相变二甲基二十八烷壳微滴作为一种有前途的药物递送系统：哺乳动物肿瘤细胞 3D 球状体的结果

用二甲基二十八烷溴化铵壳开发的十氟戊烷微滴表现出优异的胶体稳定性和作用活性生物界面。DDAB-MDs 被证明是有效的药物储存库，其特征是对质膜的高亲和力，以及阿霉素对人三阴性乳腺癌 （MDA-MB-231） 3D 模型的摄取和抗肿瘤活性增强。

在广阔的治疗诊断场景中，相变全氟碳微滴 （MD） 的显着改进是通过 MDs 组成在合成效率、稳定性和药物递送能力方面的优化来实现的。为此，设计了由二甲基二十八烷溴化铵 （DDAB） 阳离子表面活性剂壳稳定的十氟戊烷 （DFP） MD。通过脉冲高功率谐振，可在几秒钟内轻松获得高浓度的 DDAB-MD，从而产生低多分散的 1 μm 大小的液滴。高度正的 ζ 电位以及 DDAB 壳的长饱和烃链是稳定液滴及其中药物货物的关键因素。DDAB 壳与细胞质膜的高亲和力允许通过增加肿瘤细胞界面的药物浓度和促进摄取来实现局部化疗药物递送。这将使 DDAB-MDs 成为一种相关的药物递送工具，在非常低的药物剂量下表现出高抗肿瘤活性。

在这项工作中，这种方法的功效被证明可以显着改善阿霉素对哺乳动物肿瘤细胞 MDA-MB-231 的 3D 球体的作用。与 2D 细胞培养相比，使用以多细胞肿瘤球体（即球形的密集堆积细胞）形式开发的三维 （3D） 细胞培养物具有许多优势：除了有可能弥合传统 体外 研究和动物试验之间的差距外，它还将提高进行更具预测性的 体外检测 的能力用于临床前药物开发的筛选分析或评估超适应症药物和新的共靶向策略的潜力。

能够确保高抗肿瘤疗效和减少副作用的药物递送载体是主要目标，但仍然是一个严峻的化学制药挑战 ^1,2。迄今为止，由于原位药物释放不足和非特异性毒性达到临界水平，他们的进展起初受到限制 ^3,4,5。近年来，已经实施了几种药物递送系统来改善抗癌剂的给药，包括脂质体、聚合物胶束、聚合物体 6,7,8,9,10。这些系统在增加药物的循环时间和选择性方面表现出潜力，同时减少在健康器官和组织中的分布和积累。无论如何，抗肿瘤化疗药物（如蒽环类药物）的封装制剂导致药物内化效率显着降低。最近，刺激响应性微米和亚微米载体，如微泡¹¹、微滴、杂化金纳米颗粒¹²、纳米水凝胶¹³、PLGA 支架和介孔平台¹⁴，因其在使用阿霉素 （Dox） 和多西他赛靶向和发挥肿瘤抑制作用方面的高度多功能性而获得药理学兴趣。将这些载体转变为多模式任务（即化疗、光热和基因协同方法）和分子成像的高效抗癌士兵的开创性实验¹⁵ 为个性化治疗诊断纳米医学铺平了道路。

在这种情况下，相变全氟化碳微滴 （MD） 通过它们提供的关键机会来评估，以共轭高药物负载量、MD 壳解决生物屏障的化学多功能性、胶体稳定性和合成效率^11,12。作为一项额外的资产，全氟化碳 （PFC） 核心的声波或光学汽化促进的 MD 回声性允许获得原位成像和有希望的治疗效果。此外，电离粒子束能量释放获得的 MDs 核心汽化可用于光束跟踪和辐射剂量测定。

本研究旨在开发由二甲基二十八烷溴化铵 （DDAB） 阳离子表面活性剂的多种可用外壳稳定的十氟戊烷 （DFP） 微滴。DDAB 带壳 MD 满足物理化学和生物学期望。基于 DFP 的微滴已被证明是有价值的相变造影剂，可实现生物相容性和稳定的全氟化化合物^MD16。DDAB 结晶凝胶在生理温度下使长链饱和，深入渗透疏水核心，稳定液滴和其中的药物货物。此外，水界面处的高正ζ电位增强了 MDs 的胶体稳定性。DDAB 壳表面的生物吸引力在于能够在几乎不影响哺乳动物细胞的浓度下导致细菌和真菌死亡，并结合质膜、带负电荷的抗原蛋白、核苷酸、DNA 或纳米颗粒。上述特征可用于在哺乳动物细胞内产生显着的免疫佐剂、基因治疗和抗肿瘤作用¹⁷。

本文描述的 Dox 负载 DDAB-MD （Dox@DDAB-MDs） 促进针对高度侵袭性、侵袭性和低分化三阴性乳腺癌细胞的药物释放。下面描述了一种基于高功率探针超声的简单快速方案，以一步法配方获得稳定且高密度的 DDAB-MD，具有窄尺寸分布和高 Dox 负载效率。即使对于微流体装置和高剪切均质器等其他制备方法，这种特性也具有竞争力¹⁶。

设计高效药物递送载体的另一个主要限制问题是药物活性是可在实际生物靶标中获得的各种参数（例如，吸收、分布、浓度）的函数，这是单层细胞模型无法考虑的¹⁸。出于这个原因，新型抗肿瘤制剂的开发历史中充斥 着 体外研究，不幸的是，这些研究已经在动物临床前模型的水平上无效¹⁹。

特别是，需要从细胞培养转向比体内和离体研究更复杂、更可靠的系统，这与 2D 培养物的药理学研究的固有局限性有关。在这种情况下，包括体外 3D 系统，例如球状体、类器官、器官芯片，它们模拟比 2D 单层更复杂结构的形态、活性和生理反应²⁰。从临床前的角度来看，模拟细胞微环境的 3D 细胞模型提供了在生理上更相关的框架中更好地了解复杂生物学的可能性，而传统的单层培养在其中无效^21,22。

在证明 DDAB-MDs 可以与人乳腺癌细胞的细胞膜相互作用，有利于在非常低（纳摩尔）Dox 浓度下药物内化和细胞死亡后，该方法对哺乳动物肿瘤细胞 MDA-MB-231 的 3D 球体的疗效已经得到测试。

注：所有试剂和仪器均列于 材料表中。

1. 微滴的制备和表征

1. 准备 Dox 加载的 DDAB-MD
   1. 将 DDAB 粉末溶解在乙醇中，获得 10 mM 的终浓度和 1 mL 的最终体积。制备 1 mL Dox 储备溶液，将 2 mg Dox 粉末溶于乙醇中。
      注意：已知 Dox 具有急性口服毒性（4 类）和致癌性（1B 类）。只能在通风橱下戴手套和健康面罩使用。
   2. 在 15 mL 塑料刻度离心管中，将 250 μL DFP 添加到 300 μL DDAB 溶液（油相）中。
      注：DFP 的纯度为 60% （GC），密度为 1.6 g/mL （20 °C），沸点为 55 °C。 Dox 纯度为 98， 0-102， 0% （HPLC）。DDAB 纯度为 ≥98% （TLC）。乙醇纯度为 97%。
   3. 在油相上轻轻加入 2.15 mL 去离子水，得到两相水/油混合物。在谐振之前，将 10 μL Dox 溶液直接轻轻注入油相中，以避免大量 Dox 分配到水相中。
   4. 使用高强度超声波液体处理器设备在 20 kHz、100 W 的脉冲模式（0.7 秒开和 0.3 秒关）下通过探针谐振（带有 1/8 英寸钛锥形微尖）乳化双相混合物。立即用超滤去离子水（例如 MilliQ）将新鲜制备的 MD 稀释 1.8 倍。
      注：稀释因子是指示性的，根据经验选择的。只要从后续离心中获得足够的沉淀，就可以进一步稀释 MDs 溶液。
   5. 取 1 mL 获得的悬浮液并离心 3 次，重悬于超滤的去离子水（例如 MilliQ）中，以去除过量的 Dox 和乙醇。在25°C，360 x g 下进行第一次离心3分钟，在相同的温度和时间下以280 x g 进行第二次和第三次离心。
   6. 最后一次洗涤后，去除上清液水并吸取 5 μL 沉淀并将它们分散到 2 mL 培养基中用于细胞处理，获得等效浓度为 10 nM 的 Dox 浓度Dox@DDAB-MDs 合成的方案步骤如图 1 所示。
      注：等效 Dox 浓度定义为相同体积的 Dox@DDAB-MD 悬浮液中所含的游离 Dox 量。
2. Dox 负载的 DDAB-MD 的表征
   1. 使用动态光散射 （DLS） 光度计测量尺寸分布，并使用 CONTIN 算法分析获得的相关图以推断相关的衰变时间。然后使用衰变时间来确定粒子扩散系数 （D） 的分布，并使用斯托克斯-爱因斯坦关系 R_H = k_BT/6πηD 将其转换为流体动力学直径 （2R_H） 的分布，其中 k_BT 是系统的热能，η溶剂粘度。
   2. 还使用带有图像分析软件的明场显微镜检查大小和大小分布（例如，图像 J），测量每帧至少 100 个液滴的大小（3 或 4 帧），获得平均值和标准偏差。
      注：对于 DLS 测量，在超滤的去离子水（例如 MilliQ）、PBS 和细胞培养基中稀释 MDs 溶液，以避免反向散射至 1.5 x 10⁸ MDs/mL 的固定浓度。对于细胞培养基中的超滤、去离子水和 PBS，我们获得了 1.1 ± 0.1 μm 、 1.1 ± 0.25 μm 和 1.2 ± 0.2 μm 的平均尺寸值。离心后，从沉淀中回收的 MD 在错误中未显示任何大小变化。
   3. 使用细胞计数室载玻片进行显微镜检查以评估 MDs 浓度。该腔室由两个不同的计数区域组成，厚度为 0.10 mm。将 10 μL 的 MDs 悬浮液放在腔室上。使用具有 40 倍长距离物镜的光学显微镜对腔室 0.25 x 0.25 nm² 正方形内的 MD 进行计数，并使用图像分析免费软件进行分析。
   4. 根据以下公式计算 MDs 浓度，以 MDs/mL 的数量表示：
      
   5. 通过共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 图像检查 Dox 在 590 nm 处的自发荧光。使用荧光测定法测量 Dox 含量，将颗粒分散在超滤、去离子水或 PBS 中，在 25 °C、360 x g 下离心 3 分钟，然后通过用校准曲线评估上清液在 590 nm 处的荧光来确定游离药物的量（Dox 浓度的线性范围：2-20 μmol/mL， R² = 0.99）。
      注：从 Dox 的总浓度中减去获得的值，以获得 Dox 的封装量。一式三份执行实验。Dox 包封效率为 28% ± 2%，计算方法是将 MD 中 Dox 的药物量除以部署的 Dox 总含量。
   6. 按照 步骤 1.2.3 离心并重复该过程，进行 Dox 释放随时间变化的实验，以获得上清液中释放的 Dox 与封装数量的百分比。第一次测定后，通过将离心速度降低至 280 x g 来重复该过程，以避免 MD 破裂。绘制随时间变化的释放曲线。检查上清液中 24 小时内释放的 Dox 浓度是否达到最大 20%。
   7. 使用专用设备（例如 NanoZetaSizer）在 37 °C 下测量 ζ 电位，并验证获得的值约为 90-100 mV。

2. 在微成型非粘合基材中制造球状体

1. 铸造微模
   1. 将小 3D 模具和 1 g 纯琼脂糖粉末放入适合灭菌的容器中。在干燥循环 （121 °C） 上将它们高压灭菌 30 分钟。
   2. 在生物安全柜中，将 50 mL 0.9% 盐水 （NaCl） 溶液添加到装有灭菌琼脂糖的玻璃瓶中，然后将其放入微波炉中煮沸并溶解粉末。让熔融琼脂糖冷却至 60 °C，并向每个微模具中加入 500 μL，以避免在移液时产生气泡。
      警告： 熔融琼脂糖会导致严重的皮肤灼伤。需要适当的个人防护设备。
   3. 通过小心弯曲模具并去除新形成的底物来去除凝胶化的琼脂糖。将底物放入 12 孔板中，每孔加入 2 mL 新鲜培养基。孵育至少 15 分钟以平衡每种底物。
      注：提前准备培养基，并将其通过 0.22 μm 过滤器以去除可能的颗粒或污染物。
2. 接种细胞
   1. 在37°C、5%CO₂的细胞培养箱中，用完全培养基（补充有1%Pen/Strep、10%FBS和1%L-Glu的DMEM）培养MDA-MB 231细胞。当细胞在 T75 培养瓶中达到约 80% 汇合时，丢弃培养基，用 4 mL DPBS 冲洗并加入 3 mL 胰蛋白酶/EDTA。将培养瓶放入培养箱中，等待细胞分离。每 5 分钟在倒置显微镜（20 倍）下检查脱离。
   2. 在 15 mL 试管中用 3 mL DPBS 和 10% FBS 收集分离的细胞，并以 235 x g 离心 10 分钟。丢弃含有 DPBS 和胰蛋白酶/EDTA 的上清液，并将细胞沉淀重悬于 3 mL 新鲜培养基中。用 10 μL 台盼蓝吸取 10 μL 细胞悬液，并使用 Neubauer 室对细胞进行计数。
      注：收获细胞时，用含有 10% FBS 的 DPBS 中和胰蛋白酶/EDTA，以防止胰蛋白酶在离心步骤中损坏细胞。
   3. 为了获得 50 μm（~15 个细胞/球体）的标称球体直径，将细胞悬液稀释至终浓度为 3,840 个细胞/190 μL，从而在小模具中产生 256 个球体。或者，对于直径为 200 μm 的球状体（~1,000 个细胞/球状体），根据制造商的说明稀释至终浓度为 81,000 个细胞/190 μL，从而在大模具中产生 81 个球状体。
   4. 从 12 孔板中取出培养基并倾斜底物，小心地从细胞接种室中取出培养基。向每个底物中加入 190 μL 细胞悬液（以滴加方式），并等待细胞在组织培养箱中沉淀 10 分钟。
   5. 每孔加入 2 mL 周围培养基，然后将多孔放回培养箱中。每 24 小时检查一次球体形成。需要时更换新鲜培养基。
3. 采集和处理椭球体
   1. 将含有 2 mL 新鲜培养基的 35 mm 培养皿放入培养箱中平衡 10-15 分钟。
   2. 去除底物周围的细胞培养基。用无菌镊子从孔中取出底物并将其倒置在培养皿中。轻轻敲击基底的底部，使球体在重力作用下落下。
   3. 将含有球体的培养皿放回培养箱中进行进一步处理。球体制造的协议步骤如图 2 所示。

3. 球状体处理

1. 从模具中取出上清液，用 200 μL Dox@DDAB-MDs 分散液代替，如 步骤 1.1.6 中所述制备。
2. 5 分钟后，加入 2 mL/孔的周围培养基以平衡。在所需的治疗时间后，按照 步骤 2.1 进行。

4. 球体大小和形态的表征

1. 在所需的孵育时间后，使用 40 倍物镜结合显微镜图像处理软件检查球体大小。
2. 测量至少 10 个球体的大小，以收集足够的数据进行适当的统计，并分析 步骤 7 中报告的体积。

5. 增殖/活力检测：荧光显微镜检查和活细胞染色

注意：按照椭球体制造说明进行作，直到 步骤 2.2.5。

1. 从模具中取出上清液，用 200 μL 4 μM 钙黄绿素-AM 的 PBS 溶液替换，并在室温下避光孵育 3 小时。在孵育的最后 20 分钟内，加入 10 μg/mL 碘化丙啶对死细胞进行染色。
2. 按照 步骤 2.3.2 将底物倒置到培养皿中，收获球体。
3. 使用具有 40x/60x 物镜和 Ar + 激光器的 CLSM 对染色溶液中的球体进行成像，以适当的方式设置增益和针孔以获得聚焦图像。

6. 图像分析和采集

1. 透射和共聚焦 2D 图像
   1. 打开共聚焦软件（补充文件 A）并选择物镜（60 倍、40 倍等）。在右侧面板上，单击 Trans 以选择传输通道。
   2. 单击 Live 以可视化图像并搜索优化的焦点。单击 Single 以停止收购。
   3. 对于共聚焦图像，单击 红色 或 绿色 激光通道，具体取决于所使用的荧光染料。在针孔部分，在下拉菜单中选择 S-aperture 并将增益部分设置为 6.00 B。
   4. 单击 Live 并设置针孔孔径和增益以优化对比度。单击 Single 停止采集并保存图像。通过在顶部工具栏上选择正确的通道来重叠透射和共聚焦图像。
2. 共聚焦 3D 图像
   1. 单击右侧面板上的 Z（补充文件 B）。单击红色按钮重置设置。
   2. 选择 Ref 部分，单击 Live 并搜索移动焦点的对象内的中间计划。选择 Top （顶部 ） 部分并向上移动焦点，直到对象失去焦点并消失。
   3. 对底部向下移动焦点重复 步骤 6.2.2 。
   4. 将步长设置为 0.75 μm。单击 Z-stack ，然后单击 Single 开始扫描。以 .ics 格式存储图像。
3. 光学图像和分析
   1. 打开光学显微镜软件，按顶部工具栏上的 播放 ，以 40 倍长焦或 20 倍物镜捕获图像。按 Stop 并保存图像。
   2. 在顶部工具栏上，单击 视图、 分析控制、 注释和测量， 打开一个具有不同选项的面板（补充文件 C）。在 Annotation and Measurements 面板中，选择 Semiaxis 并单击 Ellipse。
   3. 在 图像搜索中，搜索更适合对象形状的轴，然后按键盘上的 Enter 键，将获取的值传输到右侧面板表格中。
   4. 对至少 10 个对象重复 步骤 6.3.3 以获得足够的数据。点击 导出到 Excel 数据表 导出数据并保存。
4. 3D Z-Stack 图像可视化和体积数值计算
   1. 在光学显微镜软件中打开使用共聚焦显微镜捕获的 3D 图像（补充文件 D）。
   2. 要查看 3D 重建，请单击图像工具栏中的 Show Volume View（显示体积视图 ）;通过单击鼠标左键，可以向任何方向旋转对象。要选择卷的一部分，请按住 ctrl + 鼠标左 键（补充文件 E）。
   3. 按键盘上的 x 按钮拍摄 3D 图像的快照并保存它。
   4. 要计算对象体积，请单击 测量，3D 对象测量 打开一个面板（补充文件，图像 F）。单击面板工具栏上的 定义 3D 阈值 ，并使用平滑和干净的过滤器（补充文件、图像 G）设置优化的阈值。单击 确定 在 3D 对象测量面板中获取不同的参数，包括体积。
   5. 点击 导出到 Excel 以导出数据并保存它们。

7. 球体数据分析

1. 对于球体体积计算，使用长椭球体近似 3D 结构，通过 2D 投影估计长轴和短轴，如图 3 的插入所示。
2. 通过比较 步骤 6.4 中所示的数值计算的体积与具有 b>a=c 的长椭球体体积公式 ，其中 a、b 和 c 是椭球体轴）来验证长椭球体近似值。
3. 计算至少 10 个椭球体的平均体积和相应的标准差。如果椭球体的体积分布是正态的，则应用 Dixon 检验来识别并拒绝异常值。此后，计算处理物和样品之间的体积比以及 图 6A 中报告的误差传播。

Dox@DDAB-MD是根据方案（第1节）开发的，如图 1所示。获得的 MD 由封装 DFP 内核的单层 DDAB 制成（图 1A）。DDAB 的阳离子电荷和超声处理程序避免了在 DFP 和水界面处堆积的 DDAB 多层层的形成²³。

CLSM 显微照片（图 1B）显示产生浓度为 1.5 x 10¹⁰ MDs /mL ...

为了提高蒽环类药物作为抗肿瘤药物的疗效，这项工作介绍了封装化疗药物阿霉素 （Dox） 的 DDAB 带壳 PFC 液滴的形成，以及这种制剂与高侵袭性三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 相互作用的作用。

建立 DOX@DDAB-MD
Dox 负载的 MD 是通过超声法配制的，具有极快、可重复性好、用户友好和高效的方案。这种方法可以获得以约 1 μm 为中心的非常窄尺...

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

人权/动物权利：本文不包含任何作者对人类或动物受试者进行的任何研究。

这项工作已获得欧盟 Horizon 2020 研究和创新计划的资助，根据赠款协议 AMPHORA （766456）。