체외 유기형성 중 1차 섬모형성을 연구하기 위한 오가노이드의 3차원 이미징

줄기세포 유래 오가노이드는 포유류 조직에서 기관형성 중 줄기세포의 자가 재생과 분화를 조절하는 분자 및 세포 과정의 분석을 용이하게 합니다. 여기에서는 마우스 유방 오가노이드에서 일차 섬모의 생물학 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

오가노이드는 줄기세포에서 파생된 3차원 구조로, 장기의 복잡한 구조와 생리학을 체외 에서 재현합니다. 따라서 오가노이드는 원발성 섬모 형성 및 섬모 신호 전달을 포함하여 포유류의 줄기세포 자가 재생 및 분화를 제어하는 메커니즘을 연구하는 데 유용한 모델을 나타냅니다. 원발성 섬모형성(primary ciliogenesis)은 줄기세포의 자가 재생 및/또는 다양한 조직의 분화를 조절하는 핵심 세포 신호 센터인 원발성 섬모(primary ciliogenesis)를 조립하는 역동적인 과정입니다. 여기에서는 광시트 현미경 검사를 위해 전체 마운트 마우스 유방 오가노이드에서 세포 계통 및 1차 섬모 마커의 면역 형광 염색을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 우리는 오가노이드의 1차 섬모 조립 및 길이의 정량 분석을 위한 현미경 이미징 방법과 이미지 처리 기술에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 복잡한 3차원 구조의 1차 섬모를 정밀하게 분석할 수 있습니다. 이 방법은 건강 및 질병에서 1차 섬모의 생물학을 연구하기 위해 건강한 병리학적 조직에서 정상 및 유전자 변형 줄기세포에서 유래한 유방 오가노이드에서 원발성 섬모 및 섬모 신호의 면역형광 염색 및 이미징에 적용할 수 있습니다.

다세포 유기체의 발달과 성체 조직의 항상성 유지는 자가 재생과 줄기 세포의 분화 사이의 미세하게 조정된 조절에 달려 있으며, 줄기 세포는 시간과 공간에서 정상 조직의 발달과 재생을 조율합니다¹. 이 규정의 전복은 발달 기형과 암을 유발한다². 따라서 줄기세포의 자가 재생과 분화를 조율하는 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것은 발달 및 암 생물학의 주요 관심사입니다.

최근 조직 줄기세포가 3차원 오가노이드를 생성하는 체외 유기형성 방법의 개발로 인해 포유류의 유기형성 및 접시 내 조직 항상성 유지 중 줄기세포의 역학을 연구할 수 있는 능력이 향상되었습니다³. 오가노이드는 이러한 과정을 연구하기 위한 번거로운 유전자 변형 동물 모델에 대한 좋은 대안입니다. 소장과 결장, 위, 간, 췌장, 전립선, 유선^{3을 포함한} 많은 기관의 조직 줄기세포에서 오가노이드를 개발하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다³. 또한, 오가노이드 형성 줄기세포에서 체세포 게놈 편집 기술의 개발로 이제 생물학을 제어하는 분자 및 세포 메커니즘을 신속하게 조사할 수 있게 되었습니다 ^4,5.

일차 섬모는 줄기 및/또는 다양한 조직의 분화된 세포 표면에 조립된 미세소관 기반 구조입니다⁶. 일반적으로 비운동성이며 셀당 단일 구조로 조립됩니다⁽⁷). 1차 섬모 형성은 1차 섬모를 조립하는 역동적인 과정입니다⁷. 세포 표면에서, 섬모는 세포 신호 전달 플랫폼(cell signaling platform)으로 작용한다⁽⁸). 따라서, 일차 섬모는 뇌^9,10, 유선(^4,11), 지방 조직^(adipose tection) 12^, 후각 상피(olfactory epithelium^{) 13} 등을 포함한 많은 조직에서 줄기세포 자가 재생 및/또는 분화의 핵심 조절자로 작용하는 것으로 생각됩니다. 원발성 섬모 형성 및/또는 섬모 신호전달은 별개의 세포 계통과 다른^{발달 단계에서 동적으로} 조절되지만^4,13,14 기본 메커니즘은 크게 결정되지 않았습니다.

생체 외 기관 형성은 원발성 섬모 형성 및 섬모 신호 전달을 포함하여 줄기 세포 생물학을 제어하는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 기본 지식 개발에 대한 가능성을 보여줍니다. 그러나 이는 단일 세포 수준과 하위 세포 규모에서 전체 마운트 오가노이드를 적절하게 이미지화할 수 있는 능력에 의존합니다. 우리는 최근 마우스 유방 줄기 세포 유래 오가노이드 모델을 사용하여 원발성 섬모가 마우스 유방 줄기 세포 오가노이드 형성 능력을 긍정적으로 조절한다는 것을 보여주었습니다⁴. 여기에서는 전체 마운트 마우스 유방 오가노이드의 면역형광 염색을 위한 포괄적인 프로토콜(그림 1A, B)을 제시하며, 이를 통해 체외 기관 형성 중 3차원에서 광시트 현미경을 통해 원발성 섬모를 분석할 수 있습니다. 컨포칼 현미경을 통한 오가노이드의 면역형광 염색 및 이미징을 위한 대체 방법이 최근에 발표되었습니다^15,16. 대신 이 프로토콜은 광시트 현미경을 통한 오가노이드의 준비 및 이미징에 중점을 둡니다.

참고: 아래 프로토콜은 96웰 플레이트의 5웰에서 성장하고 함께 풀링된 오가노이드(> 100 오가노이드)의 염색에 권장됩니다. 오가노이드는 마우스 유방 줄기 세포에서 유래했습니다. 기증자 마우스는 프랑스 렌 대학(University of Rennes)의 동물 관리 위원회(Animal Care Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수용 및 처리되었습니다.

1. 시약

1. 정착액을 준비하기 위해 125μL의 16% 파라포름알데히드(PFA) 수용액을 375μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석하여 4% PFA 용액을 생성합니다.
   주의: 화학 물질 후드 아래에서 독성 물질인 PFA를 조작하십시오.
2. 투과화 완충액을 준비하기 위해 1.5μL의 Triton X100을 500μL의 PBS에 희석하여 0.3% Triton X100 용액을 생성합니다.
3. 블로킹 완충액을 준비하기 위해 PBS에 1.5μL의 Tween-20 및 75μL의 일반 염소 혈청을 희석하여 5% 염소 혈청-0.1% Tween 20 용액을 생성합니다.
4. 광시트 장착 매체를 준비하려면 65°C에서 100mL의 dH20 또는 PBS에 1g의 초순수 저융점 아가로스를 용해합니다. 1mL의 부분 표본을 준비하고 실온에서 보관합니다.

2. 오가노이드 회수

1. 배양 웰에서 오가노이드를 저결합 폴리머 1.7mL 튜브로 옮기고, 말단을 절단한 FBS 코팅 팁(말단의 최소 직경 1.5mm)을 사용하여 웰에서 위아래로 3회 피펫팅한 후 오가노이드를 옮깁니다.
   참고: 코팅은 오가노이드가 팁에 달라붙는 것을 방지합니다. 결합이 낮은 폴리머 소재는 전체 염색 절차 동안 튜브 측면에 오가노이드가 부착되는 것을 줄일 수 있습니다.
2. 튜브에 PBS를 채우고 350 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다.

3. 정착, 투과화 및 막기

1. 오가노이드를 500μL의 4% PFA에 재현탁합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다. 350 x g 에서 30초 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다.
   참고: 이 단계부터는 오가노이드를 건드리지 않고 오가노이드 펠릿에 버퍼를 추가하기만 하면 다른 버퍼에 오가노이드를 다시 현탁시킵니다. 모든 세척 단계를 실온에서 수행하십시오.
2. 오가노이드를 PBS 1mL로 3분 동안 세척합니다. 350 x g 에서 30초 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다.
   일시 중지: 고정 오가노이드는 최소 일주일 동안 4°C의 PBS에 보관할 수 있습니다.
3. 오가노이드를 500μL의 PBS-Triton X100 0.3%에 재현탁시켜 투과하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 오가노이드를 350g에서 30초 동안 스핀다운합니다.
4. 오가노이드를 PBS 1mL로 재현탁하여 세척하고 3분 동안 배양합니다. 350 x g 에서 30초 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다. 한 번 반복합니다.
5. 선택 사항: 오가노이드를 500μL의 얼음처럼 차가운 메탄올에 재현탁합니다. -20 °C에서 10분 동안 배양합니다. 이 단계는 특정 centrosomal marker의 염색에 필요할 수 있습니다.
6. 선택 사항(5단계를 수행한 경우): 오가노이드를 PBS 1mL로 3분 동안 세척합니다. 350 x g 에서 30초 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다. 한 번 반복합니다.
7. 오가노이드의 비특이적 항체 결합 부위를 500μL의 차단 완충액(PBS, 5% 염소 혈청, 0.1% Tween 20)으로 재현탁하여 차단합니다. 실온에서 1시간 30분 동안 배양합니다. 350g에서 30초 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다.
8. 오가노이드를 PBS 1mL로 재현탁하여 세척하고 3분 동안 배양합니다. 350 x g 에서 30초 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다.

4. 라벨링

1. 희석된 1차 항체와 함께 200μL의 차단 완충액으로 오가노이드를 재현탁하고 4°C에서 약한 진탕(수평 쉐이커에서 60rpm)으로 밤새 배양합니다. 셰이커의 수평 평면과 45° 각도로 튜브를 놓습니다. 염색 완충액의 튜브 바닥에 있는 오가노이드를 유지합니다.
2. 오가노이드를 PBS 1mL로 재현탁하여 세척하고 5분 동안 배양합니다. 350 x g 에서 30초 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다. 두 번 반복합니다.
   참고: 마지막 단계의 일부 오가노이드는 튜브 측면에 달라붙어 원심분리 후 상등액을 흡인하는 동안 오가노이드 손실을 초래할 수 있으며, 세척 단계에서 PBS에 0.2%(w/v)의 소 혈청 알부민(BSA)을 추가하면 오가노이드 손실을 줄일 수 있습니다.
3. 200μL의 차단 버퍼로 오가노이드를 2차 항체로 재현탁하고 가벼운 진탕(수평 쉐이커에서 60rpm)으로 1시간 30분 동안 배양합니다. 셰이커의 수평 평면과 45° 각도로 튜브를 놓습니다. 염색 완충액의 튜브 바닥에 있는 오가노이드를 유지합니다.
   참고: Hoechst(또는 DAPI 또는 DRAQ5와 같은 기타 핵 염료)를 2차 항체와 함께 완충액에 첨가할 수 있습니다.
4. 오가노이드를 PBS 1mL로 재현탁하여 세척하고 5분 동안 배양합니다. 350 x g 에서 30초 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거합니다. 두 번 반복합니다.
   참고: 마지막 단계의 일부 오가노이드는 튜브 측면에 달라붙어 원심분리 후 상등액을 흡인하는 동안 오가노이드 손실이 발생할 수 있으며, 세척 단계에서 PBS에 0.2%(w/v) BSA를 추가하면 오가노이드 손실을 줄일 수 있습니다.

5. 이미징을 위한 아가로스 샘플의 준비

1. 광시트 장착 매체를 65°C에서 배양하여 용융합니다. 배지가 녹으면 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
2. 위아래로 두 번 피펫팅하여 팁 끝부분을 절단한 상태에서 200μL 팁을 사용하여 100μL의 장착 매체에 오가노이드를 다시 현탁시킵니다(말단의 최소 크기: 1.5mm).
3. 플런저를 사용하여 유리 모세관(녹색 모세관, 내경: 1.5mm)에서 오가노이드와 함께 장착 매체를 빨아들입니다. 장착 매체가 응고될 때까지 실온에서 5분 동안 모세관을 배양합니다.
   일시 중지: 모세관은 이미징 전 일주일 동안 4°C의 PBS에 보관할 수 있습니다.

6. 이미징

1. 광시트 현미경(예: ZEISS Lightsheet Z.1)을 사용하여 20x 또는 40x 수침 대물렌즈로 오가노이드를 이미지화합니다.
   1. 유리 모세관을 관찰실에 놓습니다. 전면 카메라로 모세관을 찾고 유리 모세관의 끝을 감지 대물렌즈의 상한선에 놓습니다.
   2. 샘플을 선택하고 명시야 조명에서 유리 모세관의 팁을 사용하여 최적의 초점을 설정합니다. 모세관에서 아가로스 샘플을 천천히 밀어내고 응고된 아가로스 내에서 오가노이드를 찾습니다.
   3. 이미징할 오가노이드를 모세관 끝 가까이에 두어 PBS에서 아가로스 샘플의 움직임을 줄입니다. 캐필러리를 회전하여 최적의 샘플 방향을 설정하고 원하는 확대/축소를 정의합니다.
   4. 획득 모드를 선택합니다. 이미지화할 채널을 정의하고, 광 시트의 적절한 방향을 설정하고, 각 채널의 레이저 출력을 설정하고(광표백을 줄이기 위해, 낮은 레이저 출력을 사용), 이미지의 크기와 원하는 조명 면을 설정합니다. 이미징 매개변수의 예: 이미지 크기 1920 x 1920, 조명: 양면.
   5. Z-stack 모듈을 사용하여 스택의 Z-extremities를 설정하여 이미지화할 Z-stack을 정의하고 Z-step size를 optimal로 설정합니다.
2. 현미경 소프트웨어의 이미지 처리 모듈을 사용하여 출력 파일을 처리하여 샘플을 탐색하고 Z 투영 및 3D 표현을 얻습니다.
3. 샘플을 돌려 다른 각도에서 새로운 이미지를 획득하거나 다른 오가노이드를 이미지화합니다.
4. 대화형 현미경 이미지 분석 소프트웨어(예: Imaris)로 이미지를 분석하여 (i) 샘플을 3D로 시각화, (ii) 물체 세분화, (iii) 물체 식별 및 정량 분석을 가능하게 합니다.

체외 유기형성 방법은 포유류 조직 발달 및 접시 내 조직 항상성 유지를 연구하는 우리의 능력을 변화시키고 있습니다. 1차 섬모 형성 및 섬모 신호 전달을 포함하여 이러한 과정을 조절하는 분자 및 세포 메커니즘의 분석은 오가노이드를 3차원으로 이미지화하는 능력에 의존합니다.

위에서 설명한 프로토콜은 전체 마운트 유방 오가노이드의 ?...

여기에 제시된 자세한 프로토콜은 반고체 배지에서 성장하는 마우스 유방 오가노이드의 염색 및 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 반고체 및 고체 매체에서 자라는 다양한 조직의 구조를 모방한 오가노이드의 염색에 적용할 수 있을 것으로 예상됩니다. 배지가 위에 있는 100% 마트리겔에서 자라는 오가노이드의 경우 회복 및 고정 단계가 약간 다릅니다. 배양 배?...

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

광시트 현미경 개발에 도움을 준 Xavier Pinson에게 감사드립니다. MRic, Arche, 유세포 분석 핵심 시설 및MicroPICell 핵심 시설을 포함한 SFR Sant é F. Bonamy 를 포함한 Biosit 생명공학 센터, 기술 지원. 이 작업은 Fondation ARC, Cancéropôle Grand Ouest, Université de Rennes 1, Fondation de France의 지원을 받았습니다. M.D.는 렌 대학교(University of Rennes)의 대학원 펠로우십(Graduate Fellowship)의 지원을 받았습니다. V.J.G.는 Fondation ARC의 박사후 연구원의 지원을 받았습니다.