Ex vivo Organogenez Sırasında Primer Siliyogenezi İncelemek için Organoidlerin Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Kök hücre kaynaklı organoidler, memeli dokularında organogenez sırasında kök hücrenin kendini yenilemesini ve farklılaşmasını düzenleyen moleküler ve hücresel süreçlerin analizini kolaylaştırır. Burada, fare meme organoidlerinde birincil silyumun biyolojisinin analizi için bir protokol sunuyoruz.

Organoidler, organların karmaşık mimarisini ve fizyolojisini ex vivo olarak yeniden üreten kök hücreden türetilmiş üç boyutlu yapılardır. Bu nedenle, organoidler, birincil siliogenez ve siliyer sinyalleme dahil olmak üzere memelilerde kök hücre kendini yenilemesini ve farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaları incelemek için yararlı modelleri temsil eder. Primer siliogenez, çeşitli dokularda kök hücrenin kendini yenilemesini ve/veya farklılaşmasını kontrol eden önemli bir hücre sinyal merkezi olan primer silyumun dinamik bir araya getirilmesi sürecidir. Burada, ışık tabakası mikroskobu için tam montajlı fare meme organoidlerinde hücre soyunun ve birincil kirpik belirteçlerinin immünofloresan boyaması için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Organoidlerde primer silyum montajının ve uzunluğunun kantitatif analizi için mikroskopi görüntüleme yöntemini ve bir görüntü işleme tekniğini tarif ediyoruz. Bu protokol, tek hücre düzeyinde karmaşık üç boyutlu yapılarda birincil kirpiklerin hassas bir şekilde analiz edilmesini sağlar. Bu yöntem, sağlık ve hastalıkta birincil silyumun biyolojisini incelemek için normal ve genetik olarak değiştirilmiş kök hücrelerden, sağlıklı ve patolojik dokulardan türetilen meme organoidlerinde immünofloresan boyama ve primer kirpiklerin ve siliyer sinyallemenin görüntülenmesi için geçerlidir.

Çok hücreli organizmaların gelişimi ve yetişkin dokularında homeostazın sürdürülmesi, zaman ve mekanda normal doku gelişimi ve rejenerasyonunu düzenleyen kök hücrelerin kendini yenilemesi ve farklılaşması arasında ince ayarlı bir düzenlemede bulunur¹. Bu düzenlemenin bozulması gelişimsel anomalilere ve kanserlere neden olmaktadır². Bu nedenle, kök hücrenin kendini yenilemesini ve farklılaşmasını düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak, gelişimsel ve kanser biyolojisinde kilit öneme sahiptir.

Doku kök hücrelerinin üç boyutlu organoidler oluşturduğu ex vivo organogenez yöntemlerinin son gelişimi, memeli organogenezi ve bir tabakta doku homeostazının sürdürülmesi sırasında kök hücrelerin dinamiklerini inceleme yeteneklerimizi dönüştürmüştür³. Organoidler, bu süreçleri incelemek için hantal genetik olarak değiştirilmiş hayvan modellerine iyi bir alternatif sunar. İnce bağırsak ve kolon, mide, karaciğer, pankreas, prostat ve meme bezi³ dahil olmak üzere birçok organın doku kök hücrelerinden organoidlerin geliştirilmesi için protokoller geliştirilmiştir³. Ek olarak, organoid oluşturan kök hücrelerde somatik genom düzenleme tekniklerinin geliştirilmesi, biyolojilerini kontrol eden moleküler ve hücresel mekanizmaların hızlı bir şekilde sorgulanmasını sağlar ^4,5.

Birincil silyum, çeşitli dokuların kök ve/veya farklılaşmış hücrelerinin yüzeyine monte edilen mikrotübül bazlı bir yapıdır⁶. Genellikle hareketsizdir ve hücre^{başına tek} bir yapı olarak monte edilir 7. Birincil siliyogenez, birincil silyum^7'nin bir araya getirilmesinin dinamik sürecidir. Hücre yüzeyinde, silyum bir hücre sinyal platformu⁸ görevi görür. Bu nedenle, birincil silyumun, diğerleri arasında beyin ^9,10, meme bezi ^4,11, yağ dokusu¹² ve koku alma epiteli¹³ dahil olmak üzere birçok dokuda kök hücrenin kendini yenilemesi ve/veya farklılaşmasının anahtar düzenleyicisi olarak hareket ettiği düşünülmektedir. Birincil siliogenez ve/veya siliyer sinyalleme, farklı hücre soylarında ve farklı gelişim aşamalarında dinamik olarak düzenlenir ^4,13,14, ancak altta yatan mekanizmalar büyük ölçüde belirlenmeye devam etmektedir.

Ex vivo organogenez, birincil siliogenez ve siliyer sinyalleme dahil olmak üzere kök hücre biyolojisini kontrol eden moleküler ve hücresel mekanizmalar hakkında temel bilgilerin geliştirilmesi için umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, tüm mount organoidleri tek hücre düzeyinde ve hücre altı ölçeklerde düzgün bir şekilde görüntüleme yeteneğine dayanır. Yakın zamanda, birincil kirpiklerin fare meme kök hücresi organoid oluşturma kapasitesini pozitif olarak kontrol ettiğini göstermek için fare meme kök hücresinden türetilmiş bir organoid model kullandık⁴. Burada, üç boyutlu ex vivo organogenez sırasında ışık tabakası mikroskobu ile primer kirpiklerin analizini mümkün kılan, tüm mount fare meme organoidlerinin immünofloresan boyanması için kapsamlı bir protokol sunuyoruz (Şekil 1A,B). Son zamanlarda konfokal mikroskopi ile organoidlerin immünofloresan boyanması ve görüntülenmesi için alternatif yöntemler yayınlanmıştır^15,16. Bu protokol bunun yerine ışık tabakası mikroskobu ile organoidlerin hazırlanmasına ve görüntülenmesine odaklanır.

NOT: Aşağıdaki protokol, 96 oyuklu bir plakanın 5 oyuğunda büyütülen ve bir araya getirilen (> 100 organoid) organoidlerin boyanması için önerilir. Organoidler, fare meme kök hücrelerinden türetilmiştir. Donör fareler, Rennes Üniversitesi (Fransa) Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak barındırıldı ve ele alındı.

1. Reaktifler

1. Fiksatif çözeltiyi hazırlamak için,% 4'lük bir PFA çözeltisi oluşturmak için 125 μL %16 paraformaldehit (PFA) sulu ticari çözeltisini 375 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltin.
   DİKKAT: Kimyasal bir başlık altında toksik bir madde olan PFA'yı manipüle edin.
2. Geçirgenleştirme tamponunu hazırlamak için, %0,3'lük bir Triton X100 çözeltisi üretmek için 1,5 μL Triton X100'ü 500 μL PBS içinde seyreltin.
3. Bloke edici tamponu hazırlamak için,% 5'lik bir keçi serumu-% 0.1 Tween 20 çözeltisi oluşturmak için PBS'de 1.5 μL Tween-20 ve 75 μL normal keçi serumunu seyreltin.
4. Hafif levha montaj ortamını hazırlamak için, 1 g ultra saf düşük erime noktalı agarozu 65 °C'de 100 mL dH20 veya PBS içinde çözün. 1 mL alikot hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.

2. Organoidlerin geri kazanımı

1. Organoidleri kültür kuyucuklarından düşük bağlayıcı polimer 1.7 mL'lik bir tüpe aktarın, kuyucuklarda 3 kez yukarı ve aşağı pipetledikten sonra, ucu kesilmiş bir FBS kaplı uç ile (ekstremitenin minimum çapı 1.5 mm).
   NOT: Kaplama, organoidlerin uca yapışmasını önler. Düşük bağlayıcı polimer malzeme, tüm boyama prosedürü sırasında organoidlerin tüpün yan tarafına yapışmasını azaltmayı sağlar.
2. Tüpü PBS ile doldurun ve 3 dakika boyunca 350 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın.

3. Fiksasyon, geçirgenlik ve blokaj

1. Organoidleri 500 μL% 4 PFA'da yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 saniye boyunca 350 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın.
   NOT: Bu adımdan itibaren, tamponları organoid peletine dokunmadan basitçe ekleyerek farklı tamponlardaki organoidleri yeniden askıya alın. Tüm yıkama adımlarını oda sıcaklığında gerçekleştirin.
2. Organoidleri 1 mL PBS ile 3 dakika yıkayın. 30 saniye boyunca 350 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın.
   DURAKLAMA: Sabit organoidler PBS'de en az bir hafta boyunca 4 ° C'de tutulabilir.
3. Organoidleri 500 μL PBS-Triton X100 %0.3 içinde yeniden süspanse ederek geçirgen hale getirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Organoidleri 30 saniye boyunca 350 g'da döndürün.
4. Organoidleri 1 mL PBS ile tekrar süspanse ederek yıkayın ve 3 dakika inkübe edin. 30 saniye boyunca 350 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın. Bir kez tekrarlayın.
5. İsteğe bağlı: Organoidleri 500 μL buz gibi soğuk metanolde yeniden süspanse edin. - 20 °C'de 10 dakika inkübe edin. Bu adım, belirli sentrosomal belirteçlerin boyanması için gerekli olabilir.
6. İsteğe bağlı (5. adım gerçekleştirildiyse): Organoidleri 1 mL PBS ile 3 dakika yıkayın. 30 saniye boyunca 350 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın. Bir kez tekrarlayın.
7. Organoidlerdeki spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini 500 μL bloke edici tampon (PBS, %5 keçi serumu, %0.1 Tween 20) ile yeniden süspanse ederek bloke edin. Oda sıcaklığında 1 saat 30 dakika inkübe edin. 30 saniye boyunca 350 g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın.
8. Organoidleri 1 mL PBS ile tekrar süspanse ederek yıkayın ve 3 dakika inkübe edin. 30 saniye boyunca 350 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın.

4. Etiketleme

1. Organoidleri seyreltilmiş primer antikorlarla 200 μL bloke edici tampon ile yeniden süspanse edin ve gece boyunca 4 ° C'de hafif çalkalama ile (yatay bir çalkalayıcıda 60 rpm) inkübe edin. Tüpleri, çalkalayıcının yatay planı ile 45° açıyla yerleştirin. Boyama tamponundaki tüplerin altındaki organoidleri koruyacaktır.
2. Organoidleri 1 mL PBS ile tekrar süspanse ederek yıkayın ve 5 dakika inkübe edin. 30 saniye boyunca 350 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın. İki kez tekrarlayın.
   NOT: Son aşamadaki bazı organoidler tüpün yan tarafına yapışabilir, bu da santrifüjlemeden sonra süpernatantın aspirasyonu sırasında organoid kaybına neden olabilir, yıkama adımlarında PBS'ye% 0.2 (a / h) sığır serum albümini (BSA) eklenmesi organoid kaybını azaltabilir.
3. Organoidleri ikincil antikorlarla 200 μL bloke edici tampon ile yeniden süspanse edin ve hafif çalkalama ile 1 saat 30 dakika inkübe edin (yatay bir çalkalayıcıda 60 rpm). Tüpleri, çalkalayıcının yatay planı ile 45° açıyla yerleştirin. Boyama tamponundaki tüplerin altındaki organoidleri koruyacaktır.
   NOT: Hoechst (veya DAPI veya DRAQ5 gibi diğer nükleer boyalar) ikincil antikorlarla tampona eklenebilir.
4. Organoidleri 1 mL PBS ile tekrar süspanse ederek yıkayın ve 5 dakika inkübe edin. 30 saniye boyunca 350 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın. İki kez tekrarlayın.
   NOT: Son aşamadaki bazı organoidler tüpün yan tarafına yapışabilir, bu da santrifüjlemeden sonra süpernatantın aspirasyonu sırasında organoid kaybına neden olabilir, yıkama adımlarında PBS'ye% 0.2 (a / h) BSA eklenmesi organoid kaybını azaltabilir.

5. Görüntüleme için agaroz örneğinin hazırlanması

1. Hafif levha montaj ortamını 65 °C'de inkübe ederek eritin. Ortam eridikten sonra 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
2. Organoidleri 200 μL'lik bir uç kullanarak 100 μL'lik bir montaj ortamında yeniden süspanse edin, ucun ekstremitesi kesildi (ekstremitenin minimum boyutu: 1,5 mm), iki kez yukarı ve aşağı pipetleyerek.
3. Montaj ortamını organoidlerle birlikte bir cam kılcal damarda (yeşil kılcal, iç çap: 1,5 mm) bir piston kullanarak emdirin. Montaj ortamının katılaşması için kılcal damarı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   DURAKLAMA: Kılcal damarlar, görüntülemeden önce bir hafta boyunca PBS'de 4 °C'de saklanabilir.

6. Görüntüleme

1. Bir ışık tabakası mikroskobu (örneğin, ZEISS Lightsheet Z.1) kullanarak, organoidleri 20x veya 40x suya daldırma objektifi ile görüntüleyin.
   1. Cam kılcal damarı gözlem odasına yerleştirin. Ön kamera ile kılcal damarı bulun ve cam kılcal damarın ucunu algılama hedefinin üst sınırına yerleştirin.
   2. Örneği seçin ve parlak alan aydınlatmasında cam kılcal damarın ucunu kullanarak en uygun odağı ayarlayın. Agaroz örneğini kılcal damardan yavaşça dışarı itin ve katılaşmış agaroz içindeki organoidleri bulun.
   3. PBS'deki agaroz örneğinin hareketlerini azaltmak için görüntülenecek organoidleri kılcal damarın ucuna yakın tutun. Optimum örnek yönünü ayarlamak ve istenen yakınlaştırmayı tanımlamak için kılcal damarı döndürün.
   4. Alım modunu seçin. Görüntülenecek kanalları tanımlayın, ışık tabakasının uygun yönlerini ayarlayın, her kanal için lazer gücünü ayarlayın (foto ağartmayı azaltmak için, düşük lazer gücü kullanın), görüntünün boyutunu ve istenen aydınlatma tarafını (taraflarını) ayarlayın. Görüntüleme parametrelerine örnek: Görüntü boyutu 1920 x 1920, aydınlatma: çift taraflı.
   5. Z yığını modülünü kullanarak yığının Z uçlarını ayarlayarak Z yığınını görüntüye tanımlayın ve Z adımı boyutunu en uygun olarak ayarlayın.
2. Numunede gezinmek, bir Z-projeksiyonu ve 3D gösterim elde etmek için mikroskop yazılımının görüntü işleme modülünü kullanarak çıktı dosyasını işleyin.
3. Numuneyi çevirin ve farklı bir açıdan yeni bir görüntü elde edin veya diğer organoidleri görüntüleyin.
4. (i) numunenin 3D olarak görselleştirilmesini (ii) nesnelerin segmentasyonunu (iii) nesnelerin tanımlanmasını ve kantitatif analizini sağlayan etkileşimli bir mikroskopi görüntü analiz yazılımı (örneğin, Imaris) ile görüntüleri analiz edin.

Ex vivo organogenez yöntemleri, memeli doku gelişimini ve bir tabaktaki doku homeostazının sürdürülmesini incelemek için yeteneklerimizi dönüştürüyor. Birincil siliogenez ve siliyer sinyalleme dahil olmak üzere bu süreçleri düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların analizi, organoidleri üç boyutlu olarak görüntüleme yeteneğine dayanır.

Yukarıda açıklanan protokol, tam montajlı meme organoidlerinin boyanmasını sa?...

Burada sunulan ayrıntılı protokol, yarı katı ortamda büyüyen fare meme organoidlerinin boyanmasını ve görüntülenmesini sağlar. Bu protokol muhtemelen yarı katı ve katı ortamlarda büyüyen çeşitli dokuların mimarisini taklit eden organoidlerin boyanması için geçerlidir. Üstte orta olan% 100 Matrigel içinde büyüyen organoidler için, iyileşme ve fiksasyon adımları biraz farklıdır. Kültür ortamı kültürden iyi bir şekilde uzaklaştırılmalıdır. Hızl?...

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Işık tabakası mikroskobunun geliştirilmesindeki yardımı için Xavier Pinson'a teşekkür ederiz; MRic, Arche, Flow sitometri çekirdek tesisleri ve teknik destek içinMicroPICell çekirdek tesisi de dahil olmak üzere SFR Sant é F. Bonamy dahil olmak üzere Biosit biyoteknoloji merkezi . Bu çalışma Fondation ARC, Cancéropôle Grand Ouest, Université de Rennes 1, Fondation de France tarafından desteklenmiştir. MD, Rennes Üniversitesi'nden bir Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklendi. V.J.G., Fondation ARC'den Doktora Sonrası Bursu ile desteklenmiştir.