Génération de sphéroïdes/organoïdes tridimensionnels à partir de cultures cellulaires bidimensionnelles à l’aide d’un nouveau dispositif de tamponnage

Cette étude présente une méthodologie rentable et efficace pour générer des structures cellulaires 3D à l’aide d’un système basé sur des tampons pour créer des micropuits dans des moules d’agarose. Le système favorise la formation de sphéroïdes/organoïdes uniformes, améliorant ainsi les interactions cellulaires. Cette approche réduit la variabilité expérimentale et soutient les applications dans les tests de médicaments et l’ingénierie tissulaire.

Les cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) fournissent une représentation plus précise du microenvironnement in vivo que les cultures bidimensionnelles (2D) conventionnelles, car elles favorisent des interactions améliorées entre les cellules et la matrice extracellulaire. Cette étude visait à développer une méthodologie efficace, rentable et reproductible pour générer des structures cellulaires 3D (sphéroïdes/organoïdes) à l’aide d’un système innovant basé sur des tampons pour créer des micropuits dans des moules d’agarose. Un nouveau tampon a été utilisé pour produire 663 micropuits par puits d’une plaque à 6 puits, fournissant un environnement idéal pour l’agrégation cellulaire. Des cellules primaires d’îlots pancréatiques porcins ont été ensemencées dans ces micropuits, où elles se sont agrégées pour former des sphéroïdes/organoïdes. Les cultures ont été incubées à 37 °C sous 5 % de CO₂, et le milieu a été remplacé tous les 3 jours. La formation des sphéroïdes a été surveillée périodiquement et des échantillons ont été prélevés à des fins de caractérisation. La méthode a réussi à générer des sphéroïdes uniformes et de haute qualité, réduisant la variabilité expérimentale, minimisant la manipulation et améliorant les interactions cellulaires. L’utilisation de moules à micromotifs à base d’agarose a fourni un environnement simplifié et contrôlé pour les cultures 3D, offrant une solution standardisée et rentable. Cette méthodologie prend en charge les applications de tests de médicaments et d’ingénierie tissulaire, offrant une plate-forme pratique et évolutive pour les modèles de culture cellulaire 3D qui peuvent être facilement mis en œuvre dans divers environnements de laboratoire.

Au cours des 50 dernières années, de nombreuses études en biologie cellulaire ont démontré que les cultures bidimensionnelles (2D) ne parviennent pas à reproduire avec précision les conditions in vivo observées dans les modèles animaux¹. Structurellement, les cultures cellulaires 2D ne permettent pas aux cellules de s’organiser en trois dimensions et de reproduire la situation observée dans les systèmes in vivo . De plus, les voies de signalisation cellulaire sont modifiées dans les cultures 2D par rapport aux cultures tridimensionnelles (3D), ce qui pourrait probablement expliquer pourquoi certains types de criblage de drogues utilisant des cultures 2D sont si divergents². Une avancée significative dans les techniques de culture cellulaire a émergé avec l’introduction des systèmes de culture 3D. La complexité des systèmes 3D varie considérablement en fonction de la composition cellulaire et de la cytoarchitecture. Généralement, deux types de structures sont générés, à savoir : les sphéroïdes et les organoïdes. Les sphéroïdes sont décrits comme de simples amas de cellules obtenues à partir de tissus normaux ou tumoraux, de corps embryoïdes et de lignées cellulaires. La formation de structures 3D est influencée par divers facteurs, notamment les interactions cellule-cellule et les voies de signalisation médiées par les composants de la matrice extracellulaire (MEC), qui fournissent un soutien structurel et des indices biochimiques. Ces éléments régulent les interactions qui contribuent à l’organisation et à la fonction des tissus³. Le système de culture de sphéroïdes a été décrit pour la première fois au début des années 1970, en utilisant des lignées cellulaires pulmonaires de hamster chinois V79 comme modèle de carcinomes nodulaires, se développant dans des conditions non adhérentes et formant des sphères parfaites⁴. Les organoïdes sont décrits comme des amas de types de cellules spécifiques à des organes dérivés de cellules souches ou de cellules progénitrices, qui s’auto-organisent par des processus, tels que le tri cellulaire et la spécification de lignée, de manière spatialement confinée, reflétant le développement in vivo ⁵.

Plusieurs méthodes et matériaux disponibles sont disponibles pour cultiver des cellules dans des conditions 3D. Les principales méthodes actuellement utilisées pour générer des cultures 3D sont : 1) les gouttes suspendues ; 2) culture cellulaire rotative et plastiques à faible attache ; 3) plaques pyramidales contenant des puits coniques ; 4) échafaudages macroporeux ; 5) perles magnétiques ; et 6) hydrogels sans échafaudage.

Les gouttes suspendues sont la méthode utilisée pour obtenir des cultures 3D sans échafaudage. Cette méthode présente certaines limites, notamment la nécessité d’une manipulation intensive, une faible efficacité de production, une géométrie sphérique et une exposition à des forces de cisaillement élevées. De plus, des procédures spécifiques, telles que le remplacement d’un support ou l’ajout de composé, peuvent être difficiles et entraîner une perte de matière. De plus, les rapports de la littérature indiquent que certaines lignées cellulaires ne parviennent pas à produire des sphéroïdes serrés lorsqu’elles utilisent cette approche⁶.

La culture cellulaire rotative et les plastiques à faible adhérence sont utilisés pour empêcher les cellules de se fixer au substrat, ce qui les amène à s’agréger et à former des sphéroïdes. Ce processus nécessite des flacons spécifiques et/ou de l’agitation/rotation. Bien qu’il s’agisse de l’une des approches les plus simples pour la production de sphéroïdes ou d’organoïdes à grande échelle, elle n’est pas sans inconvénients, tels que la nécessité d’un équipement spécifique, la faible longévité de la culture, la variation de taille des sphéroïdes, les dommages mécaniques aux cellules et la faible efficacité⁶.

Les plaques pyramidales contenant des puits coniques sont des plaques disponibles dans le commerce qui impactent les coûts, en plus du fait que certaines manipulations peuvent entraver la formation de sphéroïdes/organoïdes⁷.

Des échafaudages macroporeux sont également utilisés pour la culture 3D ; Cependant, un obstacle majeur réside dans l’obtention d’un ensemencement cellulaire efficace et d’une distribution uniforme. Ce problème se pose parce que la taille des pores peut être soit trop petite pour la pénétration des cellules, soit trop grande pour retenir les cellules en toute sécurité. Pour répondre à ce problème, plusieurs stratégies ont été explorées⁸, qui impactent directement la complexité et le coût de cette technique.

La méthodologie des billes magnétiques génère un petit nombre de sphéroïdes/organoïdes, a un coût élevé et peut laisser des résidus de nanoparticules à l’intérieur des cellules⁹.

Parmi les systèmes de culture de sphéroïdes, il existe des hydrogels d’agarose non adhésifs, représentant un hydrogel sans échafaudage. Cette approche offre des avantages notables, tels qu’un contrôle précis de la taille des structures 3D et la capacité de générer un nombre substantiel de ces structures par plaque. Dans cette méthode, les cellules sont introduites dans un hydrogel avec des puits préformés, dans lequel elles coulent et s’auto-assemblent en sphéroïdes 3D¹⁰.

Dans cette étude, nous présentons un dispositif et une méthodologie permettant de générer des micropuits d’agarose à l’aide d’un moule à micromotifs de manière simple, efficace, reproductible et peu coûteuse.

L’utilisation de ce tampon comme moule pour générer des micropuits dans l’agarose, aidée par la gravité, vise à améliorer l’interaction cellulaire au sein du micropuits et de l’organisation cellulaire, en générant des structures 3D (sphéroïdes/organoïdes) in vitro de manière simple, efficace, reproductible et peu coûteuse, économisant ainsi du temps de recherche et des ressources de laboratoire.

Ce protocole suit les lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche humaine de notre Institution CEUA-FMUSP : 1699/2021, approuvé le 8 septembre 2021 -« Isolement et encapsulation des îlots pancréatiques porcins » et fait partie du Projet Thématique de notre Groupe NUCEL de Thérapie Cellulaire et Moléculaire (www.usp.br/nucel), Subvention FAPESP n° 2016/05311-2, intitulé : « Médecine régénérative visant la thérapie des maladies chroniques dégénératives (cancer et diabète) ».

1. Fabrication du dispositif de tamponnage

REMARQUE : Ce tampon est fabriqué sur mesure par le groupe NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). Le dispositif de tamponnage a été développé à l’aide du logiciel référencé, largement reconnu pour sa précision et ses capacités avancées de modélisation tridimensionnelle.

1. S’assurer que les prototypes conçus comportent 663 microbroches disposées de manière à permettre la génération d’un nombre équivalent de cultures tridimensionnelles, telles que des sphéroïdes ou des organoïdes. Pour assurer la stabilité du tampon sur les surfaces des plateaux T6, positionnez cinq points d’appui stratégiquement le long de la circonférence de l’appareil.
2. Assurez-vous que les microbroches ont un design conique avec des dimensions réglables, allant de 1 à 3 mm de longueur. Le diamètre de la base du cône varie entre 0,7 et 1,5 mm, tandis que l’angle de conicité varie de 5° à 10°.
3. Assurez-vous que la structure « stop » de l’appareil, qui définit la profondeur des microbroches, a une longueur réglable de 10 à 19 mm et un diamètre de 20 à 40 mm, avec des microbroches uniformément réparties sur sa surface.
4. De plus, concevez l’appareil pour qu’il soit doté d’une poignée ergonomique, adaptée à une utilisation d’une seule main, afin d’améliorer la praticité et la précision lors de l’utilisation.
   REMARQUE : Pour faciliter la production à grande échelle de l’appareil, le fichier numérique au format .stl est fourni, étant essentiel pour le processus d’impression 3D.
5. Il suffit de le découper à l’aide d’un logiciel approprié et de l’imprimer avec une imprimante 3D compatible. Utilisez les dimensions d’impression suivantes : X - 68 mm ; Y - 120 mm ; Z - 150 mm, assurant un équilibre idéal entre fonctionnalité et qualité structurelle.
6. Pour la fabrication de l’appareil, utilisez une imprimante 3D photodurcissable, compatible avec la résine polymère durcissable aux UV qui doit avoir une haute résolution et une finition de surface uniforme, caractéristiques essentielles pour des performances optimales de l’appareil.
7. Découper le modèle numérique pour l’impression à l’aide d’un logiciel compatible avec l’imprimante 3D sélectionnée.

2. Préparation des micropuits d’agarose

1. Préparez la solution d’agarose.
   1. Pesez la poudre d’agarose pure et dissolvez-la dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une concentration finale de 1 à 2 % (p/v).
   2. Chauffez la solution au micro-ondes ou au bain-marie jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute, en veillant à ce qu’elle soit homogène et transparente.
      REMARQUE : Évitez de surchauffer ou de réchauffer excessivement, car cela peut dégrader l’agarose. Ne préparez pas de grands volumes de solution mère.
   3. Laisser refroidir la solution à ~40 °C, la température idéale pour le pipetage.
2. Préparez le tampon sur mesure.
   1. Lavez le tampon avec une éponge à poils doux et de l’eau distillée pour éliminer les résidus.
   2. Exposez le tampon nettoyé à la lumière UV pendant 5 à 10 minutes pour assurer la stérilité.
3. Formez les micropuits.
   1. Verser/pipeter ~3 mL de la solution d’agarose à 40 °C dans chaque puits d’une plaque à 6 puits, en assurant une profondeur uniforme de 2-3 mm.
   2. Positionnez le tampon sur mesure au centre du puits pendant que l’agarose est encore chaud.
      REMARQUE : Le tampon a des supports latéraux qui assurent l’alignement et la stabilité, éliminant ainsi le besoin de support manuel. Chaque timbre crée ~663 micropuits (~2 mm de hauteur) par puits. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sur les microbroches ; Si des bulles se forment, déplacez doucement le tampon pour les éliminer.
   3. Laissez l’agarose se solidifier pendant 5 à 10 minutes à température ambiante sans déplacer la plaque.
      REMARQUE : Ne pas déranger l’agarose pendant la solidification pour éviter les variations de la structure du micropuits.
   4. Retirez le tampon avec de légers mouvements de va-et-vient pour libérer l’aspirateur sans endommager les micro-puits.
      REMARQUE : Ce mouvement facilite l’entrée d’air, permettant un retrait en douceur du tampon sans déformer le gel. Les micropuits doivent rester intacts.
   5. Lavez les micropuits 3 fois avec une solution PBS pour éliminer les résidus.
   6. Exposez la plaque à la lumière UV pendant 10 min pour éliminer la contamination microbienne.
   7. Ajouter 3 mL de milieu de culture et incuber la plaque dans un incubateur de CO₂ à 37 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : Cette incubation permet de vérifier l’absence de contamination avant l’ensemencement cellulaire.

3. Ensemencement cellulaire dans les micropuits

1. Préparez la suspension cellulaire.
   1. Collecter les cellules par trypsinisation ou une autre méthode de dissociation pour obtenir une suspension homogène.
   2. Comptez les cellules et ajustez la concentration en fonction du nombre souhaité par micropuits.
      REMARQUE : Pour ensemencer 5 000 cellules par micropuits dans 663 micropuits, préparer une suspension contenant au moins 3,315 × 10⁶ cellules au total. Optimiser la concentration cellulaire pour prévenir la nécrose centrale et assurer une diffusion adéquate des nutriments et de l’oxygène.
2. Ensemencez les cellules.
   1. Pipeter ~3 mL de la suspension cellulaire préparée sur les micropuits, en assurant une distribution uniforme en faisant tourner doucement la plaque.
   2. Laisser les cellules se décanter par gravité (~10-15 min) ou effectuer une centrifugation douce à 100 × g pendant 5 min.
      REMARQUE : La centrifugation peut être utilisée pour s’assurer que les cellules se concentrent dans les micropuits.
   3. Transférez la plaque dans un incubateur de CO₂ à 37 °C avec une atmosphère humidifiée.

4. Maintenance des cultures cellulaires 3D

1. Remplacez le milieu de culture.
   1. Changez le milieu tous les 2-3 jours, en enlevant 50 % de l’ancien milieu et en ajoutant du milieu frais.
      REMARQUE : Assurez-vous que les micropuits restent immergés tout au long de la période de culture pour éviter la déshydratation.
2. Surveiller la formation des cultures 3D.
   1. Poursuivre l’élevage jusqu’à ce que les structures 3D soient complètement formées et compactes (p. ex., 2 à 3 jours pour les cultures primaires d’îlots pancréatiques).
      REMARQUE : Pour les cultures nécessitant un temps de formation plus long, effectuez des changements partiels de milieu tous les 2-3 jours.

5. Collecte et caractérisation de structures 3D

1. Récupérez les sphéroïdes/organoïdes.
   1. Retirez l’ancien milieu et collectez les structures 3D par un pipetage vigoureux à l’aide d’une pointe de pipette de grand diamètre ou coupée pour éviter la compression ou la désagrégation.
      REMARQUE : Un pipetage vigoureux doit être contrôlé pour déloger les agrégats sans les déformer.
2. Préparez-vous à l’analyse.
   1. Utilisez immédiatement les sphéroïdes/organoïdes collectés ou fixez-les pour une analyse future.
      REMARQUE : L’association et la stabilité des sphéroïdes dépendent du type de cellule, du temps de formation et des conditions de culture. Faire attention est essentiel pour éviter la dissociation.

La culture cellulaire utilisée dans cette étude a été dérivée d’îlots pancréatiques porcins. La préparation d’îlots de Langerhans utilisée dans cette étude avait une pureté de 80 ± 5 % basée sur la coloration à la dithizone, et une viabilité des cellules d’îlots de Langerhans de >80 % basée sur la détection de diacétate de fluorescéine dans les cellules vivantes ou d’iodure de propidium dans les cellules mortes (méthode fluorescente Live/Dead). Assurez-vous que la préparation des îlots pancréatiques porcins est pure à au moins 80 % (p. ex., par coloration à la dithizone) et viable à >80 %. Après l’isolement, maintenir les cultures adhérentes dans le milieu CMRL 1066, complétées par 1 mM de L-glutamine, 0,2 % de ciprofloxacine et 10 % de sérum de veau fœtal (SCF), à 37 °C et 5 % de CO₂, comme décrit précédemment^11,12.

Dans la présente étude, l’efficacité d’un système basé sur des tampons pour générer des micropuits dans des moules d’agarose a été évaluée en profondeur (figure 1). La conception du tampon, illustrée à la figure 2, démontre la précision des microbroches et leur placement, facilitant un alignement et une manipulation cohérents pendant le processus de formation des micropuits. Cela a permis d’assurer des motifs de micropuits uniformes sur l’ensemble de la plaque, une caractéristique essentielle pour obtenir des cultures cellulaires 3D reproductibles.

Le processus de formation des micropuits à l’aide du tampon est détaillé à la figure 3, dans laquelle la capacité du tampon à créer des micropuits uniformes est visualisée. Les résultats confirment que plusieurs tampons peuvent être utilisés simultanément, ce qui simplifie le processus de préparation. L’analyse microscopique des moules d’agarose révèle des formes de micropuits concaves et standardisées, un facteur crucial dans le contrôle de l’agrégation des cellules en structures 3D. L’uniformité des micropuits contribue de manière significative à la fiabilité et à la reproductibilité de la formation de cultures 3D, comme le démontrent les résultats cohérents obtenus dans diverses expériences.

La figure 4 illustre le développement dépendant du temps des structures 3D à partir du moment de l’inoculation cellulaire (0 h) à plusieurs points temporels (6 h, 24 h, 48 h et 72 h). La compaction des cellules en structures 3D agrégées/compactes s’est produite progressivement, avec une agrégation significative observée au bout de 48 heures. Cette chronologie peut varier en fonction du type de cellule, comme en témoigne l’utilisation d’îlots pancréatiques porcins primaires dans cette étude, qui ont formé des structures 3D compactes et fonctionnelles en 48 heures. Cela démontre l’efficacité du protocole dans la génération de cultures 3D organisées.

La figure 5 met en évidence la stabilité et la viabilité des structures 3D après avoir été retirées des micropuits d’agarose. Les structures 3D ont conservé leur conformation après l’enlèvement (Figure 5A), confirmant la robustesse de la méthodologie. De plus, le test vivant/mort (Figure 5B, C) a indiqué que les cellules à l’intérieur des structures restaient viables, comme le montre la coloration verte des cellules vivantes. Cette découverte confirme que le protocole facilite non seulement la formation de structures 3D bien organisées, mais préserve également la viabilité cellulaire, ce qui en fait une approche fiable et efficace pour les applications de culture cellulaire 3D.

Figure 1 : Le processus de formation de cultures cellulaires 3D. Les cellules initialement cultivées en 2D sont détachées de la surface adhérente et placées dans des micropuits d’agarose. Ces micropuits d’agarose sont créés à l’aide d’un dispositif de tamponnage, qui permet la formation de ces micropuits après la solidification du gel d’agarose à température ambiante. Lorsqu’elles sont observées en microscopie optique, les cellules peuvent être observées se répartissant uniformément dans les micropuits. Après environ 2-3 jours (selon le type de cellule), la formation de sphéroïdes ou d’organoïdes peut être observée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : dispositif de tamponnage. Des images représentatives du dispositif de tamponnage de (A-C) sous trois angles différents, illustrant ses principales caractéristiques, à savoir : 663 microbroches, supports de plaques et support de manutention manuelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Représentation étape par étape du processus de production du moule à micropuits. (A) Dispositif de tamponnage ; (B) le positionnement du dispositif d’estampillage au centre du puits contenant l’agarose liquide ; (C) polymérisation de l’agarose ; (D) micropuits d’agarose moulés par le dispositif d’estampillage ; E) démonstration de la production à l’aide de trois dispositifs de tamponnage dans la même plaque (P6) ; (F) images de microscopie optique des micropuits à un grossissement de 4x (barre d’échelle = 1 000 μm) ; (G) images de microscopie optique des micropuits à un grossissement de 10x (barre d’échelle = 400 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Images de microscopie optique d’une culture porcine primaire d’îlots pancréatiques. Images à un grossissement de 2x (barre d’échelle = 2 000 μm), 4x (barre d’échelle = 1 000 μm) et 10x (barre d’échelle = 400 μm), aux points temporels suivants : 0 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Essai vivant/mort. Images représentatives montrant la viabilité des sphéroïdes à partir de cultures primaires de cellules d’îlots pancréatiques porcins qui ont été générées dans des micropuits d’agarose et recueillies après 72 h (3 jours) de culture 3D à l’aide du dispositif de marquage amélioré. Des images de microscopie optique à fluorescence ont été obtenues. La coloration verte représente les cellules viables marquées au diacétate de fluorescéine, tandis que la coloration rouge indique les cellules non viables marquées à l’iodure de propidium. Les images confirment que la structure sphéroïdale de la culture 3D est maintenue et reste viable après le retrait des micropuits. Barre d’échelle = 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Bien qu’il existe divers protocoles de culture 3D dans la littérature, une étude menée par Wassmer et ^al.13 a testé plusieurs méthodologies pour générer des structures 3D à l’aide d’îlots pancréatiques. Les auteurs ont observé que les îlots indigènes et les sphéroïdes auto-agrégés présentaient une hétérogénéité considérable en ce qui concerne la taille et la forme et étaient plus grands que ceux obtenus à l’aide d’autres méthodes. Sur la base de leurs découvertes, ils ont conclu que les sphéroïdes peuvent être générés à l’aide de différentes techniques, chacune ayant ses propres avantages et inconvénients. Pour l’agrégation de cellules d’îlots, les méthodes recommandées sont la technique de la goutte suspendue, les plaques de micropuits d’agarose ou la plaque sphérique 5D.

Il existe des dispositifs permettant de générer des micropuits d’agarose qui ont été utilisés avec succès dans la littérature. Par exemple, Stuart et ^al.14 ont montré des résultats prometteurs en utilisant un appareil, mais il présentait certains inconvénients qui doivent être abordés. Il s’agit notamment du nombre limité de micropuits qu’il peut produire, d’un volume de travail réduit en raison de la petite surface du moule et de sa conception en tant que moule négatif, ce qui complique la manipulation et augmente le risque de casse et de distorsion des micropuits.

Un dispositif semblable à un tampon pour générer des sphéroïdes a été développé par Charelli et ses collègues¹⁵ à l’aide de la technologie d’impression 3D. Capable de produire jusqu’à 4 716 sphéroïdes par plaque à 6 puits, le dispositif a été créé par stéréolithographie avec de la résine photodurcissable. Le dispositif résultant comportait des microbroches cylindriques, chacune de 1,3 mm de hauteur et de 650 μm de largeur. Cette méthode a permis la formation rapide de sphéroïdes uniformes, y compris des sphéroïdes co-cultivés, de forme et de taille constantes. Malgré ses avantages, plusieurs défis doivent être relevés pour améliorer sa convivialité et ses performances. Un problème important est le manque de support manuel, ce qui rend l’appareil difficile à manipuler et sujet à l’instabilité pendant le processus de formation du moule. Cette instabilité entraîne souvent la rupture ou la fissuration du gel d’agarose, compromettant son intégrité structurelle. De plus, l’appareil souffre d’un manque de support de plaque, ce qui signifie qu’il ne peut pas être solidement ancré à la plaque de puits. Par conséquent, le poinçon doit être suspendu manuellement jusqu’à ce que l’agarose se solidifie, introduisant de la variabilité et affectant l’uniformité de la formation des micropuits. Ces limitations réduisent la reproductibilité et la qualité globale des sphéroïdes résultants.

Notre tampon/protocole amélioré permet une méthode efficace et peu coûteuse, générant des sphéroïdes et des organoïdes 3D dans des micropuits d’agarose, se distinguant par sa simplicité et sa reproductibilité. S’inspirant des travaux de Decarli et de ses collègues¹⁶, notre groupe a utilisé la méthodologie de l’hydrogel d’agarose non adhésif pour développer un nouveau dispositif de tamponnage. Par conséquent, nous avons résolu des problèmes tels que les difficultés de manipulation et les incohérences dans la formation des micropuits. Le tampon développé grâce à notre méthodologie intègre ces améliorations, ce qui le rend plus convivial, plus efficace et plus reproductible.

En ce qui concerne les modifications, la densité cellulaire peut être ajustée pour différents types de cellules et à des fins expérimentales. Une densité d’ensemencement cellulaire plus élevée peut être nécessaire pour les cellules à faible taux de prolifération ou à interaction cellulaire limitée, tandis qu’une densité plus faible peut favoriser une meilleure organisation structurelle pour certains types de cellules. Si des problèmes surviennent avec la formation de sphéroïdes, de petites modifications telles qu’une centrifugation rapide des plaques peuvent aider les cellules à s’installer correctement au fond des micropuits.

L’une des étapes critiques du protocole est l’ensemencement précis et uniforme des cellules dans les micropuits. Une distribution cellulaire homogène est essentielle pour garantir que les structures formées ont des tailles constantes et des propriétés uniformes, ce qui a un impact direct sur la qualité des résultats. La collecte de cultures 3D est un autre point crucial. Cette étape nécessite un soin extrême pour éviter de détruire les structures lors de la récupération, nécessitant des techniques de pipetage appropriées pour préserver l’intégrité des sphéroïdes et des organoïdes.

La taille du sphéroïde variera en fonction du type de cellule utilisé. De plus, le nombre de cellules par sphéroïde varie également et doit être optimisé en fonction de la lignée cellulaire spécifique ou des cellules primaires utilisées. Il est important de noter qu’il a été démontré qu’une densité cellulaire excessivement élevée à l’intérieur d’un sphéroïde provoque le développement d’un noyau nécrotique, comme indiqué dans la littérature. Ce noyau nécrotique résulte d’une diffusion insuffisante de l’oxygène et des nutriments vers les cellules les plus internes, ce qui peut compromettre la viabilité globale et la fonction du sphéroïde¹⁷.

Malgré les avantages de la simplicité et du faible coût, une limitation importante de la méthode est la variabilité potentielle de la collecte de sphéroïdes, en particulier dans les expériences nécessitant des structures plus grandes et plus complexes. Dans de tels cas, l’utilisation d’outils de collecte plus spécialisés, voire d’adaptations méthodologiques, peut être nécessaire pour optimiser le processus et réduire les pertes de matière. L’obtention de très petits sphéroïdes peut également compliquer la manipulation et la collecte, nécessitant un contrôle strict du protocole.

L’association et la dissociation sphéroïdes/organoïdes varient considérablement en fonction du type de cellule utilisé, ainsi que du nombre de jours nécessaires à la formation de la structure, du milieu de culture utilisé et de la nécessité d’une éventuelle agitation. Ces facteurs sont intrinsèques aux caractéristiques spécifiques de chaque type de cellule. Cependant, pour minimiser la dissociation cellulaire, il est essentiel de suivre strictement les précautions décrites dans la méthodologie, telles qu’une manipulation douce lors des changements de milieu et un bon maintien des conditions de culture.

Comparé à d’autres méthodes, telles que les cultures rotatives ou les billes magnétiques, ce protocole se distingue par sa plus grande simplicité, éliminant le besoin d’équipements spécialisés et assurant une production plus reproductible de sphéroïdes et d’organoïdes 3D, ce qui en fait une alternative pratique pour un large éventail d’objectifs de recherche. Selon les résultats précédemment décrits dans la littérature¹³, les micropuits d’agarose facilitent la génération de structures sphéroïdes 3D de cellules productrices d’insuline avec une viabilité et des taux de sécrétion d’insuline plus élevés par rapport à d’autres modèles commerciaux, tels que la Sphericalplate 5D.

La polyvalence de cette méthode, combinée à son faible coût, la rend idéale pour divers domaines de recherche, tels que la biologie cellulaire, l’oncologie, les études de développement de médicaments et la toxicologie. Il offre une solution efficace pour la modélisation 3D in vitro , facilitant des études plus précises sur le comportement cellulaire, l’interaction cellulaire, la réponse aux médicaments et le développement de thérapies.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Nous sommes particulièrement reconnaissants de l’excellente assistance technique fournie par Zizi de Mendonça (Faculté de médecine, Université de São Paulo, Brésil). Ce travail a été soutenu par des subventions des agences de recherche brésiliennes suivantes : BNDES 09.2.1066.1, CAPES (numéro de processus PVE 88881.068070/2014-01), CNPq (numéros de subvention 457601/2013-2, 401430/2013-8 et numéro INCT-Regenera 465656/2014-5), FAPESP (numéro de projet thématique 2016/05311-2), FINEP 01.08.06.05 et les ministères de la Science et de la Technologie (MCTI) et de la Santé (MS-DECIT).