Visualizzazione non invasiva della morfologia microvascolare del letto ungueale nei topi mediante capillaroscopia

La capillaroscopia è uno strumento accessibile per la visualizzazione diretta, economica e non invasiva della microvascolarizzazione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire ai ricercatori di utilizzare la capillaroscopia per la visualizzazione della morfologia microvascolare periferica nei letti ungueali dei topi.

L'imaging delle reti microcapillari della pelle negli esseri umani utilizzando la capillaroscopia della piega ungueale (NFC) ha sottolineato l'importanza della microcircolazione come sistema di organi bersaglio nelle malattie sistemiche critiche. La capillaroscopia della piega ungueale viene applicata clinicamente per rilevare la disfunzione microvascolare periferica e le anomalie in una serie di condizioni sistemiche, tra cui disturbi reumatici, cardiaci, oculari (ad esempio, glaucoma) ed endocrini (ad esempio, ipertensione e diabete mellito). La NFC è utile non solo per rilevare l'interruzione della microvascolarizzazione sistemica periferica, ma anche per valutare l'efficacia dei farmaci. Tuttavia, tradurre i risultati clinici della NFC in modelli di malattie animali può essere difficile. Il rilevamento di disfunzioni o anomalie microvascolari negli animali è spesso invasivo (ad esempio, endoscopico), eseguito ex vivo (ad esempio, imaging post-mortem dei tessuti) o costoso e richiede apparecchiature specializzate come quelle utilizzate nella tomografia microcomputerizzata e nelle tecniche di imaging fotoacustico. Lo sviluppo di tecniche rapide, non invasive e poco costose per l'imaging della microvascolarizzazione periferica in modelli animali di malattia è giustificato per ridurre le spese di ricerca e aumentare la traducibilità in clinica.

La capillaroscopia è stata precedentemente utilizzata per visualizzare la microvascolarizzazione della piega ungueale in modelli animali, tra cui cavie e topi, dimostrando così la capacità della capillaroscopia come strumento di imaging non invasivo in modelli animali. Questo studio fornisce un protocollo che applica la capillaroscopia a un letto ungueale di topo, consentendo ai ricercatori di valutare facilmente ed economicamente la morfologia della sua microvascolarizzazione. Vengono fornite immagini rappresentative della tipica architettura microvascolare del letto ungueale nei topi wild-type utilizzando due ceppi di laboratorio comunemente usati, SV129/S6 e C57/B6J. Ulteriori studi che utilizzano questo metodo sono essenziali per applicare la capillaroscopia del letto ungueale a un'ampia gamma di modelli murini di malattia con anomalie microvascolari periferiche.

L'imaging delle reti microcapillari periferiche nell'uomo mediante capillaroscopia della piega ungueale (NFC) ha evidenziato l'importanza della microcircolazione come sistema di organi bersaglio in un'ampia gamma di malattie sistemiche¹. La capillaroscopia prevede l'uso di un microscopio per ingrandire e visualizzare i vasi nella piega ungueale in vivo. In quanto tale, è una tecnica ampiamente utilizzata in clinica per rilevare disfunzioni e anomalie microvascolari periferiche in una serie di condizioni sistemiche, tra cui reumatiche ^2,3, cardiache⁴, oculari (ad esempio, glaucoma)^5,6 e malattie endocrine (ad esempio, ipertensione e diabete mellito ^7,8). I cambiamenti morfologici nei capillari della piega ungueale, tra cui emorragie, aumento della tortuosità dei vasi e regioni avascolari, sono prontamente rilevati utilizzando la NFC. Queste anomalie morfologiche rappresentano processi patologici come un eccessivo o carente rimodellamento microvascolare ^9,10. La NFC è un utile strumento diagnostico per rilevare queste patologie. Inoltre, questa tecnica è utile nella valutazione dell'efficacia dei farmaci¹¹.

Tuttavia, tradurre i risultati clinici della NFC in modelli animali di malattia è difficile per molte ragioni. La visualizzazione della microvascolarizzazione negli animali è tipicamente invasiva (ad esempio, endoscopica), eseguita ex vivo (ad esempio, imaging post-mortem dei tessuti) o costosa e richiede apparecchiature specializzate come la tomografia microcomputerizzata^12,13, l'angiografia con tomografia a coerenza¹⁴ e le tecniche di imaging fotoacustico¹⁵. Poiché la patologia microvascolare periferica è evidente in un'ampia gamma di malattie sistemiche e del sistema nervoso centrale, tra cui l'infarto del miocardio¹⁶, l'ipertensione¹⁷, le neurodegenerazioni legate all'età del sistema nervoso centrale come il morbo di Alzheimer¹⁸ e le neuropatie ottiche come il glaucoma¹⁹, una tecnica di visualizzazione in vivo non invasiva ed economica è molto vantaggiosa.

La capillaroscopia è stata utilizzata per valutare la microvascolarizzazione della piega ungueale in modelli animali, tra cui cavie²⁰ e topi²¹, dimostrando così la sua capacità come strumento di imaging non invasivo. Qui, applichiamo la capillaroscopia a una parte diversa dell'unghia, il letto ungueale. Sfruttando la trasparenza dell'unghia del topo, la capillaroscopia del letto ungueale introduce una nuova posizione per la visualizzazione della microvascolarizzazione periferica. Rispetto alla NFC, che è particolarmente utile per il monitoraggio del movimento delle cellule del sangue^21,22, il protocollo di capillaroscopia a letto ungueale qui descritto fornisce un'area più ampia per una migliore osservazione della morfologia e della struttura microvascolare. Forniamo un protocollo che consente ai ricercatori di valutare in modo semplice ed economico la morfologia della microvascolarizzazione del letto ungueale di topo, che è una nuova posizione per l'imaging vascolare periferico non invasivo. Questo protocollo fornisce immagini rappresentative della tipica architettura microvascolare del letto ungueale nei topi wild-type utilizzando due ceppi di laboratorio comunemente usati (SV129/S6 e C57/B6J). Dimostriamo che la capillaroscopia ungueale è una modalità di imaging microvascolare economica e non invasiva. Ulteriori studi che utilizzano questo metodo esplorativo saranno essenziali per applicare la capillaroscopia del letto ungueale a un'ampia gamma di modelli murini di malattia in cui le anomalie microvascolari periferiche sono evidenti in patologia.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Vanderbilt University Medical Center e del Massachusetts General Hospital.

1. Preparazione delle unghie dei topi per l'imaging

NOTA: Per una chiarezza ottimale dei vasi e il recupero della pelle, attendere almeno 24 ore prima dell'imaging.

1. Per consentire l'imaging senza ostacoli dei letti ungueali dei topi, rimuovere il pelo dalle zampe dei roditori almeno 24 ore prima dell'imaging capillaroscopia (Figura 1A). Per rimuovere il pelo dalle zampe del topo, segui i passaggi 1.1.1-1.1.6.
   1. Sedare l'animale utilizzando l'anestesia con isoflurano per via inalatoria (2% di isoflurano in 5% di anidride carbonica/95% di ossigeno). Verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato pizzicando il poggiapiedi su entrambe le zampe posteriori. Se adeguatamente anestetizzato, non dovrebbero esserci movimenti a scatti (riflesso di ritiro del pedale). Se c'è un movimento riflesso, lasciare che il topo abbia più tempo sotto isoflurano per diventare completamente anestetizzato. Ritestare il riflesso di ritiro del pedale e continuare.
   2. Dopo che il topo è stato adeguatamente anestetizzato, applicare un gel lubrificante per gli occhi o un unguento oftalmico sterile non medicato su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea durante l'anestesia.
   3. Mantenendo l'animale sotto anestesia utilizzando un cono nasale, applicare una generosa quantità di crema depilatoria su tutta la zampa utilizzando un applicatore. Fare attenzione a coprire l'intera area della zampa e del letto ungueale, come mostrato nella Figura 1B.
   4. Lasciare la crema depilatoria sulla zampa per 2 minuti a temperatura ambiente (RT).
   5. Pulire accuratamente la crema depilatoria strofinandola delicatamente con un fazzoletto pulito.
   6. Lavare la zampa in acqua tiepida e sterile.
      NOTA: Le zampe devono essere prive di pelo e le unghie non devono essere ostruite per l'imaging, come mostrato nella Figura 1C.
   7. Rimetti il topo nella sua gabbia per garantire un recupero sicuro dall'anestesia. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza. Una volta che il topo ha ripreso conoscenza, rimettilo nella gabbia originale con la compagnia di altri animali.

2. Imaging della capillaroscopia del letto ungueale in vivo

1. Dopo un tempo di recupero minimo di 24 ore dopo la rimozione del pelo, installare l'apparecchiatura per capillaroscopia in una stanza a temperatura controllata (mantenuta tra 21,5-22,5 °C), come mostrato nella Figura 2A. La configurazione completa per l'imaging del letto ungueale include 1) apparecchiature per anestesia con isoflurano, 2) un cono nasale per anestesia, 3) un tavolino per animali regolabile, 4) un microscopio per capillaroscopia e 5) un laptop con software video per l'imaging.
2. Sedare l'animale utilizzando l'anestesia con isoflurano per via inalatoria (2% di isoflurano in 5% di anidride carbonica/95% di ossigeno).
   1. Verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato pizzicando il poggiapiedi su entrambe le zampe posteriori. Se adeguatamente anestetizzato, non dovrebbero esserci movimenti a scatti (riflesso di ritiro del pedale). Se c'è un movimento riflesso, tornare al passaggio 1.1.1 e lasciare che il mouse abbia più tempo per essere completamente anestetizzato. Quindi, ripetere il test per il riflesso di ritiro del pedale e continuare.
   2. Dopo che il topo è stato adeguatamente anestetizzato, applicare un gel lubrificante per gli occhi o un unguento oftalmico sterile non medicato su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea durante l'anestesia.
3. Mantenendo l'animale sotto sedazione, posizionare la zampa posteriore con il lato volare rivolto verso l'alto sopra la piattaforma del nastro da laboratorio sotto l'obiettivo, come mostrato nella Figura 2B, zoom.
4. Allargare delicatamente le dita dei piedi per separare le unghie sotto l'obiettivo del microscopio utilizzando un applicatore. Assicurarsi che i letti ungueali siano separati l'uno dall'altro per un'imaging ottimale dei vasi.
   NOTA: La Figura 2C mostra la configurazione completa dell'imaging che mostra l'immagine dell'imbarcazione sul software video del laptop.
5. Per ridurre l'abbagliamento e migliorare la messa a fuoco, applicare generosamente olio da immersione (olio di mais) sulla zampa, garantendo una copertura completa delle unghie. Aggiungere del nastro adesivo bianco o simile sotto la zampa del mouse per aumentare il contrasto e migliorare la visualizzazione del letto del vaso (Figura 3; freccia 3).
6. Concentrati sull'unghia sul secondo dito della zampa posteriore; Nei topi, questo è l'unghia più grande e più facile da immaginare. Per mettere a fuoco l'unghia del mouse, utilizzare i regolatori del tavolino x e y (Figura 3; freccia 4) e la rotella di ingrandimento (fino a 280x su questo strumento; Figura 3; freccia 1).
7. Ruotare l'obiettivo per ridurre il posizionamento dell'abbagliamento per portare in vista la rete del vaso ungueale (Figura 3; freccia 2).
   NOTA: Se i recipienti diventano difficili da vedere o il tempo di imaging si allunga, riapplicare generosamente l'olio da immersione. Le zampe dei topi sono più piccole delle zampe posteriori; Pertanto, si consiglia di eseguire l'imaging sulle zampe posteriori.
8. Collegare il capillaroscopio a un computer portatile tramite una connessione USB (Universal Serial Bus).
9. Apri l'applicazione software video Debut sul laptop.
   NOTA: Verificare che il dispositivo sia collegato correttamente al laptop nelle impostazioni.
10. Sullo schermo del laptop, visualizza ciò che viene ingrandito dal capillaroscopio e concentrati sul letto ungueale regolando i regolatori del tavolino x e y e la rotella di ingrandimento per ottenere un'immagine chiara.
11. Una volta che il microscopio è stato messo a fuoco e si vede un'immagine chiara della rete di vasi nel letto ungueale, registrare un video premendo il pulsante rosso di registrazione in Debut o in un programma software video simile (Figura 2C).
12. Salva ogni video nella cartella del progetto appropriata ed etichetta ogni video di conseguenza.

3. Salvataggio delle immagini del letto ungueale

1. Apri il video del letto ungueale nel software e scegli manualmente un fotogramma nel video in cui i vasi sono chiaramente a fuoco.
2. Utilizzando lo strumento Screenshot sul computer, fai uno screenshot della schermata video di debutto che mostra una chiara vascolarizzazione nell'unghia. Salva immagine.
3. Aprire l'immagine dello screenshot nel software ImageJ facendo clic su File e Apri; Selezionare il file dalla cartella di destinazione.
4. Se necessario, regolare la luminosità e il contrasto selezionando Immagine > Regola > luminosità/contrasto. Questo strumento può aiutare a modificare il contrasto delle immagini per visualizzare meglio la morfologia del vaso.
5. Una volta regolata l'immagine, fare clic su Imposta nello strumento Luminosità/Contrasto .
6. Salva l'immagine come file TIFF facendo clic su File e poi su Salva con nome.

Utilizzando il metodo di capillaroscopia qui descritto, la morfologia vascolare del letto ungueale può essere facilmente visualizzata, come mostrato nella Figura 4A. La tipica vascolarizzazione del letto ungueale in un topo mostra tre caratteristiche coerenti, come evidenziato nella Figura 4B: ogni letto ungueale ha 1) un vaso afferente, 2) un vaso efferente e 3) una rete di capillari che collegano sia i vasi afferenti che quelli efferenti. Per dimostrare la coerenza della morfologia del letto ungueale, mostriamo nella Figura 4C una rete capillare rappresentativa del letto ungueale in un topo wild-type su uno sfondo SV129/S6 e nella Figura 4D un topo wild-type su uno sfondo C57/B6J.

Figura 1: Preparazione delle unghie per l'imaging capillaroscopia. (A) Esempio di zampa di topo con frecce che illustrano la pelliccia che oscura le unghie. (B) Applicazione di crema depilatoria - applicare generosamente sulla zampa posteriore del topo, avendo cura di coprire l'intera zampa. (C) Esempio zampa del mouse dopo la depilazione; Nota - Le unghie non sono più ostruite dal pelo e sono pronte per l'imaging in 24 ore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione della capillaroscopia. (A) Fotografia dell'apparecchiatura per capillaroscopia che mostra la configurazione completa per l'imaging del letto ungueale: (1) apparecchiatura per anestesia con isoflurano, (2) cono per anestesia, (3) tavolino regolabile per animali, (4) microscopio per capillaroscopia e (5) laptop con software video per l'imaging. (B) Esempio di posizionamento del mouse per la procedura; Il topo viene tenuto sotto sedazione dal cono del naso e il piede posteriore viene posizionato con il lato volare rivolto verso l'alto per l'imaging sotto l'obiettivo (vedi zoom). (C) Configurazione completa dell'imaging che mostra l'immagine dell'imbarcazione sul software video del laptop. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Regolazione del capillaroscopio e suggerimenti. Fotografia dell'apparecchiatura per capillaroscopia per illustrare le opzioni regolabili per migliorare la qualità dell'immagine. (1) Utilizzare la manopola per regolare la posizione z per portare l'obiettivo verso l'unghia del mouse, (2) ruotare l'obiettivo per regolare la quantità di abbagliamento della luce sulle unghie, (3) applicare nastro da laboratorio bianco o colorato per massimizzare il contrasto per una migliore visualizzazione della rete vascolare, (4) utilizzare la regolazione dello stadio x e y del microscopio capillaroscopia per il posizionamento degli animali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Morfologia tipica della vascolarizzazione del letto ungueale nei topi. (A) Esempio di immagine del letto ungueale di topo acquisita mediante capillaroscopia e (B) la morfologia tipica del letto ungueale è costituita da tre elementi: 1) un vaso afferente, 2) un vaso efferente e 3) una rete capillare che esiste tra gli elementi 1 e 2. La morfologia del letto ungueale rimane coerente tra i ceppi di topi wild-type, compresi i topi su uno sfondo (C) SV129/S6 e (D) C57/B6J. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In sintesi, forniamo un protocollo che consente ai ricercatori di valutare in modo semplice ed economico la morfologia della microvascolarizzazione del letto ungueale di topo, una nuova posizione per l'imaging vascolare periferico non invasivo. Come i metodi NFC utilizzati nelle cavie²⁰ e nei topi²¹, il principale punto di forza del protocollo qui descritto è che consente una valutazione rapida e non invasiva della microvascolarizzazione periferica in modelli murini di malattia. Ciò potrebbe essere particolarmente utile per gli studi che coinvolgono anomalie vascolari periferiche, come le malattie reumatiche ^2,3 e le malattie endocrine tra cui l'ipertensione e il diabete mellito ^7,8.

Sfruttando la trasparenza dell'unghia del topo, la capillaroscopia del letto ungueale introduce una nuova posizione per la visualizzazione della microvascolarizzazione periferica. Rispetto alla NFC, che è particolarmente utile per il monitoraggio del movimento delle cellule del sangue^21,22, il protocollo di capillaroscopia a letto ungueale qui descritto fornisce un'area più ampia per una migliore osservazione della morfologia e della struttura microvascolare.

Per garantire un imaging ottimale, si consiglia di prestare attenzione ai passaggi che preparano l'unghia per l'imaging. Un'efficace depilazione è fondamentale per il successo dell'imaging del letto ungueale; I capelli che oscurano l'unghia porteranno al fallimento dell'imaging. Si consiglia inoltre di completare la depilazione almeno 24 ore prima dell'imaging; Questo per consentire la risoluzione di qualsiasi irritazione dovuta alla procedura di depilazione. Per limitare la variabilità che può verificarsi nell'utilizzo di questo metodo, si consiglia di utilizzare il secondo dito della zampa posteriore per l'imaging a causa delle sue dimensioni maggiori. Ciò mantiene anche la coerenza tra gli animali. Inoltre, l'abbondante applicazione di olio da immersione aiuta a migliorare la risoluzione delle piccole reti capillari del letto ungueale. Infine, l'applicazione di nastro da laboratorio adeguatamente colorato sotto l'unghia prima dell'imaging migliora anche il contrasto per la visualizzazione dei vasi.

Nonostante l'efficacia della tecnica nel risolvere la morfologia grossolana dei vasi ungueali, ci sono alcune limitazioni alla tecnica come descritto qui. A causa della natura dell'interfaccia di imaging e delle dimensioni dei vasi, la risoluzione del flusso sanguigno o la velocità delle cellule del sangue non è possibile utilizzando questo protocollo. Ulteriori lavori di ottimizzazione dell'acquisizione delle immagini dei vasi sanguigni potrebbero consentire in futuro approcci automatizzati di analisi delle immagini, che sarebbero preziosi per caratterizzare ulteriormente le caratteristiche microvascolari periferiche. In secondo luogo, il protocollo descritto richiede l'anestesia dei topi per acquisire immagini del letto ungueale. L'anestesia modifica la morfologia dei microvasi per lunghi periodi di tempo (dopo 65 minuti)²³. Sebbene il tempo in anestesia sia notevolmente più breve utilizzando questo metodo, i ricercatori dovrebbero essere consapevoli del tempo impiegato per completare la procedura da topo a topo per garantire la coerenza e ridurre la variabilità dei dati raccolti.

L'imaging dei vasi periferici è spesso invasivo e costoso^12,13; Tuttavia, il protocollo qui descritto aiuta a superare queste limitazioni per consentire la visualizzazione della morfologia dei vasi periferici in modo rapido, economico e semplice. In conclusione, il metodo esplorativo descritto in questo protocollo potrebbe essere implementato in studi futuri che mirano a caratterizzare le anomalie morfologiche nel letto ungueale del topo in modelli di malattia vascolare periferica.

Estraneo a questo lavoro, il Dr. Pasquale è stato un consulente retribuito di Twenty Twenty. Non correlata a questo lavoro, Clara Cousins è una consulente retribuita di Cartography Biosciences. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato finanziato da fondi dipartimentali illimitati assegnati a Lauren K. Wareham. Il Dr. Pasquale è supportato da The Glaucoma Foundation (NYC) e da una sovvenzione illimitata di Research to Prevent Blindness (NYC).