类器官的三维成像以研究 离体 器官发生过程中的原发性纤毛发生

干细胞衍生的类器官有助于分析分子和细胞过程，这些过程在哺乳动物组织的器官发生过程中调节干细胞的自我更新和分化。在这里，我们提出了一种用于分析小鼠乳腺类器官中初级纤毛生物学的方案。

类器官是干细胞衍生的三维结构，可在 体外 复制器官的复杂结构和生理学。因此，类器官是研究控制哺乳动物干细胞自我更新和分化机制的有用模型，包括初级纤毛发生和纤毛信号传导。初级纤毛发生是组装初级纤毛的动态过程，初级纤毛是控制干细胞自我更新和/或各种组织中分化的关键细胞信号传导中心。在这里，我们提出了一种全面的方案，用于全装小鼠乳腺类器官中细胞谱系和初级纤毛标志物的免疫荧光染色，用于光片显微镜检查。我们描述了用于定量分析类器官中初级纤毛组装和长度的显微镜成像方法和图像处理技术。该协议能够在单细胞水平上精确分析复杂三维结构中的初级纤毛。该方法适用于来源于正常和转基因干细胞、健康和病理组织的乳腺类器官中初级纤毛和纤毛信号传导的免疫荧光染色和成像，以研究初级纤毛在健康和疾病中的生物学。

多细胞生物的发育和成体组织中体内平衡的维持存在于干细胞的自我更新和分化之间的微调调节中，干细胞在时间和空间上协调正常的组织发育和再生¹。颠覆这一规定会导致发育异常和癌症².因此，了解协调干细胞自我更新和分化的分子和细胞机制是发育和癌症生物学的关键兴趣。

最近开发的离体器官发生方法，其中组织干细胞产生三维类器官，改变了我们研究哺乳动物器官发生过程中干细胞动力学和维持培养皿中组织稳态的能力³.类器官是研究这些过程的繁琐转基因动物模型的良好替代品。现在已经开发了从许多器官的组织干细胞开发类器官的方案³，包括小肠和结肠、胃、肝脏、胰腺、前列腺和乳腺³。此外，在类器官形成干细胞中开发体细胞基因组编辑技术现在能够快速询问控制其生物学的分子和细胞机制 ^4,5。

初级纤毛是一种基于微管的结构，组装在茎和/或各种组织的分化细胞表面⁶。它通常是非运动的，并且每个单元组装为单个结构⁷。初级纤毛发生是组装初级纤毛⁷ 的动态过程。在细胞表面，纤毛充当细胞信号转导平台⁸。因此，初级纤毛被认为是许多组织中干细胞自我更新和/或分化的关键调节因子，包括大脑 ^9,10、乳腺 ^4,11、脂肪组织¹² 和嗅觉上皮¹³ 等。初级纤毛发生和/或纤毛信号转导在不同的细胞谱系和不同的发育阶段受到动态调节 ^4,13,14，但潜在机制仍有待在很大程度上确定。

离体器官发生有望发展有关控制干细胞生物学的分子和细胞机制的基本知识，包括初级纤毛发生和纤毛信号传导。然而，它依赖于在单细胞水平和亚细胞水平上正确对全镶嵌类器官进行成像的能力。我们最近使用小鼠乳腺干细胞衍生的类器官模型来表明，原代纤毛正向控制小鼠乳腺干细胞类器官的形成能力⁴。在这里，我们提出了一种用于全装小鼠乳腺类器官免疫荧光染色的综合方案（图 1A、B），该方案能够在三维离体器官发生过程中通过光片显微镜分析初级纤毛。最近发表了通过共聚焦显微镜对类器官进行免疫荧光染色和成像的替代方法^15,16。相反，该协议侧重于通过光片显微镜制备和成像类器官。

注：建议将以下方案用于对在 96 孔板的 5 个孔中生长并混合在一起（> 100 个类器官）的类器官进行染色。类器官来源于小鼠乳腺干细胞。根据雷恩大学（法国）动物护理委员会批准的方案饲养和处理供体小鼠。

1. 试剂

1. 要制备固定液，请在 375 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释 125 μL 16% 多聚甲醛 （PFA） 商业水溶液，以生成 4% PFA 溶液。
   注意：作 PFA，PFA 是化学罩下的有毒物质。
2. 要制备透化缓冲液，请在 500 μL PBS 中稀释 1.5 μL Triton X100，以产生 0.3% Triton X100 溶液。
3. 为了制备封闭缓冲液，在 PBS 中稀释 1.5 μL Tween-20 和 75 μL 正常山羊血清，以生成 5% 山羊血清-0.1% Tween 20 溶液。
4. 要制备轻质片材封固剂，请在 65 °C 下将 1 g 超纯低熔点琼脂糖溶解在 100 mL dH20 或 PBS 中。 制备 1 mL 等分试样并在室温下储存。

2. 类器官恢复

1. 将类器官从培养孔转移到低结合聚合物 1.7 mL 管中，在孔中上下吹打 3 次后，用 FBS 涂层的尖端切割末端（肢体的最小直径 1.5 mm）。
   注意：涂层可防止类器官粘附在尖端。低结合聚合物材料能够减少整个染色过程中类器官对试管侧面的附着。
2. 用 PBS 填充试管，并以 350 x g 离心 3 分钟。去除上清液。

3. 固定、透化和封闭

1. 将类器官重悬于 500 μL 的 4% PFA 中。在室温下孵育 30 分钟。以 350 x g 旋转 30 秒。去除上清液。
   注意：从此步骤开始，只需在类器官颗粒上添加缓冲液即可将类器官重悬于不同的缓冲液中，而无需接触它们。在室温下执行所有洗涤步骤。
2. 用 1 mL PBS 洗涤类器官 3 分钟。以 350 x g 旋转 30 秒。去除上清液。
   暂停：固定的类器官可以在 4 °C 的 PBS 中保存至少一周。
3. 通过将类器官重悬于 500 μL PBS-Triton X100 0.3% 中来透化类器官，并在室温下孵育 30 分钟。以 350 g 的速度旋转类器官 30 秒。
4. 用 1 mL PBS 重悬并孵育 3 分钟来洗涤类器官。以 350 x g 旋转 30 秒。去除上清液。重复一次。
5. 可选：将类器官重悬于 500 μL 冰冷的甲醇中。在 - 20 °C 下孵育 10 分钟。特定中心体标志物的染色可能需要此步骤。
6. 可选（如果执行了第 5 步）：用 1 mL PBS 洗涤类器官 3 分钟。以 350 x g 旋转 30 秒。去除上清液。重复一次。
7. 用 500 μL 封闭缓冲液（PBS、5% 山羊血清、0.1% 吐温 20）重悬非特异性抗体结合位点，阻断类器官中的非特异性抗体结合位点。在室温下孵育 1 小时和 30 分钟。以 350 g 离心 30 秒。去除上清液。
8. 用 1 mL PBS 重悬并孵育 3 分钟来洗涤类器官。以 350 x g 旋转 30 秒。去除上清液。

4. 贴标

1. 用 200 μL 含稀释一抗的封闭缓冲液重悬类器官，并在 4 °C 下轻轻摇动孵育过夜（在水平振荡器上为 60 rpm）。将管子与摇床的水平平面成 45° 角放置。它将保持染色缓冲液中试管底部的类器官。
2. 用 1 mL PBS 重悬并孵育 5 分钟来洗涤类器官。以 350 x g 旋转 30 秒。去除上清液。重复两次。
   注：最后一步中的一些类器官可能会粘在试管的侧面，导致离心后吸液时上清液过程中出现类器官损失，在洗涤步骤中向 PBS 中添加 0.2% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA） 可能会减少类器官损失。
3. 用 200 μL 含二抗的封闭缓冲液重悬类器官，并在轻度摇动（水平振荡器上为 60 rpm）孵育 1 小时和 30 分钟。将管子与摇床的水平平面成 45° 角放置。它将保持染色缓冲液中试管底部的类器官。
   注：Hoechst（或其他核染料，如 DAPI 或 DRAQ5）可以与二抗一起添加到缓冲液中。
4. 用 1 mL PBS 重悬并孵育 5 分钟来洗涤类器官。以 350 x g 旋转 30 秒。去除上清液。重复两次。
   注意：最后一步中的一些类器官可能会粘在管的侧面，导致离心后吸取上清液时发生类器官损失，在洗涤步骤中向 PBS 中添加 0.2% （w/v） BSA 可能会减少类器官损失。

5. 制备用于成像的琼脂糖样品

1. 通过在 65 °C 下孵育来熔化轻质片材封固剂。 培养基熔化后，在 37 °C 下孵育 5 分钟。
2. 使用 200 μL 吸头将类器官重悬于 100 μL 封固剂中，上下吹打两次，切开吸头末端（末端最小尺寸：1.5 mm）。
3. 使用柱塞将带有类器官的封固剂吸入玻璃毛细管（绿色毛细管，内径：1.5 mm）中。在室温下孵育毛细管 5 分钟，使封固剂固化。
   暂停：毛细管可以在成像前在 4 °C 的 PBS 中储存一周。

6. 成像

1. 使用光片显微镜（例如，ZEISS Lightsheet Z.1），使用 20 倍或 40 倍水浸物镜对类器官进行成像。
   1. 将玻璃毛细管放入观察室中。使用前置摄像头定位毛细管，并将玻璃毛细管的尖端置于检测物镜的上限。
   2. 选择样品并在明场照明下使用玻璃毛细管的尖端设置最佳焦点。从毛细管中缓慢推出琼脂糖样品，并在固化的琼脂糖内找到类器官。
   3. 将要成像的类器官保持在靠近毛细管尖端的位置，以减少琼脂糖样品在 PBS 中的移动。旋转毛细管以设置最佳样品方向并定义所需的缩放比例。
   4. 选择 acquisition mode。定义要成像的通道，设置光片的适当方向，设置每个通道的激光功率（以减少光漂白，使用低激光功率），设置图像的大小和所需的照明面。成像参数示例：图像尺寸 1920 x 1920，照明度：双面。
   5. 通过使用 Z 堆栈模块设置堆栈的 Z 端，并将 Z 步长设置为最佳，从而定义要成像的 Z 堆栈。
2. 使用显微镜软件的图像处理模块处理输出文件，以在样品中导航，获得 Z 投影和 3D 表示。
3. 转动样品并从不同角度获取新图像或对其他类器官进行成像。
4. 使用交互式显微镜图像分析软件（例如 Imaris）分析图像，从而实现 （i） 样品的 3D 可视化 （ii） 物体的分割 （iii） 物体的识别和定量分析。

离体 器官发生方法正在改变我们研究哺乳动物组织发育和培养皿中组织稳态维持的能力。对调节这些过程的分子和细胞机制（包括初级纤毛发生和纤毛信号传导）的分析依赖于对类器官进行三维成像的能力。

上述方案可以对整个安装的乳腺类器官进行染色。它们来自富含乳腺干细胞的基础细胞，这些基础细胞是从成年雌性小鼠中 FACS 纯化的（...

此处介绍的详细方案能够对在半固体培养基中生长的小鼠乳腺类器官进行染色和成像。该方案可能适用于模拟在半固体和固体培养基中生长的各种组织结构的类器官的染色。对于在 100% 基质胶中生长且顶部有培养基的类器官，恢复和固定步骤略有不同。必须从培养孔中取出培养基。快速 PBS 洗涤后，固定液 （4% PFA） 可以直接添加到含基质胶类器官的培养孔中。Matrigel 中?...

作者声明没有利益冲突。

我们感谢 Xavier Pinson 在光片显微镜开发方面的帮助;Biosit 生物技术中心，包括 MRic、Arche、流式细胞术核心设施和 SFR Santé F. Bonamy，包括 MicroPICell 核心设施， 提供技术支持。这项工作得到了 Fondation ARC、Cancéropôle Grand Ouest、Université de Rennes 1、Fondation de France 的支持。医学博士得到了雷恩大学的研究生奖学金的支持。V.J.G. 得到了 Fondation ARC 博士后奖学金的支持。