Бактериальные патогены используют факторы вирулентности для колонизации различных ниш в организме хозяина. Мы работаем над тем, чтобы понять, как бактериальные патогены воспринимают специфические сигналы окружающей среды в тканях хозяина для регулирования экспрессии фактора вирулентности. Патоген человека Yersinia pseudotuberculosis использует фактор вирулентности системы секреции третьего типа для введения эффекторных белков в клетки-хозяева.
Система секреции третьего типа позволяет бактериям подрывать защитные механизмы хозяина и колонизировать ткани хозяина. Тем не менее, экспрессия секреционной системы Yersinia III типа метаболически обременительна, поэтому экспрессия генов секреционной системы третьего типа строго регулируется в ответ на сигналы окружающей среды, такие как температура. Наши предыдущие публикации показали, что экспрессия секреционной системы Yersinia III типа контролируется наличием железа и напряжением кислорода через транскрипционный фактор, называемый ISCR.
Эти результаты важны, потому что Yersinia колонизирует ткани хозяина, которые различаются по содержанию железа и напряжению кислорода. Например, просвет кишечника содержит достаточное количество железа для роста иерсинии, но имеет низкое напряжение кислорода. Напротив, такие ткани, как кровь, имеют очень низкую доступность железа, но более высокое напряжение кислорода.
Наш метод позволяет нам выращивать Yersinia в условиях культивирования, которые различаются по количеству доступного железа и кислорода, чтобы изучить, как эти сигналы окружающей среды влияют на экспрессию системы секреции третьего типа. Этот метод поможет нам определить молекулярный механизм, с помощью которого доступность железа и кислорода контролирует экспрессию секреционной системы третьего типа, и поможет нам понять, как это контролирует исход инфекции Yersinia. Для начала разбейте Yersinia Pseudo tuberculosis на бульоне Lysogeny агаровыми пластинами.
Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 48 часов. Как только сформируются видимые колонии, инокулируйте одну изолированную колонию в четыре миллилитра среды M9. Культивируйте его в течение ночи при температуре 26 градусов Цельсия с аэрацией при 250 оборотах в минуту.
Поместите кювету, содержащую культуру, в спектрометр, затем разведите культуру в 14 миллилитрах стерильной хелатной среды M9 без добавления железа до достижения значения OD600 0,1. Поместите колбы в шейкер с температурой 26 градусов Цельсия и выдерживайте в течение восьми часов. После завершения инкубации используйте культуру для начала трех свежих культур; два для анаэробного роста и один для аэробного роста.
Для аэробного культивирования разбавьте культуру до значения OD600 0,1 в 14 мл стерильной хелатной среды M9 без добавления железа. Затем культуру с аэрацией при 26 градусах Цельсия в течение 12 часов. Для анаэробного культивирования разведите культуру в 14 миллилитрах стерильной хелатной среды М9 в двух стеклянных пробирках, промытых кислотой.
В первую пробирку добавьте стерилизованный фильтром сульфат железа до конечной концентрации один миллиграмм на литр. Во вторую пробирку добавьте сульфат железа до конечной концентрации 0,01 миллиграмм на литр. Инкубируйте обе пробирки в анаэробной камере при комнатной температуре в течение 12 часов.
Затем индуцируйте активность системы секреции третьего типа, сдвигая анаэробные культуры до 37 градусов Цельсия, и продолжайте инкубацию в течение четырех часов. Затем разбавьте аэробно растущие культуры до значения OD600 0,2, добавив 14 миллилитров хелатированной среды M9 в две промытые кислотой колбы. Добавьте в колбы сульфат железа в необходимых конечных концентрациях.
Инкубируйте обе колбы с аэрацией при 26 градусах Цельсия при 250 об/мин в течение двух часов. Через два часа переместите культуры до 37 градусов Цельсия с аэрацией при 250 об/мин в течение четырех часов, чтобы вызвать активность системы секреции третьего типа. После индукции системы секреции третьего типа у Yersinia pseudotuberculosis нормализованные объемы этой культуры переносят в 15-миллилитровые пробирки.
Добавьте четыре микролитра бычьего сывороточного альбумина в каждую пробирку в качестве контроля осаждения белка. Центрифугируйте культуры при 3 200 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Отфильтруйте надосадочную жидкость в свежую 15-миллилитровую пробирку с помощью фильтра PVDF 0,22 микрона, прикрепленного к шприцу.
Затем добавьте трихлоруксусную кислоту в эквиваленте 10% от объема надосадочной жидкости. Энергично закручивайте трубки в течение одной минуты. Инкубируйте трубки на льду в холодном помещении при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.
Затем добавьте по два миллилитра каждого образца в двухмиллилитровую пробирку, затем центрифугируйте при 21 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью вакуумной насадки. Повторите пипетирование двух миллилитров образца в ту же пробирку, центрифугируйте и отаскайте надосадочную жидкость.
Закрепите реакции осаждения в одной двухмиллилитровой пробирке. Промойте гранулы одним миллилитром ледяного 100% ацетона с последующим центрифугированием и аспирацией надосадочной жидкости. Сняв надосадочную жидкость в последний раз, просушите гранулу на скамейке в течение одного часа.
Осажденный белок должен выглядеть как дымка вдоль боковой части трубки. Затем повторно суспендируйте каждую гранулу в 50 микролитрах раствора F-S-B-DTT. Тщательно взбейте вихрь в течение одной минуты.
Далее прокипятите образцы на термоблоке при температуре 95 градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем кратковременно центрифугируйте на максимальной скорости при комнатной температуре. Загрузите 15 микролитров каждого анаэробного образца и 10 микролитров каждого аэробного образца в 12,5% гель SDS-PAGE для анализа.
После того, как прогон геля будет завершен, используйте окрашивание серебром, чтобы визуализировать белки на геле. Для начала поместите гель SDS-PAGE, содержащий отделенные аэробные образцы псевдотуберкулеза Yersinia, в систему визуализации. В программном обеспечении выберите полосы, представляющие эффекторный белок системы секреции третьего типа, YopE, во всех лунках.
Установите референсный диапазон YopE на соответствующий образец. Экспортируйте рассчитанные программным обеспечением относительные количественные значения для всех диапазонов YopE. Затем выберите все полосы BSA во всех скважинах.
Убедитесь, что эталонный канал BSA совпадает с образцом эталонного диапазона YopE. Экспорт относительных количественных значений для всех каналов BSA. Разделите значение YopE на значение BSA для каждого условия, чтобы получить нормализованные результаты.
Окрашенный серебром гель SDS-PAGE показал, что в анаэробных образцах в образцах с низким содержанием железа присутствовало в 38 раз больше YopE по сравнению с образцами с высоким содержанием железа. В аэробных образцах эти белки секретировались почти в одинаковых количествах.
