
      NOT: Daha uzun bir oluşum süresi gerektiren kültürler için, her 2-3 günde bir kısmi ortam değişiklikleri gerçekleştirin.

5. 3D yapıların toplanması ve karakterizasyonu

1. Sferoidleri/organoidleri toplayın.
   1. Eski ortamı çıkarın ve sıkıştırmayı veya ayrıştırmayı önlemek için geniş çaplı veya kesilmiş bir pipet ucu kullanarak güçlü pipetleme yoluyla 3D yapıları toplayın.
      NOT: Agregaları deforme etmeden yerinden çıkarmak için kuvvetli pipetleme kontrol edilmelidir.
2. Analiz için hazırlanın.
   1. Toplanan sferoidleri/organoidleri hemen kullanın veya ileride analiz etmek üzere düzeltin.
      NOT: Sferoidlerin birlikteliği ve stabilitesi hücre tipine, oluşum süresine ve kültür koşullarına bağlıdır. Ayrışmayı önlemek için dikkatli olmak çok önemlidir.

Bu çalışmada kullanılan hücre kültürü, domuz pankreas adacıklarından elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan adacık preparatı, dithizone boyamaya dayalı olarak %80 ± %5 saflığa ve canlı hücrelerde floresein diasetat veya ölü hücrelerde propidyum iyodür tespitine dayalı olarak %>80 adacık hücresi canlılığına sahipti (Canlı/Ölü floresan yöntemi). Domuz pankreas adacık hazırlığının en az %80 saf (örneğin ditizon boyama ile) ve %>80 oranında canlı olduğundan emin olun. İzolasyondan sonra, daha önce tarif edildiği gibi 37 ° C ve% 5 CO_2'de 1 mM L-glutamin,% 0.2 siprofloksasin ve% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş CMRL 1066 ortamında yapışkan kültürleri koruyun^11,12.

Bu çalışmada, agaroz küflerinde mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistemin etkinliği kapsamlı bir şekilde değerlendirilmiştir (Şekil 1). Şekil 2'de gösterilen damga tasarımı, mikro pimlerin ve yerleşimlerinin hassasiyetini göstererek, mikro kuyu oluşturma süreci sırasında tutarlı hizalama ve işlemeyi kolaylaştırır. Bu, tekrarlanabilir 3D hücre kültürleri elde etmek için kritik bir özellik olan tüm plaka boyunca tek tip mikro kuyu desenleri sağladı.

Damga kullanılarak mikro kuyu oluşturma süreci, damganın tek tip mikro kuyular oluşturma yeteneğinin görselleştirildiği Şekil 3'te detaylandırılmıştır. Sonuçlar, birden fazla pulun aynı anda kullanılabileceğini ve hazırlık sürecini kolaylaştırdığını doğrulamaktadır. Agaroz küflerinin mikroskobik analizi, hücrelerin 3D yapılar halinde toplanmasını kontrol etmede çok önemli bir faktör olan içbükey, standartlaştırılmış mikro kuyu şekillerini ortaya çıkarır. Mikro kuyuların tekdüzeliği, çeşitli deneylerde elde edilen tutarlı sonuçlarla gösterildiği gibi, 3D kültür oluşumunun güvenilirliğine ve tekrarlanabilirliğine önemli ölçüde katkıda bulunur.

Şekil 4, hücre aşılama zamanından (0 saat) birkaç zaman noktası (6 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat) boyunca 3D yapıların zamana bağlı gelişimini göstermektedir. Agregalı/kompakt 3D yapılara hücre sıkıştırması, 48 saat işaretiyle gözlemlenen önemli bir agregasyon ile kademeli olarak gerçekleşti. Bu zaman çizelgesi, bu çalışmada 48 saat içinde kompakt ve işlevsel 3D yapılar oluşturan birincil domuz pankreas adacıklarının kullanılmasıyla kanıtlandığı gibi, hücre tipine bağlı olarak değişebilir. Bu, protokolün organize 3B kültürler oluşturmadaki etkinliğini gösterir.

Şekil 5, agaroz mikro kuyularından çıkarıldıktan sonra 3D yapıların stabilitesini ve canlılığını vurgulamaktadır. 3D yapılar, çıkarıldıktan sonra konformasyonlarını korudu (Şekil 5A), bu da metodolojinin sağlamlığını doğruladı. Ayrıca, canlı/ölü tahlili (Şekil 5B,C), canlı hücrelerin yeşil boyanmasıyla gösterildiği gibi, yapılar içindeki hücrelerin canlı kaldığını göstermiştir. Bu bulgu, protokolün sadece iyi organize edilmiş 3D yapıların oluşumunu kolaylaştırmakla kalmayıp, aynı zamanda hücre canlılığını koruyarak 3D hücre kültürü uygulamaları için güvenilir ve verimli bir yaklaşım haline getirdiğini doğrulamaktadır.

Şekil 1: 3D hücre kültürleri oluşturma süreci. Başlangıçta 2D olarak yetiştirilen hücreler, yapışan yüzeyden ayrılır ve agaroz mikrokuyularına yerleştirilir. Bu agaroz mikro kuyuları, agaroz jeli oda sıcaklığında katılaştıktan sonra bu mikro kuyuların oluşumuna izin veren bir damga cihazı kullanılarak oluşturulur. Optik mikroskopi altında gözlemlendiğinde, hücrelerin mikro kuyular boyunca homojen bir şekilde dağıldığı görülebilir. Yaklaşık 2-3 gün sonra (hücre tipine bağlı olarak) sferoid veya organoid oluşumu gözlenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Damga cihazı. (AC)'den damga cihazının üç farklı perspektiften temsili görüntüleri, ana özelliklerini göstermektedir: 663 mikro pim, plaka destekleri ve manuel kullanım desteği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mikrokuyu kalıbı üretim sürecinin adım adım gösterimi. (A) Damga cihazı; (B) Damgalama cihazının, sıvı agaroz içeren kuyunun ortasına yerleştirilmesi, (C) agaroz polimerizasyonu; (D) damga cihazı tarafından kalıplanan agaroz mikro kuyuları; (E) Aynı plakada (P6) üç damga cihazı kullanılarak üretimin gösterilmesi; (F) 4x büyütmede mikro kuyuların optik mikroskopi görüntüleri (ölçek çubuğu = 1.000 μm); (G) 10x büyütmede mikro kuyuların optik mikroskopi görüntüleri (ölçek çubuğu = 400 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Primer pankreas adacık domuz kültürünün optik mikroskopi görüntüleri. Aşağıdaki zaman noktalarında 2x (ölçek çubuğu = 2.000 μm), 4x (ölçek çubuğu = 1.000 μm) ve 10x (ölçek çubuğu = 400 μm) büyütmede görüntüler: 0 saat, 6 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Canlı/Ölü tahlil. Agaroz mikro kuyularında üretilen ve geliştirilmiş damga cihazı kullanılarak 72 saat (3 gün) 3D ekimden sonra toplanan domuz pankreas adacık hücrelerinin birincil kültürlerinden elde edilen sferoidlerin canlılığını gösteren temsili görüntüler. Floresan optik mikroskopi görüntüleri elde edildi. Yeşil boyama, floresein diasetat ile etiketlenmiş canlı hücreleri temsil ederken, kırmızı boyama, propidyum iyodür ile etiketlenmiş canlı olmayan hücreleri gösterir. Görüntüler, 3D kültürün küresel yapısının korunduğunu ve mikro kuyulardan çıkarıldıktan sonra canlı kaldığını doğrulamaktadır. Ölçek çubuğu = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Literatürde çeşitli 3D kültür protokolleri bulunmasına rağmen, Wassmer ve ^ark.13 tarafından yapılan bir çalışmada, pankreas adacıkları kullanılarak 3D yapılar oluşturmak için çeşitli metodolojiler test edilmiştir. Yazarlar, yerli adacıkların ve kendi kendine toplanan sferoidlerin boyut ve şekil açısından önemli ölçüde heterojenlik sergilediğini ve diğer yöntemler kullanılarak elde edilenlerden daha büyük olduğunu gözlemlediler. Bulgularına dayanarak, sferoidlerin her biri kendi avantaj ve dezavantajlarına sahip farklı teknikler kullanılarak üretilebileceği sonucuna vardılar. Adacık hücresi agregasyonu için önerilen yöntemler asılı damla tekniği, agaroz mikrokuyu plakaları veya Küresel Plaka 5D'dir.

Literatürde başarıyla kullanılan agaroz mikrokuyuları üretmek için cihazlar vardır. Örneğin, Stuart ve ^ark.14 bir cihaz kullanarak umut verici sonuçlar gösterdi, ancak ele alınması gereken bazı dezavantajlar sundu. Bunlar arasında üretebileceği sınırlı sayıda mikro kuyu, küçük kalıp alanı nedeniyle azalmış çalışma hacmi ve negatif kalıp olarak tasarlanması yer alır, bu da kullanımı zorlaştırır ve mikro kuyuların kırılma ve bozulma riskini artırır.

Sferoidler üretmek için damga benzeri bir cihaz, Charelli ve meslektaşları¹⁵ tarafından 3D baskı teknolojisi kullanılarak geliştirildi. 6 oyuklu plaka başına 4.716'ya kadar sferoid üretebilen cihaz, fotokürlenebilir reçine ile stereolitografi yoluyla oluşturuldu. Ortaya çıkan cihaz, her biri 1,3 mm yüksekliğinde ve 650 μm genişliğinde silindirik mikro pimlere sahipti. Bu yöntem, tutarlı şekil ve boyuta sahip, birlikte kültürlenmiş sferoidler de dahil olmak üzere tek tip sferoidlerin hızlı bir şekilde oluşturulmasını sağladı. Avantajlarına rağmen, kullanılabilirliğini ve performansını iyileştirmek için çeşitli zorlukların ele alınması gerekir. Önemli bir sorun, cihazın kullanımını zorlaştıran ve kalıp oluşturma işlemi sırasında dengesizliğe eğilimli hale getiren manuel desteğin olmamasıdır. Bu kararsızlık genellikle agaroz jelin kırılmasına veya çatlamasına yol açarak yapısal bütünlüğünü tehlikeye atar. Ek olarak, cihaz plaka desteğinin olmamasından muzdariptir, bu da kuyu plakasına güvenli bir şekilde sabitlenemediği anlamına gelir. Sonuç olarak, damga, agaroz katılaşana, değişkenlik yaratana ve mikrokuyu oluşumunun homojenliğini etkileyene kadar manuel olarak askıya alınmalıdır. Bu sınırlamalar, elde edilen sferoidlerin tekrarlanabilirliğini ve genel kalitesini azaltır.

Geliştirilmiş damgamız/protokolümüz, basitliği ve tekrarlanabilirliği ile dikkat çeken, agaroz mikro kuyularında 3D sferoidler ve organoidler üreten, verimli ve düşük maliyetli bir yönteme izin verir. Decarli ve meslektaşlarının¹⁶ çalışmalarından ilham alan grubumuz, yeni bir damga cihazı geliştirmek için yapışkan olmayan agaroz hidrojel metodolojisini kullandı. Sonuç olarak, kullanım zorlukları ve mikro kuyu oluşumundaki tutarsızlıklar gibi konuları ele aldık. Metodolojimiz aracılığıyla geliştirilen damga, bu iyileştirmeleri içererek onu daha kullanıcı dostu, verimli ve yüksek oranda tekrarlanabilir hale getirir.

Modifikasyonlarla ilgili olarak, hücre yoğunluğu farklı hücre tipleri ve deneysel amaçlar için ayarlanabilir. Düşük proliferasyon oranlarına veya sınırlı hücre etkileşimine sahip hücreler için daha yüksek bir hücre tohumlama yoğunluğu gerekebilirken, daha düşük bir yoğunluk, belirli hücre tipleri için daha iyi yapısal organizasyonu destekleyebilir. Küresel oluşum ile ilgili sorunlar ortaya çıkarsa, plakaların hızlı bir şekilde santrifüjlenmesi gibi küçük modifikasyonlar, hücrelerin mikro kuyuların dibine düzgün bir şekilde yerleşmesine yardımcı olabilir.

Protokolün kritik adımlarından biri, hücrelerin mikro kuyulara doğru ve düzgün bir şekilde tohumlanmasıdır. Homojen hücre dağılımı, oluşturulan yapıların tutarlı boyutlara ve tek tip özelliklere sahip olmasını sağlamak için gereklidir ve sonuçların kalitesini doğrudan etkiler. 3D kültürlerin toplanması bir diğer önemli noktadır. Bu adım, alım sırasında yapıların tahrip olmasını önlemek için son derece dikkatli olunmasını gerektirir ve sferoidlerin ve organoidlerin bütünlüğünü korumak için uygun pipetleme teknikleri gerektirir.

Sferoidin boyutu, kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişecektir. Ek olarak, sferoid başına hücre sayısı da değişir ve kullanılan spesifik hücre hattına veya birincil hücrelere göre optimize edilmelidir. Bir sferoid içindeki aşırı yüksek hücre yoğunluğunun, literatürde bildirildiği gibi nekrotik bir çekirdeğin gelişmesine neden olduğu gösterilmiştir. Bu nekrotik çekirdek, en içteki hücrelere yetersiz oksijen ve besin difüzyonundan kaynaklanır ve bu da sferoid^17'nin genel canlılığını ve işlevini tehlikeye atabilir.

Basitlik ve düşük maliyet avantajlarına rağmen, yöntemin önemli bir sınırlaması, özellikle daha büyük ve daha karmaşık yapılar gerektiren deneylerde, sferoid toplamadaki potansiyel değişkenliktir. Bu gibi durumlarda, süreci optimize etmek ve malzeme kaybını azaltmak için daha özel toplama araçlarının kullanılması ve hatta metodolojik uyarlamalar gerekli olabilir. Çok küçük sferoidlerin elde edilmesi, sıkı protokol kontrolü gerektiren manipülasyon ve toplamayı da karmaşıklaştırabilir.

Sferoidlerin / organoidlerin birleşmesi ve ayrışması, kullanılan hücre tipinin yanı sıra yapı oluşumu için gereken gün sayısına, kullanılan kültür ortamına ve olası ajitasyon ihtiyacına bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Bu faktörler, her hücre tipinin spesifik özelliklerine özgüdür. Bununla birlikte, hücre ayrışmasını en aza indirmek için, ortam değişiklikleri sırasında nazik kullanım ve kültür koşullarının uygun şekilde sürdürülmesi gibi metodolojide belirtilen önlemlere sıkı bir şekilde uymak önemlidir.

Döner kültürler veya manyetik boncuklar gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol daha fazla basitliği ile öne çıkıyor, özel ekipman ihtiyacını ortadan kaldırıyor ve 3D sferoidlerin ve organoidlerin daha tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesini sağlıyor ve bu da onu çok çeşitli araştırma amaçları için pratik bir alternatif haline getiriyor. Literatürde daha önce açıklanan^{sonuçlara göre 13}, agaroz mikro kuyuları, Sphericalplate 5D gibi diğer ticari modellere kıyasla daha yüksek canlılık ve insülin sekresyon oranlarına sahip insülin üreten hücrelerin 3D küresel yapılarının oluşturulmasını kolaylaştırır.

Bu yöntemin çok yönlülüğü, düşük maliyeti ile birleştiğinde, onu hücre biyolojisi, onkoloji, ilaç geliştirme çalışmaları ve toksikoloji gibi çeşitli araştırma alanları için ideal hale getirir. In vitro 3D modelleme için etkili bir çözüm sunar, hücre davranışı hakkında daha kesin çalışmaları kolaylaştırmak, hücre etkileşimi, ilaç yanıtı, ve tedavi geliştirme.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Zizi de Mendonça (Tıp Fakültesi, São Paulo Üniversitesi, Brezilya) tarafından sağlanan mükemmel teknik yardım için özellikle minnettarız. Bu çalışma, aşağıdaki Brezilya araştırma kuruluşlarından alınan hibelerle desteklenmiştir: BNDES 09.2.1066.1, CAPES (PVE süreç numarası 88881.068070/2014-01), CNPq (hibe numaraları 457601/2013-2, 401430/2013-8 ve INCT-Regenera numarası 465656/2014-5), FAPESP (Tematik proje numarası 2016/05311-2), FINEP 01.08.06.05 ve Bilim ve Teknoloji Bakanlıkları (MCTI) ve Sağlık (MS-DECIT).