Неинвазивная визуализация морфологии микрососудов ногтевого ложа у мышей с помощью капилляроскопии

Капилляроскопия является доступным инструментом для прямой, недорогой и неинвазивной визуализации микроциркуляторного русла. Цель этого протокола состоит в том, чтобы дать возможность исследователям использовать капилляроскопию для визуализации периферической микрососудистой морфологии в ногтевых ложах мышей.

Визуализация микрокапиллярных сетей кожи человека с помощью капилляроскопии ногтевых складок (НФК) подчеркнула важность микроциркуляции как системы органов-мишеней при критических системных заболеваниях. Ногтевая капилляроскопия применяется в клинической практике для выявления периферической микрососудистой дисфункции и аномалий при ряде системных состояний, включая ревматические, сердечные, глазные (например, глаукома) и эндокринные расстройства (например, гипертонию и сахарный диабет). ЯТК полезен не только для выявления нарушения периферического системного микроциркуляторного русла, но и для оценки эффективности препарата. Тем не менее, перенос клинических результатов ЯТК на модели болезней животных может быть сложной задачей. Выявление микрососудистой дисфункции или аномалий у животных часто является инвазивным (например, эндоскопическим), проводится ex vivo (например, посмертная визуализация тканей) или дорогостоящим, требующим специализированного оборудования, такого как то, которое используется в методах микрокомпьютерной томографии и фотоакустической визуализации. Разработка быстрых, неинвазивных и недорогих методов визуализации периферического микроциркуляторного русла на животных моделях заболеваний оправдана для снижения затрат на исследования и повышения переносимости в клинику.

Капилляроскопия ранее использовалась для визуализации микроциркуляторного русла ногтевой складки на животных моделях, в том числе на морских свинках и мышах, тем самым демонстрируя возможности капилляроскопии в качестве неинвазивного инструмента визуализации на животных моделях. В этом исследовании представлен протокол, который применяет капилляроскопию к ногтевому ложу мыши, что позволяет исследователям легко и недорого оценить морфологию ее микроциркуляторного русла. Представлены репрезентативные изображения типичной микрососудистой архитектуры ногтевого ложа у мышей дикого типа с использованием двух широко используемых лабораторных штаммов, SV129/S6 и C57/B6J. Дальнейшие исследования с использованием этого метода имеют важное значение для применения капилляроскопии ногтевого ложа к широкому спектру моделей заболеваний мышей с периферическими микрососудистыми аномалиями.

Визуализация периферических микрокапиллярных сетей у человека с помощью капилляроскопии ногтевых складок (НКЦ) подчеркнула важность микроциркуляции как системы органов-мишеней при широком спектре системных заболеваний¹. Капилляроскопия включает в себя использование микроскопа для увеличения и визуализации сосудов в ногтевой складке in vivo. Таким образом, этот метод широко используется в клинике для выявления периферических микрососудистых дисфункций и аномалий при ряде системных состояний, включая ревматические ^2,3, сердечные⁴, глазные (например, глаукому)^5,6, и эндокринные заболевания (например, гипертонию и сахарный диабет ^7,8). Морфологические изменения в капиллярах ногтевой складки, включая кровоизлияния, повышенную извитость сосудов и аваскулярные области, легко обнаруживаются с помощью НГЦ. Эти морфологические аномалии представляют собой патологические процессы, такие как чрезмерное или недостаточное микрососудистое ремоделирование ^9,10. NFC является полезным диагностическим инструментом для выявления этих патологий. Кроме того, эта методика полезна при оценке эффективности препарата¹¹.

Тем не менее, перенос клинических результатов ЯТК на животные модели заболеваний является сложной задачей по многим причинам. Визуализация микроциркуляторного русла у животных обычно является инвазивной (например, эндоскопической), выполняется ex vivo (например, посмертная визуализация тканей) или дорогостоящей, требующей специализированного оборудования, такого как микрокомпьютерная томография^12,13, когерентная томография^{ангиография 14} и методы фотоакустической визуализации¹⁵. Поскольку периферическая микрососудистая патология проявляется в широком спектре системных заболеваний и заболеваний центральной нервной системы, включая инфаркт миокарда¹⁶, гипертензию¹⁷, возрастные нейродегенерации центральной нервной системы, такие как болезнь Альцгеймера¹⁸, и оптические невропатии, такие как глаукома¹⁹, неинвазивный, экономически эффективный метод визуализации in vivo очень полезен.

Капилляроскопия была использована для оценки микроциркуляторного русла ногтевой складки на животных моделях, включая морских свинок²⁰ и мышей²¹, тем самым продемонстрировав ее возможности в качестве неинвазивного инструмента визуализации. Здесь мы применяем капилляроскопию к другой части ногтя, к ногтевому ложу. Используя прозрачность ногтя мыши, гвоздевая капилляроскопия представляет собой новое место для визуализации периферического микроциркуляторного русла. По сравнению с NFC, который особенно полезен для мониторинга движения клеток крови ^21,22, описанный здесь протокол капилляроскопии с гвоздевым стержнем обеспечивает большую площадь для лучшего наблюдения за морфологией и структурой микрососудов. Мы предоставляем протокол, который позволяет исследователям легко и недорого оценить морфологию микроциркуляторного русла мышиного ногтя, что является новым местом для неинвазивной визуализации периферических сосудов. Этот протокол обеспечивает репрезентативные изображения типичной микрососудистой архитектуры ногтевого ложа у мышей дикого типа с использованием двух широко используемых лабораторных штаммов (SV129/S6 и C57/B6J). Мы показываем, что гвоздевая капилляроскопия является недорогим, неинвазивным методом микрососудистой визуализации. Дальнейшие исследования с использованием этого исследовательского метода будут иметь важное значение для применения гвоздевой капилляроскопии к широкому спектру мышиных моделей заболеваний, где периферические микрососудистые аномалии очевидны при патологии.

Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Университета Вандербильта и Массачусетской больницы общего профиля.

1. Подготовка ногтей мыши к визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной прозрачности сосудов и восстановления кожи подождите не менее 24 часов перед визуализацией.

1. Чтобы обеспечить беспрепятственную визуализацию ногтевого ложа мыши, удалите шерсть с лап грызунов не менее чем за 24 часа до капилляроскопии (Рисунок 1A). Чтобы удалить шерсть с лап мыши, выполните шаги 1.1.1-1.1.6.
   1. Успокоить животное с помощью ингаляционной изофлурановой анестезии (2% изофлуран в 5% углекислом газе/95% кислорода). Убедитесь, что мышь адекватно обезболивается, ущипнув подушечку лапы на обеих задних лапах. При правильном обезболивании не должно быть никаких дергательных движений (рефлекс отхода педалей). Если есть рефлекторное движение, дайте мыши больше времени под действием изофлурана, чтобы полностью обезболиться. Повторите тест на рефлекс отвода педали и продолжайте.
   2. После того, как мышь будет должным образом обезболивая, нанесите на оба глаза лубрикантный гель для глаз или стерильную немедикаментозную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время анестезии.
   3. Поддерживая животное под наркозом с помощью носового конуса, нанесите обильное количество крема для удаления волос на всю лапу с помощью аппликатора. Позаботьтесь о том, чтобы покрыть всю область лапы и ногтевого ложа, как показано на рисунке 1B.
   4. Оставьте крем для удаления волос на лапе на 2 минуты при комнатной температуре (RT).
   5. Тщательно смойте крем для эпиляции, аккуратно разтерев его чистой салфеткой.
   6. Вымойте лапу в теплой стерильной воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лапы должны быть свободны от шерсти, а когти должны быть свободны для визуализации, как показано на рисунке 1C.
   7. Верните мышь в клетку, чтобы обеспечить безопасное восстановление после анестезии. Не оставляйте мышь без присмотра, пока она не придет в сознание. Как только мышь придет в сознание, верните ее в исходную клетку в компании других животных.

2. Капилляроскопия ногтевого когтя in vivo

1. По прошествии минимального 24-часового времени восстановления после удаления шерсти установите оборудование для капилляроскопии в помещении с регулируемой температурой (поддерживаемой в диапазоне 21,5-22,5 °C), как показано на рисунке 2A. Полный комплект оборудования для визуализации ногтевого ложа включает в себя: 1) оборудование для изофлурановой анестезии, 2) носовой конус для анестезии, 3) регулируемую сцену для животных, 4) капилляроскопический микроскоп и 5) ноутбук с программным обеспечением для видеовизуализации.
2. Успокоить животное с помощью ингаляционной изофлурановой анестезии (2% изофлуран в 5% углекислом газе/95% кислорода).
   1. Убедитесь, что мышь адекватно обезболивается, ущипнув подушечку лапы на обеих задних лапах. При правильном обезболивании не должно быть никаких дергательных движений (рефлекс отхода педалей). Если есть рефлекторное движение, вернитесь к пункту 1.1.1 и дайте мыши больше времени для полного обезболивания. Затем повторно проверьте рефлекс отвода педали и продолжите.
   2. После того, как мышь будет должным образом обезболивая, нанесите на оба глаза лубрикантный глазной гель или стерильную немедикаментозную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время анестезии.
3. Удерживая животное под действием седативных препаратов, расположите ладонную сторону задней лапы вверх на верхней части платформы для лабораторной ленты ниже объектива, как показано на рисунке 2B, увеличение.
4. Аккуратно раздвиньте пальцы ног на отдельные ногти под объективом микроскопа с помощью аппликатора. Убедитесь, что гвоздевые ложа отделены друг от друга для оптимальной визуализации сосудов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2C показана полная конфигурация изображения, показывающая изображение судна на видеопрограммном обеспечении ноутбука.
5. Чтобы уменьшить блики и улучшить концентрацию внимания, обильно нанесите на лапу иммерсионное масло (кукурузное масло), обеспечив полное покрытие ногтей. Добавьте белую ленту или что-то подобное под мышиную лапу для повышения контрастности и улучшения визуализации дна судна (Рисунок 3; стрелка 3).
6. Сосредоточьтесь на когтем, на втором пальце задней лапы; У мышей это самый большой ноготь и его легче всего изобразить. Чтобы сфокусировать ноготь мыши, используйте регуляторы x и y (рисунок 3; стрелка 4) и колесо увеличения (до 280x на этом инструменте; Рисунок 3; стрелка 1).
7. Поверните объектив, чтобы уменьшить положение бликов, чтобы увидеть сеть ногтевых сосудов (Рисунок 3; стрелка 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если сосуды становятся плохо различимыми или время визуализации увеличивается, обильно нанесите иммерсионное масло повторно. Купельные лапы мышей меньше задних; Таким образом, рекомендуется проводить визуализацию на задних лапах.
8. Подключите капилляроскоп к портативному компьютеру через соединение универсальной последовательной шины (USB).
9. Откройте программное приложение Debut video на ноутбуке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что устройство правильно подключено к ноутбуку в настройках.
10. На экране ноутбука визуализируйте то, что увеличивается с помощью капилляроскопа, и сосредоточьтесь на ногтевом ложе, регулируя регуляторы X и Y и колесо увеличения для получения четкого изображения.
11. После того, как микроскоп сфокусирован и вы увидите четкое изображение сети сосудов в ногтевом ложе, запишите видео, нажав красную кнопку записи в Debut или аналогичной видеопрограмме (рис. 2C).
12. Сохраните каждое видео в соответствующую папку проекта и пометьте каждое видео соответствующим образом.

3. Сохранение изображений ногтевого ложа

1. Откройте видео с ногтевым ложем в программном обеспечении и вручную выберите кадр на видео, где суда находятся в четком фокусе.
2. С помощью инструмента «Скриншот» на компьютере сделайте скриншот экрана дебютного видео, на котором видна прозрачная сосудистая сеть в ногте. Сохраните изображение.
3. Откройте изображение скриншота в программе ImageJ, нажав «Файл » и «Открыть»; Выберите файл из папки назначения.
4. При необходимости отрегулируйте яркость и контрастность, выбрав Изображение > Настроить > Яркость/Контрастность. Этот инструмент может помочь изменить контраст изображений для лучшей визуализации морфологии сосуда.
5. После того, как изображение будет настроено, нажмите «Установить » в инструменте «Яркость/контрастность ».
6. Сохраните изображение как файл TIFF, нажав « Файл », а затем «Сохранить как».

С помощью описанного здесь метода капилляроскопии можно легко визуализировать морфологию сосудов ногтевого ложа, как показано на рисунке 4A. Типичная сосудистая сеть ногтевого отверстия у мыши обладает тремя постоянными особенностями, как показано на рисунке 4B: каждое ногтевое ложе имеет 1) афферентный сосуд, 2) эфферентный сосуд и 3) сеть капилляров, соединяющих как афферентные, так и эфферентные сосуды. Чтобы продемонстрировать последовательность морфологии ногтевого ложа, мы показываем на рисунке 4C репрезентативную капиллярную сеть ногтевого типа у мыши дикого типа на фоне SV129/S6, а на рисунке 4D — мышь дикого типа на фоне C57/B6J.

Рисунок 1: Подготовка ногтей к капилляроскопии. (A) Пример мышиной лапы со стрелками, иллюстрирующими мех, скрывающие ногти. (B) Нанесение крема для удаления волос - обильно нанесите на заднюю лапу мыши, стараясь покрыть всю лапу. (В) Пример мышиной лапы после эпиляции; Примечание - Ногти больше не засорены шерстью и готовы к визуализации через 24 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Установка для капилляроскопии. (A) Фотография оборудования для капилляроскопии, показывающая полную комплектацию для визуализации ногтевого ложа: (1) оборудование для анестезии изофлурана, (2) носовой конус для анестезии, (3) регулируемая сцена для животных, (4) капилляроскопический микроскоп и (5) ноутбук с программным обеспечением для визуализации. (B) Пример размещения мыши для процедуры; Мышь находится под действием седативных препаратов с помощью носового конуса, а задняя лапа помещается ладонной стороной вверх для визуализации под объективом (см. Увеличение). (C) Полная настройка изображения, показывающая изображение судна на видеопрограммном обеспечении ноутбука. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Настройка капилляроскопа и рекомендации. Фотография оборудования для капилляроскопии для иллюстрации настраиваемых опций для улучшения качества изображения. (1) Используйте ручку для регулировки положения z, чтобы подвести объектив к ногтю мыши, (2) поверните объектив, чтобы отрегулировать количество бликов от света на ногтях, (3) наклейте белую или цветную лабораторную ленту для максимизации контраста для лучшего обзора сети сосудов, (4) используйте капилляроскопию микроскопа x и y для позиционирования животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Типичная морфология сосудистой сети ногтевого отверстия у мышей. (А) Пример изображения ногтевого ложа мыши, полученное с помощью капилляроскопии и (Б) типичная морфология ногтевого ложа состоит из трех элементов: 1) афферентного сосуда, 2) эфферентного сосуда и 3) капиллярной сети, которая существует между элементами 1 и 2. Морфология ногтевого заложения остается неизменной между линиями мышей дикого типа, включая мышей на фоне (C) SV129/S6 и (D) C57/B6J. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таким образом, мы предоставляем протокол, позволяющий исследователям легко и недорого оценить морфологию микроциркуляторного русла мышиного ногтя, нового места для неинвазивной визуализации периферических сосудов. Как и методы NFC, используемые на морских свинках²⁰ и мышах²¹, основное преимущество описанного здесь протокола заключается в том, что он позволяет быстро и неинвазивно оценить периферический микроциркуляторный русло на мышиных моделях заболевания. Это может быть особенно полезно для исследований, связанных с аномалиями периферических сосудов, такими как ревматические заболевания ^2,3 и эндокринные заболевания, включая гипертонию и сахарный диабет ^7,8.

Используя прозрачность ногтя мыши, гвоздевая капилляроскопия представляет собой новое место для визуализации периферического микроциркуляторного русла. По сравнению с NFC, который особенно полезен для мониторинга движения клеток крови ^21,22, описанный здесь протокол капилляроскопии с гвоздевым стержнем обеспечивает большую площадь для лучшего наблюдения за морфологией и структурой микрососудов.

Чтобы обеспечить оптимальное изображение, мы рекомендуем обратить внимание на этапы подготовки ногтя к изображению. Эффективная эпиляция является обязательным условием для успешной визуализации ногтевого ложа; Волосы, затеняющие ноготь, приведут к нарушению изображения. Мы также рекомендуем проводить эпиляцию не менее чем за 24 часа до визуализации; Это необходимо для того, чтобы любое раздражение от процедуры удаления волос исчезло. Чтобы ограничить вариабельность, которая может возникнуть при использовании этого метода, мы рекомендуем использовать для визуализации второй палец задней лапы из-за его большего размера. Это также поддерживает согласованность между животными. Кроме того, обильное нанесение иммерсионного масла помогает улучшить разрешение небольших капиллярных сеток с ногтевым ложем. Наконец, наложение лабораторной ленты соответствующего цвета под ноготь перед визуализацией также улучшает контрастность для визуализации сосудов.

Несмотря на эффективность метода в определении морфологии крупного ногтевого сосуда, существуют некоторые ограничения метода, как описано здесь. Из-за особенностей интерфейса визуализации и размера сосудов разрешение кровотока или скорости клеток крови невозможно при использовании этого протокола. Дальнейшая работа по оптимизации захвата изображений сосудов может позволить в будущем использовать автоматизированные подходы к анализу изображений, что будет полезно для дальнейшей характеристики периферических микрососудистых особенностей. Во-вторых, описанный протокол требует обезболивания мышей для получения изображений ногтевых кроватей. Анестезия изменяет морфологию микрососудов в течение длительных периодов времени (через 65 мин)²³. Несмотря на то, что время под анестезией значительно сокращается при использовании этого метода, исследователи должны помнить о времени, затраченном на выполнение процедуры от мыши к мыши, чтобы обеспечить согласованность и уменьшить вариабельность собранных данных.

Визуализация периферических сосудов часто является инвазивной и дорогостоящей^12,13; Тем не менее, описанный здесь протокол помогает преодолеть эти ограничения, что позволяет быстро, дешево и легко визуализировать морфологию периферических сосудов. В заключение следует отметить, что исследовательский метод, описанный в этом протоколе, может быть реализован в будущих исследованиях, направленных на характеристику морфологических аномалий в ногтевом ложе мыши на моделях заболеваний периферических сосудов.

Не имея отношения к этой работе, доктор Паскуале был оплачиваемым консультантом Twenty Twenty. Не связанная с этой работой, Клара Казинс является оплачиваемым консультантом Cartography Biosciences. Остальным авторам нечего раскрывать.

Эта работа финансировалась из неограниченных ведомственных фондов, предоставленных Лорен К. Уэрхэм. Доктор Паскуале получает поддержку от Фонда глаукомы (Нью-Йорк) и неограниченного гранта от Исследования по предотвращению слепоты (Нью-Йорк).