Generazione di sferoidi/organoidi tridimensionali da colture cellulari bidimensionali utilizzando un nuovo dispositivo di timbro

Questo studio presenta una metodologia economica ed efficiente per generare strutture cellulari 3D utilizzando un sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Il sistema promuove la formazione di sferoidi/organoidi uniformi, migliorando così le interazioni cellulari. Questo approccio riduce la variabilità sperimentale e supporta le applicazioni nei test sui farmaci e nell'ingegneria tissutale.

Le colture cellulari tridimensionali (3D) forniscono una rappresentazione più accurata del microambiente in vivo rispetto alle colture bidimensionali convenzionali (2D), poiché promuovono interazioni migliorate tra le cellule e la matrice extracellulare. Questo studio mirava a sviluppare una metodologia efficiente, economica e riproducibile per generare strutture cellulari 3D (sferoidi/organoidi) utilizzando un innovativo sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Un nuovo timbro è stato utilizzato per produrre 663 micropozzetti per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, fornendo un ambiente ideale per l'aggregazione cellulare. Le cellule primarie delle isole pancreatiche suine sono state seminate in questi micropozzetti, dove si sono aggregate per formare sferoidi/organoidi. Le colture sono state incubate a 37 °C sotto il 5% di CO₂ e il terreno è stato sostituito ogni 3 giorni. La formazione di sferoidi è stata periodicamente monitorata e sono stati raccolti campioni per la caratterizzazione. Il metodo ha generato con successo sferoidi uniformi e di alta qualità, riducendo la variabilità sperimentale, minimizzando la manipolazione e migliorando le interazioni cellulari. L'uso di stampi per micropattern a base di agarosio ha fornito un ambiente semplificato e controllato per le colture 3D, offrendo una soluzione standardizzata ed economica. Questa metodologia supporta le applicazioni per i test farmacologici e l'ingegneria tissutale, offrendo una piattaforma pratica e scalabile per modelli di colture cellulari 3D che possono essere facilmente implementati in vari contesti di laboratorio.

Negli ultimi 50 anni, numerose indagini di biologia cellulare hanno dimostrato che le colture bidimensionali (2D) non riescono a replicare accuratamente le condizioni in vivo osservate nei modelli animali¹. Strutturalmente, le colture cellulari 2D non consentono alle cellule di organizzarsi tridimensionalmente e replicare la situazione osservata nei sistemi in vivo . Inoltre, le vie di segnalazione cellulare sono alterate nelle colture 2D rispetto alle colture tridimensionali (3D), il che potrebbe probabilmente spiegare perché alcuni tipi di screening farmacologico utilizzando colture 2D sono così discrepanti². Con l'introduzione dei sistemi di coltura 3D è emerso un progresso significativo nelle tecniche di coltura cellulare. I sistemi 3D variano considerevolmente in complessità a seconda della composizione cellulare e della citoarchitettura. Generalmente, vengono generati due tipi di strutture, ovvero: sferoidi e organoidi. Gli sferoidi sono descritti come semplici gruppi di cellule ottenute da tessuti normali o tumorali, corpi embrioidi e linee cellulari. La formazione di strutture 3D è influenzata da vari fattori, tra cui le interazioni cellula-cellula e le vie di segnalazione mediate dai componenti della matrice extracellulare (ECM), che forniscono supporto strutturale e segnali biochimici. Questi elementi regolano le interazioni che contribuiscono all'organizzazione e alla funzione dei tessuti³. Il sistema di coltura sferoidale è stato descritto per la prima volta nei primi anni '70, utilizzando linee cellulari di polmone di criceto cinese V79 come modello di carcinomi nodulari, che crescono in condizioni non aderenti e formano sfere perfette⁴. Gli organoidi sono descritti come gruppi di tipi di cellule organo-specifiche derivate da cellule staminali o progenitrici, che si auto-organizzano attraverso processi, come lo smistamento cellulare e la specificazione del lignaggio, in modo spazialmente confinato, rispecchiando lo sviluppo in vivo ⁵.

Diversi metodi e materiali disponibili sono disponibili per la coltura di cellule in condizioni 3D. I principali metodi attualmente impiegati per generare colture 3D sono: 1) gocce sospese; 2) colture cellulari rotanti e plastiche a basso attaccamento; 3) piastre piramidali contenenti pozzetti conici; 4) scaffold macroporosi; 5) perline magnetiche; e 6) idrogel senza scaffold.

Le gocce sospese sono il metodo utilizzato per ottenere colture 3D prive di impalcature. Questo metodo presenta alcune limitazioni, tra cui la necessità di una manipolazione estesa, una bassa efficienza produttiva, una geometria sferica e l'esposizione a elevate forze di taglio. Inoltre, procedure specifiche, come la sostituzione del mezzo o l'aggiunta di composti, possono essere impegnative e possono causare perdite di materiale. Inoltre, i rapporti della letteratura indicano che alcune linee cellulari non riescono a produrre sferoidi strettamente impacchettati quando impiegano questo approccio⁶.

La coltura cellulare rotante e le plastiche a basso attaccamento vengono utilizzate per evitare che le cellule si attacchino al substrato, provocandone l'aggregazione e la formazione di sferoidi. Questo processo richiede matracci specifici e/o agitazione/rotazione. Sebbene questo sia uno degli approcci più semplici per la produzione di sferoidi o organoidi su larga scala, non è privo di inconvenienti, come la necessità di attrezzature specifiche, la bassa longevità della coltura, la variazione delle dimensioni degli sferoidi, i danni meccanici alle cellule e la bassa efficienza⁶.

Le piastre piramidali contenenti pozzetti conici sono piastre disponibili in commercio che incidono sui costi, oltre al fatto che alcune manipolazioni possono ostacolare la formazione di sferoidi/organoidi⁷.

Gli scaffold macroporosi sono impiegati anche per la coltura 3D; Tuttavia, un grosso ostacolo risiede nel raggiungimento di un'efficace semina cellulare e di una distribuzione uniforme. Questo problema si verifica perché le dimensioni dei pori possono essere troppo piccole per la penetrazione cellulare o troppo grandi per trattenere saldamente le cellule. Per affrontare questo problema, sono state esplorate diverse strategie⁸, che hanno un impatto diretto sulla complessità e sul costo di questa tecnica.

La metodologia delle biglie magnetiche genera un piccolo numero di sferoidi/organoidi, ha un costo elevato e può lasciare residui di nanoparticelle all'interno delle cellule⁹.

Tra i sistemi per la coltivazione di sferoidi, sono disponibili idrogel di agarosio non adesivi, che rappresentano un idrogel privo di scaffold. Questo approccio offre notevoli vantaggi, come il controllo preciso sulle dimensioni delle strutture 3D e la capacità di generare un numero considerevole di queste strutture per piastra. In questo metodo, le cellule vengono introdotte in un idrogel con pozzetti preformati, in cui affondano e si autoassemblano in sferoidi 3D¹⁰.

In questo studio, presentiamo un dispositivo e una metodologia per generare micropozzetti di agarosio utilizzando uno stampo per micropattern in modo semplice, efficiente, riproducibile e a basso costo.

L'uso di questo timbro come stampo per generare micropozzetti in agarosio, aiutato dalla gravità, mira a migliorare l'interazione cellulare all'interno del micropozzetto e l'organizzazione cellulare, generando strutture 3D (sferoidi/organoidi) in vitro in modo semplice, efficiente, riproducibile e a basso costo, risparmiando così tempo di ricerca e risorse di laboratorio.

Questo protocollo segue le linee guida del Comitato Etico per la Ricerca Umana della nostra Istituzione CEUA-FMUSP: 1699/2021, approvate l'8 settembre 2021 -"Isolamento e incapsulamento delle isole pancreatiche suine" e fa parte del Progetto Tematico del nostro Gruppo NUCEL (www.usp.br/nucel), FAPESP Grant n. 2016/05311-2, dal titolo: "Medicina rigenerativa finalizzata alla terapia delle malattie cronico-degenerative (cancro e diabete)".

1. Fabbricazione del dispositivo di timbro

NOTA: Questo francobollo è realizzato su misura dal gruppo NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). Il dispositivo per timbri è stato sviluppato utilizzando il software di riferimento, ampiamente riconosciuto per la sua precisione e le avanzate capacità di modellazione tridimensionale.

1. Assicurarsi che i prototipi progettati siano dotati di 663 micropin disposti per consentire la generazione di un numero equivalente di colture tridimensionali, come sferoidi o organoidi. Per garantire la stabilità del timbro sulle superfici del vassoio T6, posizionare cinque punti di supporto strategicamente lungo la circonferenza del dispositivo.
2. Assicurarsi che i micropin abbiano un design conico con dimensioni regolabili, che vanno da 1 a 3 mm di lunghezza. Il diametro della base del cono varia tra 0,7 e 1,5 mm, mentre l'angolo di conicità varia da 5° a 10°.
3. Assicurarsi che la struttura "stop" del dispositivo, che definisce la profondità dei micropin, abbia una lunghezza regolabile da 10 a 19 mm e un diametro da 20 a 40 mm, con micropin distribuiti uniformemente sulla sua superficie.
4. Inoltre, progetta il dispositivo in modo che abbia un'impugnatura ergonomica, adatta per l'utilizzo con una sola mano, per migliorare la praticità e la precisione durante l'uso.
   NOTA: Per facilitare la produzione su larga scala del dispositivo, viene fornito il file digitale in formato .stl, essenziale per il processo di stampa 3D.
5. Basta affettarlo utilizzando un software appropriato e stamparlo con una stampante 3D compatibile. Utilizzare le seguenti dimensioni di stampa: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, garantendo un equilibrio ideale tra funzionalità e qualità strutturale.
6. Per la fabbricazione del dispositivo, utilizzare una stampante 3D fotopolimerizzabile, compatibile con la resina polimerica polimerizzabile UV che deve avere un'alta risoluzione e una finitura superficiale uniforme, caratteristiche essenziali per le prestazioni ottimali del dispositivo.
7. Taglia il modello digitale per la stampa utilizzando un software compatibile con la stampante 3D selezionata.

2. Preparazione di micropozzetti di agarosio

1. Preparare la soluzione di agarosio.
   1. Pesare la polvere di agarosio puro e scioglierla in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere una concentrazione finale dell'1-2% (p/v).
   2. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde o a bagnomaria fino a completa dissoluzione, assicurandosi che sia omogenea e trasparente.
      NOTA: Evitare il surriscaldamento o il riscaldamento eccessivo, in quanto ciò può degradare l'agarosio. Non preparare grandi volumi di soluzione madre.
   3. Lasciare raffreddare la soluzione a ~40 °C, la temperatura ideale per il pipettaggio.
2. Prepara il timbro su misura.
   1. Lavare il timbro con una spugna a setole morbide e acqua distillata per rimuovere i residui.
   2. Esporre il timbro pulito alla luce UV per 5-10 minuti per garantire la sterilità.
3. Formare i micropozzetti.
   1. Versare/pipettare ~3 mL della soluzione di agarosio a 40 °C in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, garantendo una profondità uniforme di 2-3 mm.
   2. Posizionare il timbro su misura al centro del pozzetto mentre l'agarosio è ancora caldo.
      NOTA: Il timbro è dotato di supporti laterali che garantiscono l'allineamento e la stabilità, eliminando la necessità di un supporto manuale. Ogni timbro crea ~663 micropozzetti (~2 mm di altezza) per pozzetto. Assicurarsi che non ci siano bolle sui micropin; Se si formano delle bolle, muovere delicatamente il timbro per eliminarle.
   3. Lasciare solidificare l'agarosio per 5-10 minuti a temperatura ambiente senza muovere la piastra.
      NOTA: Non disturbare l'agarosio durante la solidificazione per evitare variazioni nella struttura del micropozzetto.
   4. Rimuovere il timbro con delicati movimenti avanti e indietro per rilasciare il vuoto senza danneggiare i micropozzetti.
      NOTA: Questo movimento facilita l'ingresso dell'aria, consentendo una rimozione fluida del timbro senza deformare il gel. I micropozzetti devono rimanere intatti.
   5. Lavare i micropozzetti 3 volte con una soluzione PBS per rimuovere i residui.
   6. Esporre la piastra alla luce UV per 10 minuti per eliminare la contaminazione microbica.
   7. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura e incubare la piastra in un incubatore di CO₂ a 37 °C per una notte.
      NOTA: Questa incubazione verifica l'assenza di contaminazione prima della semina cellulare.

3. Semina cellulare in micropozzetti

1. Preparare la sospensione cellulare.
   1. Raccogliere le cellule tramite tripsinizzazione o un altro metodo di dissociazione per ottenere una sospensione omogenea.
   2. Contare le cellule e regolare la concentrazione in base al numero desiderato per micropozzetto.
      NOTA: Per seminare 5.000 cellule per micropozzetto in 663 micropozzetti, preparare una sospensione contenente almeno 3,315 × 10⁶ celle totali. Ottimizzare la concentrazione cellulare per prevenire la necrosi centrale e garantire un'adeguata diffusione di nutrienti e ossigeno.
2. Semina le cellule.
   1. Pipettare ~3 mL della sospensione cellulare preparata sui micropozzetti, garantendo una distribuzione uniforme facendo roteare delicatamente la piastra.
   2. Lasciare che le cellule si depositino per gravità (~10-15 min) o eseguire una centrifugazione delicata a 100 × g per 5 min.
      NOTA: La centrifugazione può essere utilizzata per garantire che le cellule si concentrino nei micropozzetti.
   3. Trasferire la piastra in un incubatore a CO₂ a 37 °C in atmosfera umidificata.

4. Manutenzione di colture cellulari 3D

1. Sostituire il terreno di coltura.
   1. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni, rimuovendo il 50% del vecchio terreno e aggiungendo un terreno fresco.
      NOTA: Assicurarsi che i micropozzetti rimangano immersi per tutto il periodo di coltura per evitare la disidratazione.
2. Monitora la formazione di colture 3D.
   1. Continuare la coltura fino a quando le strutture 3D non sono completamente formate e compatte (ad esempio, 2-3 giorni per le colture primarie di isole pancreatiche).
      NOTA: Per le colture che richiedono un tempo di formazione più lungo, eseguire cambi parziali del terreno ogni 2-3 giorni.

5. Raccolta e caratterizzazione di strutture 3D

1. Raccogli gli sferoidi/organoidi.
   1. Rimuovete il vecchio terreno e raccogliete le strutture 3D mediante un pipettaggio vigoroso utilizzando un puntale per pipette di ampio diametro o tagliato per evitare la compressione o la disgregazione.
      NOTA: Il pipettaggio vigoroso deve essere controllato per rimuovere gli aggregati senza deformarli.
2. Preparati per l'analisi.
   1. Utilizzare immediatamente gli sferoidi/organoidi raccolti o correggerli per analisi future.
      NOTA: L'associazione e la stabilità degli sferoidi dipendono dal tipo di cellula, dal tempo di formazione e dalle condizioni di coltura. Fare attenzione è essenziale per evitare la dissociazione.

La coltura cellulare utilizzata in questo studio è stata derivata da isole pancreatiche suine. La preparazione delle isole utilizzate in questo studio aveva una purezza dell'80 ± del 5% basata sulla colorazione con ditizone e dell'>80% sulla vitalità delle cellule insulari basata sulla rilevazione del diacetato di fluoresceina nelle cellule vive o dello ioduro di propidio nelle cellule morte (il metodo fluorescente vivo/morto). Assicurarsi che il preparato delle isole pancreatiche suine sia puro almeno all'80% (ad es. mediante colorazione con ditizone) e vitale al >80%. Dopo l'isolamento, mantenere colture aderenti in terreno CMRL 1066, integrato con 1 mM di L-glutammina, ciprofloxacina allo 0,2% e siero fetale di vitello (FCS) al 10%, a 37 °C e CO₂ al 5%, come precedentemente descritto^11,12.

Nel presente studio, l'efficacia di un sistema basato su timbri per la generazione di micropozzetti in stampi di agarosio è stata valutata a fondo (Figura 1). Il design del timbro, mostrato nella Figura 2, dimostra la precisione dei micropin e il loro posizionamento, facilitando l'allineamento e la manipolazione coerenti durante il processo di formazione dei micropozzetti. Ciò ha garantito modelli di micropozzetti uniformi su tutta la piastra, una caratteristica fondamentale per ottenere colture cellulari 3D riproducibili.

Il processo di formazione dei micropozzetti utilizzando il timbro è descritto in dettaglio nella Figura 3, in cui viene visualizzata la capacità del timbro di creare micropozzetti uniformi. I risultati confermano che è possibile utilizzare più timbri contemporaneamente, semplificando il processo di preparazione. L'analisi microscopica degli stampi di agarosio rivela forme concave e standardizzate dei micropozzetti, un fattore cruciale nel controllo dell'aggregazione delle cellule in strutture 3D. L'uniformità dei micropozzetti contribuisce in modo significativo all'affidabilità e alla riproducibilità della formazione della coltura 3D, come dimostrato dai risultati coerenti ottenuti in vari esperimenti.

La Figura 4 illustra lo sviluppo dipendente dal tempo delle strutture 3D dal momento dell'inoculazione cellulare (0 h) attraverso diversi punti temporali (6 h, 24 h, 48 h e 72 h). La compattazione delle celle in strutture 3D aggregate/compatte è avvenuta gradualmente, con un'aggregazione significativa osservata entro le 48 ore. Questa tempistica può variare a seconda del tipo di cellula, come evidenziato dall'uso di isole pancreatiche suine primarie in questo studio, che hanno formato strutture 3D compatte e funzionali entro 48 ore. Ciò dimostra l'efficacia del protocollo nella generazione di culture 3D organizzate.

La Figura 5 evidenzia la stabilità e la vitalità delle strutture 3D dopo essere state rimosse dai micropozzetti di agarosio. Le strutture 3D hanno mantenuto la loro conformazione dopo la rimozione (Figura 5A), confermando la robustezza della metodologia. Inoltre, il saggio vivo/morto (Figura 5B, C) ha indicato che le cellule all'interno delle strutture sono rimaste vitali, come dimostrato dalla colorazione verde delle cellule vive. Questa scoperta conferma che il protocollo non solo facilita la formazione di strutture 3D ben organizzate, ma preserva anche la vitalità cellulare, rendendolo un approccio affidabile ed efficiente per le applicazioni di coltura cellulare 3D.

Figura 1: Il processo di formazione delle colture cellulari 3D. Le cellule inizialmente coltivate in 2D vengono staccate dalla superficie aderente e poste in micropozzetti di agarosio. Questi micropozzetti di agarosio vengono creati utilizzando un dispositivo a timbro, che consente la formazione di questi micropozzetti dopo che il gel di agarosio si è solidificato a temperatura ambiente. Se osservate al microscopio ottico, le cellule possono essere viste distribuirsi in modo omogeneo tra i micropozzetti. Dopo circa 2-3 giorni (a seconda del tipo di cellula), si può osservare la formazione di sferoidi o organoidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dispositivo di timbro. Immagini rappresentative del dispositivo di timbro da (A-C) da tre diverse prospettive, che illustrano le sue caratteristiche principali, ovvero: 663 micropin, supporti per piastre e supporto per la movimentazione manuale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rappresentazione passo dopo passo del processo di produzione dello stampo per micropozzetti. (A) Dispositivo di timbro; (B) posizionamento del dispositivo di timbro al centro del pozzetto contenente agarosio liquido; (C) polimerizzazione dell'agarosio; (D) micropozzetti di agarosio stampati dal dispositivo di timbro; (E) dimostrazione della produzione utilizzando tre dispositivi di timbro nella stessa targa (P6); (F) immagini al microscopio ottico dei micropozzetti con ingrandimento 4x (barra della scala = 1.000 μm); (G) immagini al microscopio ottico dei micropozzetti con ingrandimento 10x (barra della scala = 400 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini al microscopio ottico di colture suine primarie di isole pancreatiche. Immagini con ingrandimento 2x (barra della scala = 2.000 μm), 4x (barra della scala = 1.000 μm) e 10x (barra della scala = 400 μm), nei seguenti punti temporali: 0 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Saggio vivo/morto. Immagini rappresentative che mostrano la vitalità degli sferoidi provenienti da colture primarie di cellule di isole pancreatiche suine che sono state generate in micropozzetti di agarosio e raccolte dopo 72 ore (3 giorni) di coltivazione 3D utilizzando il dispositivo timbro migliorato. Sono state ottenute immagini di microscopia ottica a fluorescenza. La colorazione verde rappresenta le cellule vitali marcate con fluoresceina diacetato, mentre la colorazione rossa indica le cellule non vitali marcate con ioduro di propidio. Le immagini confermano che la struttura sferoidale della coltura 3D viene mantenuta e rimane vitale dopo la rimozione dai micropozzetti. Barra della scala = 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sebbene esistano vari protocolli di coltura 3D in letteratura, uno studio condotto da Wassmer et ^al.13 ha testato diverse metodologie per generare strutture 3D utilizzando isole pancreatiche. Gli autori hanno osservato che gli isolotti nativi e gli sferoidi autoaggregati mostravano una notevole eterogeneità rispetto alle dimensioni e alla forma ed erano più grandi di quelli ottenuti con altri metodi. Sulla base delle loro scoperte, hanno concluso che gli sferoidi possono essere generati utilizzando diverse tecniche, ognuna con i propri vantaggi e svantaggi. Per l'aggregazione delle cellule insulari, i metodi consigliati sono la tecnica della goccia sospesa, le piastre a micropozzetti di agarosio o la piastra sferica 5D.

Esistono dispositivi per la generazione di micropozzetti di agarosio che sono stati impiegati con successo in letteratura. Ad esempio, Stuart et ^al.14 hanno mostrato risultati promettenti utilizzando un dispositivo, ma presentava alcuni svantaggi che devono essere affrontati. Questi includono il numero limitato di micropozzetti che può produrre, un volume di lavoro ridotto a causa della piccola area dello stampo e il suo design come stampo negativo, che complica la manipolazione e aumenta il rischio di rottura e distorsione dei micropozzetti.

Un dispositivo simile a un timbro per la generazione di sferoidi è stato sviluppato da Charelli e colleghi¹⁵ utilizzando la tecnologia di stampa 3D. In grado di produrre fino a 4.716 sferoidi per piastra a 6 pozzetti, il dispositivo è stato creato attraverso la stereolitografia con resina fotopolimerizzabile. Il dispositivo risultante presentava micropin cilindrici, ciascuno di 1,3 mm di altezza e 650 μm di larghezza. Questo metodo ha permesso la rapida formazione di sferoidi uniformi, compresi gli sferoidi co-coltivati, con forma e dimensioni coerenti. Nonostante i suoi vantaggi, è necessario affrontare diverse sfide per migliorarne l'usabilità e le prestazioni. Un problema significativo è la mancanza di supporto manuale, che rende il dispositivo difficile da maneggiare e soggetto a instabilità durante il processo di formazione dello stampo. Questa instabilità porta spesso alla rottura o alla rottura del gel di agarosio, compromettendone l'integrità strutturale. Inoltre, il dispositivo soffre della mancanza di supporto per piastre, il che significa che non può essere ancorato saldamente alla piastra del pozzetto. Di conseguenza, il timbro deve essere sospeso manualmente fino a quando l'agarosio non si solidifica, introducendo variabilità e influenzando l'uniformità della formazione del micropozzetto. Queste limitazioni riducono la riproducibilità e la qualità complessiva degli sferoidi risultanti.

Il nostro timbro/protocollo migliorato consente un metodo efficiente e a basso costo, generando sferoidi e organoidi 3D in micropozzetti di agarosio, distinguendosi per la sua semplicità e riproducibilità. Ispirato dal lavoro di Decarli e colleghi¹⁶, il nostro gruppo ha utilizzato la metodologia dell'idrogel di agarosio non adesivo per sviluppare un nuovo dispositivo per timbri. Di conseguenza, abbiamo affrontato questioni come le difficoltà di gestione e le incongruenze nella formazione dei micropozzetti. Il timbro sviluppato attraverso la nostra metodologia incorpora questi miglioramenti, rendendolo più facile da usare, efficiente e altamente riproducibile.

Per quanto riguarda le modifiche, la densità cellulare può essere regolata per diversi tipi di cellule e scopi sperimentali. Una maggiore densità di semina cellulare può essere necessaria per le cellule con bassi tassi di proliferazione o limitata interazione cellulare, mentre una densità inferiore potrebbe favorire una migliore organizzazione strutturale per alcuni tipi di cellule. Se sorgono problemi con la formazione di sferoidi, piccole modifiche come la rapida centrifugazione delle piastre possono aiutare le cellule a depositarsi correttamente sul fondo dei micropozzetti.

Una delle fasi critiche del protocollo è la semina accurata e uniforme delle cellule nei micropozzetti. La distribuzione omogenea delle celle è essenziale per garantire che le strutture formate abbiano dimensioni coerenti e proprietà uniformi, con un impatto diretto sulla qualità dei risultati. La raccolta di culture 3D è un altro punto cruciale. Questa fase richiede estrema attenzione per evitare di distruggere le strutture durante il recupero, richiedendo tecniche di pipettaggio appropriate per preservare l'integrità degli sferoidi e degli organoidi.

La dimensione dello sferoide varierà a seconda del tipo di cella utilizzata. Inoltre, anche il numero di cellule per sferoide varia e deve essere ottimizzato in base alla specifica linea cellulare o alle cellule primarie utilizzate. È importante notare che è stato dimostrato che una densità cellulare eccessivamente elevata all'interno di uno sferoide causa lo sviluppo di un nucleo necrotico, come riportato in letteratura. Questo nucleo necrotico è il risultato di un'inadeguata diffusione di ossigeno e nutrienti nelle cellule più interne, che può compromettere la vitalità e la funzione complessiva dello sferoide¹⁷.

Nonostante i vantaggi della semplicità e del basso costo, un limite significativo del metodo è la potenziale variabilità nella raccolta di sferoidi, specialmente negli esperimenti che richiedono strutture più grandi e complesse. In tali casi, può essere necessario l'uso di strumenti di raccolta più specializzati o anche adattamenti metodologici per ottimizzare il processo e ridurre la perdita di materiale. L'ottenimento di sferoidi molto piccoli può anche complicare la manipolazione e la raccolta, richiedendo un rigoroso controllo del protocollo.

L'associazione e la dissociazione di sferoidi/organoidi variano significativamente a seconda del tipo di cellula utilizzata, nonché del numero di giorni necessari per la formazione della struttura, del terreno di coltura impiegato e della necessità di un'eventuale agitazione. Questi fattori sono intrinseci alle caratteristiche specifiche di ciascun tipo di cellula. Tuttavia, per ridurre al minimo la dissociazione cellulare, è essenziale seguire rigorosamente le precauzioni descritte nella metodologia, come la manipolazione delicata durante i cambi di terreno e il corretto mantenimento delle condizioni di coltura.

Rispetto ad altri metodi, come le colture rotative o le biglie magnetiche, questo protocollo si distingue per la sua maggiore semplicità, eliminando la necessità di attrezzature specializzate e garantendo una produzione più riproducibile di sferoidi e organoidi 3D, rendendolo un'alternativa pratica per un'ampia gamma di scopi di ricerca. Secondo i risultati precedentemente descritti in letteratura¹³, i micropozzetti di agarosio facilitano la generazione di strutture sferoidi 3D di cellule produttrici di insulina con tassi di vitalità e secrezione di insulina più elevati rispetto ad altri modelli commerciali, come la piastra sferica 5D.

La versatilità di questo metodo, combinato con il suo basso costo, lo rende ideale per varie aree di ricerca, come la biologia cellulare, l'oncologia, gli studi sullo sviluppo di farmaci e la tossicologia. Offre una soluzione efficace per la modellazione 3D in vitro , facilitando studi più precisi sul comportamento cellulare, l'interazione cellulare, la risposta ai farmaci e lo sviluppo di terapie.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Siamo particolarmente grati all'eccellente assistenza tecnica fornita da Zizi de Mendonça (Scuola di Medicina, Università di San Paolo, Brasile). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni delle seguenti agenzie di ricerca brasiliane: BNDES 09.2.1066.1, CAPES (numero di processo PVE 88881.068070/2014-01), CNPq (numeri di sovvenzione 457601/2013-2, 401430/2013-8 e numero INCT-Regenera 465656/2014-5), FAPESP (numero di progetto tematico 2016/05311-2), FINEP 01.08.06.05 e i Ministeri della Scienza e della Tecnologia (MCTI) e della Salute (MS-DECIT).