Kapillaroskopi Kullanılarak Farelerde Çivi Yatağı Mikrovasküler Morfolojisinin İnvaziv Olmayan Görüntülenmesi

Kapillaroskopi, mikrovasküler sistemin doğrudan, ucuz ve non-invaziv görüntülenmesi için erişilebilir bir araçtır. Bu protokolün amacı, araştırmacıların farelerin tırnak yataklarında periferik mikrovasküler morfolojinin görselleştirilmesi için kapillaroskopi kullanmalarını sağlamaktır.

Tırnak kıvrımlı kapillaroskopi (NFC) kullanılarak insanlarda cildin mikrokılcal damar ağlarının görüntülenmesi, kritik sistemik hastalıklarda hedef organ sistemi olarak mikrosirkülasyonun önemini vurgulamıştır. Tırnak kıvrımı kapillaroskopisi, romatizmal, kardiyak, oküler (örneğin glokom) ve endokrin bozukluklar (örneğin, hipertansiyon ve diabetes mellitus) dahil olmak üzere bir dizi sistemik durumda periferik mikrovasküler disfonksiyonu ve anormallikleri tespit etmek için klinik olarak uygulanır. NFC sadece periferik sistemik mikrovasküler sistem bozulmasının saptanmasında değil, aynı zamanda ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde de yararlıdır. Bununla birlikte, klinik NFC bulgularını hayvan hastalığı modellerine çevirmek zor olabilir. Hayvanlarda mikrovasküler disfonksiyonun veya anormalliklerin tespit edilmesi genellikle invazivdir (ör., endoskopik), ex vivo olarak gerçekleştirilir (ör., dokuların ölüm sonrası görüntülenmesi) veya pahalıdır, mikrobilgisayarlı tomografi ve fotoakustik görüntüleme tekniklerinde kullanılanlar gibi özel ekipman gerektirir. Hayvan hastalık modellerinde periferik mikrovaskülatürü görüntülemek için hızlı, invaziv olmayan ve ucuz tekniklerin geliştirilmesi, araştırma masraflarını azaltmak ve kliniğe çevrilebilirliği artırmak için garanti edilmektedir.

Kapillaroskopi daha önce kobaylar ve fareler de dahil olmak üzere hayvan modellerinde tırnak kıvrımı mikrovaskülatürünü görselleştirmek için kullanılmıştır, böylece hayvan modellerinde invaziv olmayan bir görüntüleme aracı olarak kapillaroskopinin yeteneğini göstermiştir. Bu çalışma, bir fare çivi yatağına kapillaroskopi uygulayan ve araştırmacıların mikrovaskülatürünün morfolojisini kolay ve ucuz bir şekilde değerlendirmelerine olanak tanıyan bir protokol sunmaktadır. Yaygın olarak kullanılan iki laboratuvar suşu olan SV129 / S6 ve C57 / B6J kullanılarak vahşi tip farelerde tipik tırnak yatağı mikrovasküler mimarisinin temsili görüntüleri sağlanmaktadır. Bu yöntemi kullanan daha ileri çalışmalar, periferik mikrovasküler anormallikleri olan çok çeşitli fare hastalığı modellerine çivili kapillaroskopi uygulamak için gereklidir.

Tırnak kıvrımlı kapillaroskopi (NFC) kullanılarak insanlarda periferik mikrokılcal ağların görüntülenmesi, çok çeşitli sistemik hastalıklarda hedef organ sistemi olarak mikrosirkülasyonun önemini vurgulamıştır¹. Kapillaroskopi, in vivo olarak tırnak kıvrımındaki damarları büyütmek ve görselleştirmek için bir mikroskop kullanımını içerir. Bu nedenle, romatizmal ^2,3, kardiyak⁴, oküler (örn. glokom)^5,6 ve endokrin hastalıklar (örn., hipertansiyon ve diabetes mellitus ^7,8) dahil olmak üzere bir dizi sistemik durumda periferik mikrovasküler disfonksiyonu ve anormallikleri tespit etmek için klinikte yaygın olarak kullanılan bir tekniktir). Kanamalar, artmış damar kıvrımı ve avasküler bölgeler dahil olmak üzere tırnak kıvrımı kılcal damarlarındaki morfolojik değişiklikler NFC kullanılarak kolayca tespit edilir. Bu morfolojik anormallikler, aşırı veya eksik mikrovasküler yeniden şekillenme gibi patolojik süreçleri temsil eder ^9,10. NFC, bu patolojileri tespit etmek için yararlı bir tanı aracıdır. Ek olarak, bu teknik ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde yararlıdır¹¹.

Bununla birlikte, klinik NFC bulgularını hayvan hastalık modellerine çevirmek birçok nedenden dolayı zordur. Hayvanlarda mikrovasküler sistemin görüntülenmesi tipik olarak invazivdir (ör., endoskopik), ex vivo (ör., dokuların ölüm sonrası görüntülenmesi) veya pahalıdır, mikrobilgisayarlı tomografi ^12,13, koherens tomografi^{anjiyografi 14} ve fotoakustik görüntüleme teknikleri¹⁵ gibi özel ekipman gerektirir. Periferik mikrovasküler patoloji, miyokard enfarktüsü¹⁶, hipertansiyon¹⁷, Alzheimer hastalığı¹⁸ gibi merkezi sinir sisteminin yaşa bağlı nörodejenerasyonları ve glokom¹⁹ gibi optik nöropatiler dahil olmak üzere çok çeşitli sistemik ve merkezi sinir sistemi hastalıklarında belirgin olduğundan, non-invaziv, uygun maliyetli bir in vivo görselleştirme tekniği oldukça faydalıdır.

Kapillaroskopi, kobay²⁰ ve fareler²¹ dahil olmak üzere hayvan modellerinde tırnak kıvrımı mikrovaskülatürünü değerlendirmek için kullanılmıştır ve böylece non-invaziv bir görüntüleme aracı olarak yeteneğini göstermiştir. Burada tırnağın farklı bir yerine, tırnak yatağına kapillaroskopi uyguluyoruz. Fare tırnağının şeffaflığından yararlanan çivili kapillaroskopi, periferik mikrovaskülatür sisteminin görselleştirilmesi için yeni bir konum sunar. Kan hücresi hareketini izlemek için özellikle yararlı olan^{NFC ile karşılaştırıldığında 21,22}, burada açıklanan çivili kapillaroskopi protokolü, mikrovasküler morfoloji ve yapının daha iyi gözlemlenmesi için daha geniş bir alan sağlar. Araştırmacıların, non-invaziv periferik vasküler görüntüleme için yeni bir yer olan fare çivi yataklı mikrovasküler sistemin morfolojisini kolay ve ucuz bir şekilde değerlendirmelerine olanak tanıyan bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yaygın olarak kullanılan iki laboratuvar suşu (SV129 / S6 ve C57 / B6J) kullanarak vahşi tip farelerde tipik tırnak yatağı mikrovasküler mimarisinin temsili görüntülerini sağlar. Çivili kapillaroskopinin ucuz, non-invaziv bir mikrovasküler görüntüleme yöntemi olduğunu gösterdik. Bu keşif yöntemini kullanan daha ileri çalışmalar, patolojide periferik mikrovasküler anormalliklerin belirgin olduğu çok çeşitli fare hastalık modellerine çivili kapillaroskopi uygulamak için gerekli olacaktır.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi ve Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Görüntüleme için fare tırnaklarının hazırlanması

NOT: Optimum damar berraklığı ve cilt iyileşmesi için, görüntülemeden önce en az 24 saat bekleyin.

1. Fare tırnak yataklarının engelsiz görüntülenmesini sağlamak için, kapillaroskopi görüntülemesinden en az 24 saat önce kemirgen pençelerinden kürkü çıkarın (Şekil 1A). Fare pençelerinden kürkü çıkarmak için 1.1.1-1.1.6 adımlarını izleyin.
   1. Solunan izofluran anestezisi (% 5 karbondioksit ve% 95 oksijende% 2 izofluran) kullanarak hayvanı sakinleştirin. Ayak pedini her iki arka ayağınıza sıkıştırarak farenin yeterince uyuşturulduğunu onaylayın. Uygun şekilde uyuşturulursa, sarsıntı hareketi olmamalıdır (pedal çekme refleksi.) Bir refleks hareketi varsa, farenin izofluran altında tamamen anestezi altına girmesi için daha fazla zaman tanıyın. Pedal çekme refleksini tekrar test edin ve devam edin.
   2. Fare uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, anestezi altındayken korneanın kurumasını önlemek için her iki göze kayganlaştırıcı bir göz jeli veya steril ilaçsız oftalmik merhem sürün.
   3. Hayvanı bir burun konisi kullanarak anestezi altında tutarak, bir aplikatör kullanarak tüm pençeye bol miktarda tüy dökücü krem sürün. Şekil 1B'de gösterildiği gibi tüm pençe ve tırnak yatağı alanlarını kaplamaya özen gösterin.
   4. Tüy dökücü kremi pençe üzerinde oda sıcaklığında (RT) 2 dakika bekletin.
   5. Tüy dökücü kremi temiz bir mendille nazikçe ovalayarak dikkatlice temizleyin.
   6. Pençeyi ılık, steril suda yıkayın.
      NOT: Şekil 1C'de gösterildiği gibi, pençelerde görüntüleme için engellenmemiş kürk ve tırnaklar bulunmamalıdır.
   7. Anesteziden güvenli bir şekilde iyileşmesini sağlamak için fareyi kafesine geri koyun. Bilinci yerine gelene kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Fare bilincini geri kazandığında, diğer hayvanlarla birlikte orijinal kafese geri koyun.

2. İn vivo çivili kapillaroskopi görüntüleme

1. Kürkün çıkarılmasından sonra en az 24 saatlik iyileşme süresinin ardından, kapillaroskopi ekipmanını Şekil 2A'da gösterildiği gibi sıcaklık kontrollü bir odaya (21.5-22.5 °C arasında tutulur) kurun. Çivi yatağı görüntüleme için eksiksiz kurulum, 1) izofluran anestezi ekipmanı, 2) bir anestezi burun konisi, 3) ayarlanabilir bir hayvan aşaması, 4) bir kapillaroskopi mikroskobu ve 5) görüntüleme için video yazılımına sahip bir dizüstü bilgisayar içerir.
2. Solunan izofluran anestezisi (% 5 karbondioksit ve% 95 oksijende% 2 izofluran) kullanarak hayvanı sakinleştirin.
   1. Ayak pedini her iki arka ayağınıza sıkıştırarak farenin yeterince uyuşturulduğunu onaylayın. Uygun şekilde uyuşturulursa, sarsıntı hareketi olmamalıdır (pedal çekme refleksi.) Bir refleks hareketi varsa, adım 1.1.1'e dönün ve farenin tamamen uyuşturulması için daha fazla zaman tanıyın. Ardından, pedal çekme refleksini tekrar test edin ve devam edin.
   2. Fare uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, anestezi sırasında korneanın kurumasını önlemek için her iki göze kayganlaştırıcı göz jeli veya steril ilaçsız oftalmik merhem sürün.
3. Hayvanı sedasyon altında tutarak, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, arka pençe volar tarafını objektifin altındaki laboratuvar bant platformunun üzerine gelecek şekilde konumlandırın, yakınlaştırma.
4. Bir aplikatör kullanarak mikroskop objektifi altında tırnakları ayırmak için ayak parmaklarını nazikçe açın. Optimum damar görüntüleme için tırnak yataklarının birbirinden ayrıldığından emin olun.
   NOT: Şekil 2C , dizüstü bilgisayar video yazılımında gemi resmini gösteren tam görüntüleme kurulumunu göstermektedir.
5. Parlamayı azaltmak ve odaklanmayı iyileştirmek için, pençeye cömertçe daldırma yağı (mısır yağı) uygulayın ve tam tırnak kaplaması sağlayın. Kontrastı artırmak ve damar yatağının görselleştirilmesini iyileştirmek için fare pençesinin altına beyaz bant veya benzeri bir şey ekleyin (Şekil 3; ok 3).
6. Arka pençenin ikinci basamağındaki çiviye odaklanın; Farelerde, bu en büyük çividir ve görüntülenmesi en kolay olanıdır. Fare tırnağını odaklamak için x ve y stage ayarlayıcılarını (Şekil 3; ok 4) ve büyütme tekerleğini (bu alette 280x'e kadar; Şekil 3; ok 1).
7. Tırnak damarı ağını görünür hale getirmek için parlamanın konumunu azaltmak için hedefi çevirin (Şekil 3; ok 2).
   NOT: Damarları görmek zorlaşırsa veya görüntüleme süresi uzarsa, daldırma yağını cömertçe yeniden uygulayın. Farelerin yazı tipi pençeleri arka pençelerinden daha küçüktür; Bu nedenle, görüntülemenin arka pençelerde yapılması önerilir.
8. Kapilleroskopu evrensel seri veri yolu (USB) bağlantısı aracılığıyla bir dizüstü bilgisayara bağlayın.
9. Dizüstü bilgisayarda Debut video yazılım uygulamasını açın.
   NOT: Ayarlarda cihazın dizüstü bilgisayara düzgün şekilde bağlandığını doğrulayın.
10. Dizüstü bilgisayar ekranında, kılçık tarafından neyin büyütüldüğünü görselleştirin ve net bir görüntü elde etmek için x ve y kademe ayarlayıcılarını ve büyütme tekerleğini ayarlayarak tırnak yatağına odaklanın.
11. Mikroskop odaklandıktan ve çivi yatağındaki damar ağının net bir görüntüsü görüldükten sonra, Debut'taki kırmızı kayıt düğmesine veya benzer bir video yazılım programına basarak bir video kaydedin (Şekil 2C).
12. Her videoyu uygun proje klasörüne kaydedin ve her videoyu uygun şekilde etiketleyin.

3. Tırnak yatağı görüntülerini kaydetme

1. Çivi yatağı videosunu yazılımda açın ve videoda damarların net bir şekilde odaklandığı bir kareyi manuel olarak seçin.
2. Bilgisayardaki Ekran Görüntüsü aracını kullanarak, tırnaktaki net damar sistemini gösteren ilk video ekranının ekran görüntüsünü alın. Resmi kaydedin.
3. Dosya ve Aç'a tıklayarak ekran görüntüsü görüntüsünü ImageJ yazılımında açın; Dosyayı hedef klasöründen seçin.
4. Gerekirse, Görüntü > Parlaklığı/Kontrastı Ayarla > seçerek parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Bu araç, damar morfolojisini daha iyi görselleştirmek için görüntülerin kontrastını değiştirmeye yardımcı olabilir.
5. Görüntü ayarlandıktan sonra, Parlaklık/Kontrast aracında Ayarla'ya tıklayın.
6. Dosya'ya ve ardından Farklı kaydet'e tıklayarak görüntüyü bir TIFF dosyası olarak kaydedin.

Burada tarif edilen kapillaroskopi yöntemi kullanılarak, Şekil 4A'da gösterildiği gibi çivili vasküler morfoloji kolayca görüntülenebilir. Bir faredeki tipik tırnak yatağı damar sistemi, Şekil 4B'de vurgulandığı gibi üç tutarlı özellik sergiler: her tırnak yatağında 1) afferent bir damar, 2) bir efferent damar ve 3) hem afferent hem de efferent damarları birbirine bağlayan bir kılcal damar ağı vardır. Çivi yatağı morfolojisinin tutarlılığını göstermek için, Şekil 4C'de SV129/S6 arka plan üzerinde vahşi tip bir farede temsili bir çivi yataklı kılcal ağ ve Şekil 4D'de C57/B6J arka plan üzerinde vahşi tip bir fare gösteriyoruz.

Şekil 1: Kapillaroskopi görüntülemesi için tırnak hazırlığı. (A) Tırnakları gizleyen kürkü gösteren oklu örnek fare pençesi. (B) Tüy dökücü kremin uygulanması - tüm pençeyi kaplamaya özen göstererek farenin arka pençesine cömertçe uygulayın. (C) Epilasyondan sonra örnek fare pençesi; Not - Tırnaklar artık kürk tarafından engellenmez ve 24 saat içinde görüntülemeye hazırdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kapillaroskopi kurulumu. (A) Tırnak yatağı görüntüleme için tam kurulumu gösteren kapillaroskopi ekipmanının fotoğrafı: (1) izofluran anestezi ekipmanı, (2) anestezi burun konisi, (3) ayarlanabilir hayvan aşaması, (4) kapillaroskopi mikroskobu ve (5) görüntüleme için video yazılımına sahip dizüstü bilgisayar. (B) Prosedür için örnek fare yerleşimi; Fare, burun konisi tarafından sedasyon altında tutulur ve objektif altında görüntüleme için arka ayak volar tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirilir (bkz. (C) Dizüstü bilgisayar video yazılımında gemi resmini gösteren eksiksiz görüntüleme kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kapilaroskop ayarlama ve önerileri. Görüntü kalitesini artırmak için ayarlanabilir seçenekleri göstermek için kapillaroskopi ekipmanının fotoğrafı. (1) Hedefi fare tırnağına doğru getirmek için z konumunu ayarlamak için düğmeyi kullanın, (2) tırnaklardaki ışıktan kaynaklanan parlama miktarını ayarlamak için hedefi çevirin, (3) daha iyi damar ağı görünümü için kontrastı en üst düzeye çıkarmak için beyaz veya renkli laboratuvar bandı uygulayın, (4) hayvan konumlandırma için kapillaroskopi mikroskobu x ve y aşama ayarını kullanın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farelerde tipik tırnak yatağı damar sistemi morfolojisi. (A) Kapillaroskopi ile elde edilen fare tırnak yatağı görüntüsü örneği ve (B) tipik tırnak yatağı morfolojisi üç unsurdan oluşur: 1) afferent bir damar, 2) efferent bir damar ve 3) eleman 1 ve 2 arasında bulunan bir kılcal damar ağı. Çivili morfoloji, (C) SV129/S6 ve (D) C57/B6J arka planındaki fareler de dahil olmak üzere vahşi tip fare suşları arasında tutarlı kalır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Özetle, araştırmacıların, non-invaziv periferik vasküler görüntüleme için yeni bir yer olan fare tırnağı mikrovaskülatürünün morfolojisini kolay ve ucuz bir şekilde değerlendirmelerine olanak tanıyan bir protokol sunuyoruz. Gine domuzlarında²⁰ ve farelerde²¹ kullanılan NFC yöntemleri gibi, burada açıklanan protokolün en büyük gücü, fare hastalık modellerinde periferik mikrovaskülatür sisteminin hızlı ve invaziv olmayan bir şekilde değerlendirilmesine izin vermesidir. Bu, romatizmal hastalıklar^2,3 ve hipertansiyon ve diabetes mellitus ^7,8 dahil olmak üzere endokrin hastalıklar gibi periferik vasküler anormallikleri içeren çalışmalar için özellikle yararlı olabilir.

Fare tırnağının şeffaflığından yararlanan çivili kapillaroskopi, periferik mikrovaskülatür sisteminin görselleştirilmesi için yeni bir konum sunar. Kan hücresi hareketini izlemek için özellikle yararlı olan^{NFC ile karşılaştırıldığında 21,22}, burada açıklanan çivili kapillaroskopi protokolü, mikrovasküler morfoloji ve yapının daha iyi gözlemlenmesi için daha geniş bir alan sağlar.

Optimum görüntülemeyi sağlamak için tırnağı görüntülemeye hazırlayan adımlara dikkat etmenizi öneririz. Başarılı tırnak yatağı görüntülemesi için etkili epilasyon şarttır; Tırnağı gizleyen saçlar görüntüleme bozukluğuna yol açacaktır. Ayrıca epilasyonun görüntülemeden en az 24 saat önce tamamlanmasını öneririz; Bu, epilasyon prosedüründen kaynaklanan herhangi bir tahrişin çözülmesine izin vermek içindir. Bu yöntemin kullanımında oluşabilecek değişkenliği sınırlamak için, daha büyük boyutu nedeniyle görüntüleme için arka pençenin ikinci basamağının kullanılmasını öneririz. Bu aynı zamanda hayvanlar arasındaki tutarlılığı da korur. Ayrıca, daldırma yağının cömert uygulaması, küçük çivi yataklı kılcal ağların çözünürlüğünü iyileştirmeye yardımcı olur. Son olarak, görüntülemeden önce tırnağın altına uygun şekilde renklendirilmiş laboratuvar bandı uygulamak, damarların görüntülenmesi için kontrastı da iyileştirir.

Tekniğin brüt çivili damar morfolojisini çözmedeki etkinliğine rağmen, burada belirtildiği gibi tekniğin bazı sınırlamaları vardır. Görüntüleme arayüzünün doğası ve damarların boyutu nedeniyle, bu protokol kullanılarak kan akışının veya kan hücresi hızının çözülmesi mümkün değildir. Damar görüntü yakalamayı optimize eden daha fazla çalışma, gelecekte periferik mikrovasküler özelliklerin daha fazla karakterize edilmesinde değerli olacak otomatik görüntü analizi yaklaşımlarını mümkün kılabilir. İkinci olarak, tarif edilen protokol, tırnak yatağı görüntülerini yakalamak için farelerin anestezisini gerektirir. Anestezi, mikrodamar morfolojisini uzun süreler boyunca değiştirir (65 dakika sonra)²³. Bu yöntemi kullanarak anestezi altında geçen süre önemli ölçüde daha kısa olsa da, araştırmacılar toplanan verilerde tutarlılığı sağlamak ve değişkenliği azaltmak için fareden fareye prosedürü tamamlamak için geçen süreye dikkat etmelidir.

Periferik damar görüntülemesi sıklıkla invaziv ve pahalıdır^12,13; Bununla birlikte, burada açıklanan protokol, periferik damar morfolojisinin hızlı, ucuz ve kolay bir şekilde görselleştirilmesine izin vermek için bu sınırlamaların üstesinden gelmeye yardımcı olur. Sonuç olarak, bu protokolde tarif edilen keşif yöntemi, periferik vasküler hastalık modellerinde fare tırnak yatağındaki morfolojik anormallikleri karakterize etmeyi amaçlayan gelecekteki çalışmalarda uygulanabilir.

Bu işle ilgisi olmayan Dr. Pasquale, Twenty Twenty'nin ücretli bir danışmanıydı. Bu işle ilgisi olmayan Clara Cousins, Cartography Biosciences'ın ücretli bir danışmanıdır. Diğer yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, Lauren K. Wareham'a verilen sınırsız departman fonları ile finanse edildi. Dr. Pasquale, Glokom Vakfı (NYC) tarafından ve Körlüğü Önleme Araştırmaları'ndan (NYC) sınırsız bir meydan okuma hibesi ile desteklenmektedir.