Umut Verici Bir İlaç Dağıtım Sistemi Olarak Faz Değişimli Dimetildioktadeilamonyum Kabuklu Mikro Damlacıklar: Memeli Tümör Hücrelerinin 3D Sferoidleri Üzerine Sonuçlar

Bir dimetildioktadesilamonyum bromür kabuğu ile geliştirilen dekafloropentan mikro damlacıklar, olağanüstü bir kolloidal stabilite ve aktraktif bir biyoarayüz sergiledi. DDAB-MD'lerin, insan üçlü negatif meme kanserine karşı Doksorubisin'in gelişmiş alımı ve antitümör aktivitesi ile birlikte plazma membranlarına yüksek afinite ile karakterize edilen etkili ilaç rezervuarları olduğu kanıtlanmıştır (MDA-MB-231) 3D modeli.

Geniş teranostik senaryoda faz değişimli perflorokarbon mikro damlacıkların (MD'ler) önemli ölçüde iyileştirilmesi, MD'lerin bileşiminin sentez verimliliği, stabilite ve ilaç verme kabiliyeti açısından optimizasyonundan geçer. Bu amaçla, bir dimetildioktadesilamonyum bromür (DDAB) katyonik yüzey aktif madde kabuğu ile stabilize edilmiş dekafloropentan (DFP) MD'ler tasarlanmıştır. Darbeli yüksek güçlü insonasyon ile birkaç saniye içinde yüksek konsantrasyonda DDAB-MD'ler kolayca elde edildi ve bu da düşük polidispers 1 μm boyutlu damlacıklar ile sonuçlandı. DDAB kabuğunun uzun, doymuş hidrokarbon zincirleri ile birlikte yüksek pozitif ζ potansiyeli, damlacığı ve içindeki ilaç yükünü stabilize etmek için anahtar faktörlerdir. DDAB kabuğunun hücre plazma membranı ile yüksek afinitesi, tümör hücresi arayüzündeki ilaç konsantrasyonunu artırarak ve alımı artırarak lokalize kemoterapötiklerin verilmesine izin verir. Bu, DDAB-MD'leri çok düşük ilaç dozlarında yüksek antitümör aktivitesi sergileyen ilgili bir ilaç dağıtım aracına dönüştürecektir.

Bu çalışmada, böyle bir yaklaşımın etkinliğinin, doksorubisinin memeli tümör hücrelerinin 3D sferoidlerine (MDA-MB-231) karşı etkisini önemli ölçüde iyileştirdiği gösterilmiştir. Çok hücreli tümör sferoidleri (yani, küresel bir şekilde yoğun şekilde paketlenmiş hücreler) şeklinde geliştirilen üç boyutlu (3D) hücre kültürlerinin kullanımı, 2D hücre kültürlerine kıyasla çok sayıda avantaja sahiptir: geleneksel in vitro çalışmalar ile hayvan testleri arasındaki boşluğu doldurma potansiyeline sahip olmasının yanı sıra, daha öngörücü in vitro gerçekleştirme yeteneğini geliştirecektir klinik öncesi ilaç geliştirme için tarama testleri veya endikasyon dışı ilaçların potansiyelini ve yeni ortak hedefleme stratejilerini değerlendirin.

Yüksek antitümör etkinliği sağlayabilen ve yan etkileri azaltabilen ilaç dağıtım vektörleri, ciddi bir kimyasal-farmasötik zorluk olmaya devam ederken birincil hedeflerdir ^1,2. Bugüne kadar, ilerlemeleri ilk başta yetersiz yerinde ilaç salınımı ve kritik düzeyde spesifik olmayan toksisite ^3,4,5 ile sınırlıdır. Son yıllarda, lipozomlar, polimerik miseller, polimeromlar 6,7,8,9,10 dahil olmak üzere antikanser ajanların uygulanmasını iyileştirmek için çeşitli ilaç dağıtım sistemleri uygulanmıştır. Bu sistemler, sağlıklı organ ve dokulardaki dağılımı ve birikimi azaltırken, ilaçların dolaşım süresini ve seçiciliğini artırmada potansiyel göstermektedir. Her neyse, antrasiklinler gibi antineoplastik kemoterapi ilaçlarının kapsüllenmiş formülasyonları, ilaç içselleştirme verimliliğinin önemli ölçüde azalmasına yol açmıştır. Son zamanlarda, mikro kabarcıklar¹¹, mikro damlacıklar, hibrit altın nanopartiküller¹², nano-hidrojeller¹³, PLGA iskeleleri ve mezogözenekli platformlar¹⁴ gibi uyaranlara duyarlı mikron ve mikron altı taşıyıcılar, doksorubisin (Dox) ve dosetaksel kullanarak tümör inhibitör etkileri hedefleme ve uygulamadaki yüksek çok yönlülükleri nedeniyle farmakolojik ilgi görmektedir. Bu taşıyıcıları multimodal görevler (yani kemoterapötik, fototermal ve gen sinerjik yaklaşımlar) ve moleküler görüntüleme¹⁵ için verimli antikanser askerlerine dönüştürmek için yapılan öncü deneyler, kişiselleştirilmiş teranostik nanotıbbın yolunu açmıştır.

Bu senaryoda, faz değişimli perflorokarbon mikro damlacıklar (MD'ler), yüksek ilaç kargo yüklemesini, biyolojik engelleri ele alan MD kabuğunun kimyasal çok yönlülüğünü, kolloidal stabiliteyi ve sentez verimliliğini bir araya getirmek için sundukları temel fırsat aracılığıyla değerlendirilmiştir^11,12. Ek bir varlık olarak, perflorokarbon (PFC) çekirdeğinin akustik veya optik buharlaşması ile desteklenen MD'lerin ekojenitesi, yerinde görüntüleme ve umut verici terapötik etkinlik elde edilmesini sağlar. Ayrıca, iyonlaştırıcı parçacık demetlerinin enerji salınımı ile elde edilen MD'lerin çekirdek buharlaşması, ışın izleme ve radyasyon dozimetrisi için kullanılabilir.

Bu çalışma, çoklu kullanılabilir bir dimetildioktadezilamiyum bromür (DDAB) katyonik yüzey aktif madde kabuğu ile stabilize edilmiş dekafloropentan (DFP) mikro damlacıklarının geliştirilmesi amaçlanmıştır. DDAB kabuklu MD'ler hem fiziko-kimyasal hem de biyolojik beklentileri karşılar. DFP bazlı mikro damlacıkların, biyouyumlu ve stabil perflorokarbon MD'ler¹⁶ elde etmek için değerli faz değiştiren kontrast maddeleri olduğu gösterilmiştir. DDAB kristal jel, uzun zincirleri fizyolojik sıcaklıkta doyurur, hidrofobik çekirdeğe derinlemesine nüfuz eder, damlacığı ve içindeki ilaç yükünü stabilize eder. Ayrıca, su arayüzündeki yüksek pozitif ζ potansiyeli, MD'lerin kolloidal stabilitesini arttırır. DDAB kabuk yüzeyinin biyolojik çekiciliği, memeli hücrelerini zar zor etkileyen konsantrasyonlarda bakteri ve mantarların ölümüne neden olma ve plazma zarlarını, negatif yüklü antijenik proteinleri, nükleotidleri, DNA'yı veya nanopartikülleri bağlama yeteneğinde yatmaktadır. Yukarıda belirtilen özellikler, memeli hücreleri içinde dikkate değer bir immünoadjuvan, gen terapisi ve antitümör etkisi oluşturmak için kullanılabilir¹⁷.

Burada açıklanan dox yüklü DDAB-MD'ler (Dox@DDAB-MD'ler), oldukça agresif, invaziv ve kötü farklılaşmış üçlü negatif meme kanseri hücrelerine karşı ilaç salınımını teşvik eder. Tek adımlı bir formülasyonda yüksek Dox yükleme verimliliği ile dar bir boyut dağılımına sahip kararlı ve yüksek yoğunluklu DDAB-MD'ler elde etmek için yüksek güçlü prob sonlamasına dayalı basit ve hızlı bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Bu özellikler, mikroakışkan cihazlar ve yüksek parçalayıcılı homojenizatörler gibi diğer hazırlama yöntemleri için bile rekabetçidir¹⁶.

Etkili ilaç dağıtım vektörlerinin tasarlanmasındaki diğer önemli sınırlayıcı konu, bir ilacın aktivitesinin, tek katmanlı hücre modelleri tarafından dikkate alınamayan, gerçek bir biyolojik hedefte elde edilebilen çeşitli parametrelerin (örneğin, absorpsiyon, dağılım, konsantrasyonlar) bir fonksiyonu olmasıdır¹⁸. Bu nedenle, yeni antitümör formülasyonlarının gelişim tarihi, ne yazık ki hayvanlarda klinik öncesi modeller düzeyinde etkisiz olduğu sonuçlanan in vitro çalışmalarla doludur¹⁹.

Özellikle, hücre kültürlerinden in vivo ve ex vivo çalışmalardan daha karmaşık ve güvenilir bir sisteme geçme ihtiyacı, 2D kültürler üzerindeki farmakolojik çalışmaların doğal sınırlamaları ile bağlantılıdır. Bu bağlamda, 2D tek katmanlardan daha karmaşık yapıların morfolojisini, aktivitesini ve fizyolojik tepkisini simüle eden sferoidler, organoidler, çip üzerinde organ gibi in vitro 3D sistemler dahil edilmiştir²⁰. Klinik öncesi bir bakış açısına göre, hücresel mikro çevreyi taklit eden 3D hücre modelleri, geleneksel tek katmanlı kültürlerin etkili olmadığı fizyolojik olarak daha uygun bir çerçevede karmaşık biyolojiyi daha iyi anlama imkanı sunar^21,22.

DDAB-MD'lerin insan meme kanseri hücrelerinin hücre zarı ile etkileşime girebileceğini, çok düşük (nanomolar) Dox konsantrasyonunda ilaç içselleştirmesini ve hücre ölümünü destekleyebileceğini kanıtladıktan sonra, bu tür bir metodolojinin memeli tümör hücrelerinin 3D sferoidlerine karşı etkinliği test edilmiştir, MDA-MB-231, test edilmiştir.

NOT: Tüm reaktifler ve aletler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Mikro damlacıkların üretilmesi ve karakterize edilmesi

1. Dox yüklü DDAB-MD'leri hazırlama
   1. 10 mM'lik bir nihai konsantrasyon ve 1 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için DDAB tozunu etanol içinde çözün. 2 mg Dox tozunu etanol içinde çözerek 1 mL Dox stok çözeltisi hazırlayın.
      DİKKAT: Dox'un akut oral toksisite, kategori 4 ve kanserojenlik, kategori 1B'ye sahip olduğu bilinmektedir. Sadece eldiven ve sağlık maskesi ile çeker ocak altında kullanın.
   2. 15 mL'lik plastik dereceli santrifüj tüpünde 300 μL DDAB çözeltisine (yağ fazı) 250 μL DFP ekleyin.
      NOT: DFP'nin saflığı% 60 (GC), yoğunluk 1.6 g / mL (20 ° C), kaynama noktası 55 ° C'dir. Dox saflığı 98, 0-102,% 0'dır (HPLC). DDAB saflığı %≥98'dir (TLC). Etanolün saflığı %97'dir.
   3. Yağ fazına yavaşça 2.15 mL deiyonize su ekleyin, bu da iki fazlı bir su/yağ karışımı elde edilmesini sağlar. Önemli miktarda Dox'un su fazına bölünmesini önlemek için, insonasyondan hemen önce 10 μL Dox solüsyonunu doğrudan yağ fazına nazikçe enjekte edin.
   4. 20 kHz'de darbe modunda (0,7 s Açık ve 0,3 s Kapalı) yüksek yoğunluklu bir ultrasonik sıvı işlemci ekipmanı kullanarak 10 s boyunca 10 W ile bifazik karışımı prob insonasyonu (1/8 inç titanyum konik mikro uç ile) ile emülsifiye edin. Taze hazırlanmış MD'leri hemen ultra filtrelenmiş, deiyonize su (örn. MilliQ) ile 1.8 faktörü ile seyreltin.
      NOT: Seyreltme faktörü gösterge niteliğindedir ve ampirik olarak seçilmiştir. MDs çözeltisi, sonraki santrifüjlerden yeterli miktarda pelet elde edildiği sürece daha fazla seyreltilebilir.
   5. Elde edilen süspansiyonun 1 mL'sini alın ve 3x santrifüjleyin, fazla Dox ve etanolü gidermek için ultra filtrelenmiş, deiyonize suda (örneğin, MilliQ) yeniden süspanse edin. İlk santrifüjlemeyi 25 ° C'de, 360 x g'da 3 dakika ve ikinci ve üçüncü santrifüjü 280 x g'de aynı sıcaklık ve sürede gerçekleştirin.
   6. Son yıkamadan sonra, süpernatant suyu çıkarın ve 5 μL peletleri çekin ve bunları hücre muamelesi için 2 mL ortama dağıtın, 10 nM'lik eşdeğer bir Dox konsantrasyonu elde edin.Dox@DDAB-MD sentezi için protokol adımları Şekil 1'de gösterilmiştir.
      NOT: Eşdeğer Dox konsantrasyonu, Dox@DDAB-MD'lerden oluşan bir süspansiyonun aynı hacminde bulunan serbest Dox miktarı olarak tanımlanır.
2. Dox yüklü DDAB-MD'lerin karakterizasyonu
   1. Dinamik Işık Saçılımı (DLS) fotometresi kullanarak boyut dağılımını ölçün ve ilgili bozunma sürelerini tahmin etmek için elde edilen korelogramları CONTIN algoritması ile analiz edin. Daha sonra, parçacıkların difüzyon katsayılarının (D) dağılımını belirlemek için bozunma sürelerini kullanın ve bunları Stokes-Einstein ilişkisini kullanarak hidrodinamik çapların dağılımına (2R_H) dönüştürün R_H = k_BT/6πηD, burada k_BT sistemin termal enerjisidir ve çözücü viskozitesini η.
   2. Bir görüntü analiz yazılımı (örneğin, Resim J) ile parlak alan mikroskobu kullanarak, çerçeve başına en az 100 damlacıkın boyutunu ölçerek (3 veya 4 kare için), ortalama bir değer ve standart sapma elde ederek boyut ve boyut dağılımını kontrol edin.
      NOT: DLS ölçümleri için, MD çözeltisini ultra filtrelenmiş, deiyonize su (örn., MilliQ), PBS ve hücre kültürü ortamında, 1.5 x 10⁸ MDs / mL'lik sabit bir konsantrasyona geri saçılmayı önlemek için seyreltin. Hücre kültürü ortamındaki ultra filtrelenmiş, deiyonize su ve PBS için sırasıyla 1.1 ± 0.1 μm, 1.1 ± 0.25 μm ve 1.2 ± 0.2 μm ortalama boyut değerleri elde ettik. Santrifüjlemeden sonra peletlerden geri kazanılan MD'ler, hatalar içinde herhangi bir boyut değişikliği göstermez.
   3. MD konsantrasyonunu değerlendirmek için mikroskopi için bir hücre sayma odası slaytı kullanın. Hazne 0,10 mm kalınlığında iki farklı sayım alanından oluşmaktadır. Haznenin üzerine 10 μL MD süspansiyonu yerleştirin. 40x uzun mesafeli objektife sahip bir optik mikroskop kullanarak odanın 0,25 x 0,25 nm² karesi içindeki MD'leri sayın ve ücretsiz bir görüntü analizi yazılımı ile analiz edin.
   4. Aşağıdaki denkleme göre MD / mL sayısı olarak ifade edilen MD konsantrasyonunu hesaplayın:
      
   5. 590 nm'de Dox otofloresansından yararlanan Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) ile içselleştirilmiş Dox görüntülerini kontrol edin. Florimetrik bir test kullanarak Dox içeriğini ölçün, partikülleri ultra filtrelenmiş, deiyonize su veya PBS içinde dağıtın, 25 ° C'de, 360 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatantın floresansını bir kalibrasyon eğrisi ile 590 nm'de değerlendirerek serbest ilaç miktarını belirleyin (Dox konsantrasyonu için doğrusallık aralığı: 2-20 μmol / mL, R² = 0.99).
      NOT: Kapsüllenmiş Dox miktarını elde etmek için elde edilen değeri toplam Dox konsantrasyonundan çıkarın. Deneyi üç nüsha halinde gerçekleştirin. Dox kapsülleme verimliliği, MD'lerdeki Dox ilaç miktarının dağıtılan toplam Dox içeriğine bölünmesiyle hesaplanan %28 ± %2 ile sonuçlanır.
   6. Süpernatantta salınan Dox yüzdesini kapsüllenmiş olanların sayısına göre elde etmek için prosedürü adım 1.2.3'e göre santrifüjleyerek ve tekrarlayarak zaman içinde Dox salınımı deneyleri gerçekleştirin. İlk belirlemeden sonra, MD'lerin kırılmasını önlemek için santrifüjleme hızını 280 x g'a düşürerek işlemi tekrarlayın. Zaman içinde bir yayın eğrisi çizin. Süpernatantta 24 saat içinde salınan Dox konsantrasyonunun maksimum% 20'ye ulaştığını kontrol edin.
   7. Özel bir aparat (örneğin, NanoZetaSizer) kullanarak 37 ° C'de ζ potansiyelini ölçün ve elde edilen değerlerin 90-100 mV civarında olduğunu doğrulayın.

2. Mikro kalıplanmış yapışkan olmayan yüzeylerde sferoidlerin imalatı

1. Döküm mikro kalıpları
   1. Küçük 3D kalıpları ve 1 g saf agaroz tozunu sterilizasyona uygun kaplara yerleştirin. Kuru bir döngüde (121 °C) 30 dakika boyunca otoklavlayın.
   2. Bir biyogüvenlik kabininde, sterilize agaroz içeren cam şişeye 50 mL %0.9 salin (NaCl) çözeltisi ekleyin ve tozu kaynatmak ve çözmek için bir mikrodalga fırına koyun. Erimiş agarozu 60 °C'ye kadar soğumaya bırakın ve pipetleme sırasında kabarcık oluşmasını önleyerek her mikro kalıba 500 μL ekleyin.
      UYARI: Erimiş agaroz ciddi cilt yanıklarına neden olabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipmana ihtiyaç vardır.
   3. Kalıbı dikkatlice esneterek ve yeni oluşan alt tabakayı çıkararak jelleşmiş agarozu çıkarın. Alt tabakaları 12 oyuklu bir tabağa koyun ve oyuk başına 2 mL taze kültür ortamı ekleyin. Her bir alt tabakayı dengelemek için en az 15 dakika inkübe edin.
      NOT: Kültür ortamını önceden hazırlayın ve olası partikülleri veya kirleticileri gidermek için 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin.
2. Hücrelerin tohumlanması
   1. 37 ° C,% 5 CO_2'de bir hücre kültürü inkübatöründe tam ortamlı (% 1 Pen / Strep,% 10 FBS ve% 1 L-Glu ile desteklenmiş DMEM) MDA-MB 231 hücrelerinin kültürü. Hücreler bir T75 şişesinde yaklaşık% 80 birleşime ulaştığında, ortamı atın, 4 mL DPBS ile durulayın ve 3 mL tripsin / EDTA ekleyin. Şişeyi inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin ayrılmasını bekleyin. Dekolmanı her 5 dakikada bir ters çevrilmiş bir mikroskop altında (20x'te) inceleyin.
   2. Ayrılmış hücreleri 3 mL DPBS ile 15 mL'lik bir tüpte% 10 FBS ile toplayın ve 10 dakika boyunca 235 x g'da santrifüjleyin. Hem DPBS hem de tripsin / EDTA içeren süpernatanı atın ve hücre peletini 3 mL taze ortamda yeniden süspanse edin. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripanblue ile pipetleyin ve bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: Hücreleri toplarken, santrifüjleme aşaması sırasında tripsinin hücrelere zarar vermesini önlemek için tripsin/EDTA'yı %10 FBS içeren DPBS ile nötralize edin.
   3. 50 μm'lik (~ 15 hücre / sferoid) nominal bir sferoid çapı elde etmek için, hücre süspansiyonunu 3.840 hücre / 190 μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin, bu da küçük kalıpta 256 sferoid ile sonuçlanır. Alternatif olarak, 200 μm'lik bir küresel çap (~ 1.000 hücre / sferoid) için, 81.000 hücre / 190 μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin, bu da üreticinin talimatlarına göre büyük kalıpta 81 sferoid ile sonuçlanır.
   4. Kültür ortamını 12 oyuklu plakadan çıkarın ve ortamı hücre tohumlama odasından dikkatlice çıkarmak için substratları eğin. Her bir substrata 190 μL hücre süspansiyonu ekleyin (damla damla olarak) ve hücrelerin doku kültürü inkübatöründe 10 dakika oturmasını bekleyin.
   5. Oyuk başına 2 mL çevreleyen ortam ekleyin ve çok kuyulu inkübatöre geri yerleştirin. Her 24 saatte bir küresel oluşumu kontrol edin. Gerektiğinde yeni bir ortamla değiştirin.
3. Sferoidlerin hasat edilmesi ve işlenmesi
   1. 10-15 dakika dengelemek için inkübatöre 2 mL taze ortam içeren 35 mm'lik bir Petri kabı yerleştirin.
   2. Substratı çevreleyen hücre kültürü ortamını çıkarın. Steril bir cımbız ile, alt tabakayı kuyudan çıkarın ve Petri kabında ters çevirin. Sferoidlerin yerçekimi ile düşmesini sağlamak için alt tabakanın altına hafifçe vurun.
   3. Sferoidleri içeren Petri kabını daha sonraki işlemler için inkübatöre geri yerleştirin. Sferoid üretimi için protokol adımları Şekil 2'de gösterilmiştir.

3. Sferoid tedavisi

1. Süpernatanı kalıptan çıkarın ve adım 1.1.6'da açıklandığı gibi hazırlanan 200 μL Dox@DDAB-MD dispersiyonu ile değiştirin.
2. 5 dakika sonra, dengelemek için 2 mL / kuyu çevreleyen ortam ekleyin. İstenen tedavi süresinden sonra, adım 2.1'e göre devam edin.

4. Küresel boyut ve morfolojinin karakterizasyonu

1. Mikroskop görüntü işleme yazılımı ile birleştirilmiş 40x objektif ile istenen inkübasyon süresinden sonra sferoid boyutunu kontrol edin.
2. Uygun istatistikler için yeterli veri toplamak için en az 10 sferoidin boyutunu ölçün ve hacimlerini 7. adımda bildirildiği gibi analiz edin.

5. Proliferasyon / canlılık testi: canlı hücre boyama ile floresan mikroskobu

NOT: Adım 2.2.5'e kadar küresel üretim talimatlarını izleyin.

1. Süpernatanı kalıptan çıkarın ve PBS'de 200 μL 4 μM kalsein-ile değiştirin ve karanlıkta oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin. İnkübasyonun son 20 dakikası sırasında, ölü hücreleri boyamak için 10 μg / mL propidyum iyodür ekleyin.
2. Adım 2.3.2'ye göre substratı Petri kabına ters çevirerek sferoidleri hasat edin.
3. 40x/60x objektifli CLSM ve bir Ar+ lazer kullanarak sferoidleri boyama solüsyonunda görüntüleyin, odaklanmış görüntüler elde etmek için kazancı ve iğne deliğini uygun şekillerde ayarlayın.

6. Görüntü analizi ve edinimi

1. İletim ve konfokal 2D görüntüler
   1. Konfokal yazılımı açın (Ek Dosya A) ve hedefi seçin (60x, 40x, vb.). İletim kanalını seçmek için sağ panelde Trans'a tıklayın.
   2. Görüntüyü görselleştirmek ve optimize edilmiş odağı aramak için Canlı'ya tıklayın. Edinmeyi durdurmak için Tek'e tıklayın.
   3. Konfokal görüntüler için, kullanılan floresan boyaya bağlı olarak Kırmızı veya Yeşil lazer kanallarına tıklayın. İğne deliği bölümünde, açılır menüden S-diyaframını seçin ve kazanç bölümünü 6.00 B'ye ayarlayın.
   4. Canlı'ya tıklayın ve kontrastı optimize etmek için iğne deliği diyaframını ve kazancını ayarlayın. Alımı durdurmak ve görüntüyü kaydetmek için Tek'e tıklayın. Üst araç çubuğunda doğru kanalı seçerek iletim ve konfokal görüntüyü üst üste getirin.
2. Konfokal 3D görüntüler
   1. Sağ paneldeki Z'ye tıklayın (Ek Dosya B). Ayarları sıfırlamak için kırmızı düğmeye tıklayın.
   2. Ref bölümünü seçin, Canlı'ya tıklayın ve odağı hareket ettiren nesnenin içindeki medyan planı arayın. Üst bölümü seçin ve nesne odak dışına çıkıp kaybolana kadar odağı yukarı hareket ettirin.
   3. Odağı aşağı doğru hareket ettiren alt kısım için 6.2.2 adımını tekrarlayın.
   4. Adım boyutunu 0,75 μm olarak ayarlayın. Taramayı başlatmak için Z-stack'e ve ardından Tek'e tıklayın. Görüntüleri .ics formatında kaydedin.
3. Optik görüntüler ve analiz
   1. Optik mikroskop yazılımını açın, üst araç çubuğundaki Oynat'a basarak görüntüyü 40x uzun odak veya 20x objektifle yakalayın. Durdur (Stop) düğmesine basın ve görüntüyü kaydedin.
   2. Üst araç çubuğunda Görünüm, Analiz Kontrolü, Ek Açıklamalar ve Ölçümler'e tıklayın ve farklı seçeneklere sahip bir panel açın (Ek dosya C). Detaylandırma ve Ölçümler panelinde Yarı Eksen'i seçin ve Elips'e tıklayın.
   3. Görüntü Arama'da, nesne şekline daha iyi uyan ekseni arayın ve elde edilen değeri sağ panel tablosuna aktarmak için klavyede Enter tuşuna basın.
   4. Yeterli veri elde etmek için en az 10 nesne için adım 6.3.3'ü tekrarlayın. Verileri dışa aktarmak ve kaydetmek için Excel Veri Sayfasına Aktar'a tıklayın.
4. 3D Z-Stack görüntü görselleştirme ve hacim sayısal hesaplama
   1. Konfokal mikroskop ile yakalanan 3D görüntüyü optik mikroskop yazılımında açın (Ek dosya D).
   2. 3D rekonstrüksiyonu görmek için, görüntü araç çubuğunda Hacim Görünümünü Göster'e tıklayın; Nesne, farenin sol tuşuna tıklanarak herhangi bir yönde döndürülebilir. Birimin bir bölümünü seçmek için ctrl + sol fare tuşlarına basmaya devam edin (Ek Dosya E).
   3. 3D görüntünün anlık görüntüsünü almak ve kaydetmek için klavyedeki x düğmesine basın.
   4. Nesne hacmini hesaplamak için, bir panel açarak Ölç, 3B nesne ölçümleri üzerine tıklayın (Ek Dosya, Resim F). Panel araç çubuğuna tıklayın 3D eşiği tanımlayın ve ayrıca pürüzsüz ve temiz filtreleri kullanarak optimize edilmiş eşiği ayarlayın (Ek Dosya, Resim G). 3B nesne ölçümleri panelinde hacim de dahil olmak üzere farklı parametreler elde etmek için Tamam'a tıklayın.
   5. Verileri dışa aktarmak ve kaydetmek için Excel'e Aktar'a tıklayın.

7. Küresel veri analizi

1. Sferoidlerin hacim hesaplamaları için, Şekil 3'teki ekte gösterildiği gibi 2B projeksiyon boyunca ana ve küçük ekseni tahmin ederek 3B yapıyı bir prolat elipsoidi ile yaklaştırın.
2. Adım 6.4'te gösterildiği gibi sayısal olarak hesaplanan hacim ile b>a=c burada a, b ve c elipsoid eksenidir) olan prolate elipsoid hacim formülü arasında bir karşılaştırma yaparak prolate elipsoid yaklaşımını doğrulayın.
3. En az 10 sferoidin ortalama hacmini ve ilgili standart sapmaları hesaplayın. Sferoidin hacim dağılımı normalse, aykırı değer değerini belirlemek ve reddetmek için Dixon testini uygulayın. Daha sonra, Şekil 6A'da bildirildiği gibi hata yayılımı ile birlikte muamele edilen ve numuneler arasındaki hacim oranını hesaplayın.

Dox@DDAB-MD'ler, Şekil 1'de şematik olarak açıklandığı gibi protokole (Bölüm 1) göre geliştirilmiştir. Elde edilen MD'ler, DFP çekirdeğini kapsülleyen tek katmanlı bir DDAB'den yapılmıştır (Şekil 1A). DDAB'ın katyonik yükü ve sonikasyon prosedürü, DFP ve su arayüzünde²³ yığılmış DDAB çok katmanlı katmanların oluşumunu önler.

Antrasiklinlerin antitümör ilaçlar olarak etkinliğini arttırmak için bu çalışma, kemoterapötik ilaç doksorubisin (Dox) ile kapsüllenen DDAB kabuklu PFC damlacıklarının oluşumunu ve yüksek agresif üçlü negatif meme kanseri hücreleri MDA-MB-231 ile etkileşime giren bu formülasyonun etkisini sunmaktadır.

DOX@DDAB-MD'lerin oluşturulması
Dox yüklü MD'ler, son derece hızlı, iyi tekrarlanabilir, kullanıcı dostu ve v...

Çıkar çatışması: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

İnsan/Hayvan Hakları: Bu makale, yazarlardan herhangi biri tarafından insan veya hayvan deneklerle yapılan herhangi bir çalışmayı içermemektedir.

Bu çalışma, AMPHORA (766456) hibe sözleşmesi kapsamında Avrupa Birliği Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır.