פתוגנים חיידקיים משתמשים בגורמי אלימות כדי ליישב נישות שונות בתוך האורגניזם המארח. אנו עובדים כדי להבין כיצד פתוגנים חיידקיים חשים רמזים סביבתיים ספציפיים ברקמות המארח כדי לווסת את ביטוי גורמי האלימות. הפתוגן האנושי Yersinia pseudotuberculosis משתמש בגורם האלימות של מערכת ההפרשה מסוג 3 כדי להזריק חלבוני אפקטור לתאי המארח.
מערכת ההפרשה מסוג 3 מאפשרת לחיידקים לחתור תחת מנגנוני ההגנה של המארח וליישב רקמות מארח. עם זאת, הביטוי של מערכת ההפרשה של ירסיניה סוג III הוא מכביד מבחינה מטבולית, ולכן הביטוי של גנים של מערכת ההפרשה מסוג 3 מווסת בקפדנות בתגובה לרמזים סביבתיים כמו טמפרטורה. הפרסומים הקודמים שלנו הראו כי ביטוי מערכת ההפרשה של Yersinia Type III נשלט על ידי זמינות ברזל ומתח חמצן באמצעות גורם שעתוק הנקרא ISCR.
ממצאים אלה משמעותיים מכיוון שירסניה מתיישבת ברקמות מארח המשתנות בתכולת הברזל ובמתח החמצן שלהן. לדוגמה, לומן המעי מכיל מספיק ברזל לצמיחת ירסיניה אך יש לו מתח חמצן נמוך. לעומת זאת, לרקמות כמו הדם יש זמינות ברזל נמוכה מאוד אך מתח חמצן גבוה יותר.
השיטה שלנו מאפשרת לנו לגדל ירסיניה בתנאי תרבית המשתנים בכמות הברזל והחמצן הזמינים, כדי לחקור כיצד רמזים סביבתיים אלה משפיעים על ביטוי מערכת ההפרשה מסוג 3. שיטה זו תעזור לנו לקבוע את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו זמינות הברזל והחמצן שולטת בביטוי של מערכת ההפרשה מסוג 3, ותעזור לנו להבין כיצד היא שולטת בתוצאה של זיהום ירסיניה. כדי להתחיל, פס את Yersinia Pseudo tuberculosis על צלחות אגר מרק ליזוגני.
דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. לאחר שנוצרות מושבות גלויות, חסנו מושבה מבודדת אחת לארבעה מיליליטר של מדיה M9. תרבית אותו למשך הלילה ב-26 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד.
מניחים קובטה המכילה את התרבית בספקטרומטר, ולאחר מכן מדללים את התרבית ב-14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית ללא תוספת ברזל כדי להשיג ערך OD600 של 0.1. מניחים את הצלוחיות בשייקר של 26 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך שמונה שעות. לאחר השלמת הדגירה, השתמש בתרבות כדי להתחיל שלוש תרבויות טריות; שניים לצמיחה אנאירובית ואחד לצמיחה אירובית.
לתרבית אירובית, יש לדלל את התרבית לערך OD600 של 0.1 ב-14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית ללא תוספת ברזל. לאחר מכן, תרבית עם אוורור ב -26 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לתרבות אנאירובית, יש לדלל את התרבית ב -14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית בצורת כלאט לשני צינורות זכוכית שטופים בחומצה.
בצינור הראשון, הוסף ברזל גופרתי מעוקר פילטר לריכוז סופי של מיליגרם אחד לליטר. בצינור השני מוסיפים ברזל גופרתי לריכוז סופי של 0.01 מיליגרם לליטר. דגרו את שני הצינורות בתא אנאירובי בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
לאחר מכן, גרמו לפעילות מערכת ההפרשה מסוג 3 על ידי העברת התרביות האנאירוביות ל-37 מעלות צלזיוס, והמשך הדגירה במשך ארבע שעות. לאחר מכן, יש לדלל את תרביות הגידול האירובי לערך OD600 של 0.2 על ידי הוספת 14 מיליליטר של מדיה M9 כלאטית לשתי צלוחיות שטופות בחומצה. הוסף ברזל גופרתי בריכוזים הסופיים הנדרשים לצלוחיות.
דגרו את שתי הצלוחיות עם אוורור ב-26 מעלות צלזיוס ב-250 סל"ד למשך שעתיים. לאחר שעתיים, העבירו את התרביות ל-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד למשך ארבע שעות כדי לגרום לפעילות מערכת הפרשה מסוג 3. לאחר השראת מערכת ההפרשה מסוג שלוש בפסאודוטוברקולוזיס של ירסיניה, העבירו נפחים מנורמלים של תרבית זו שהודגרו לצינורות של 15 מיליליטר.
הוסף ארבעה מיקרוליטרים של אלבומין בסרום בקר לכל צינור כבקרת משקעים חלבון. צנטריפוגה את התרבויות ב -3, 200 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מסננים את הסופרנטנט לצינור טרי של 15 מיליליטר באמצעות מסנן PVDF 0.22 מיקרון המחובר למזרק.
לאחר מכן, הוסף חומצה טריכלורואצטית השווה ל-10% מנפח העל. מערבל את הצינורות במרץ למשך דקה אחת. דגרו את הצינורות על קרח בחדר קר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר מכל דגימה לצינור של שני מיליליטר, ואז צנטריפוגה ב -21, 000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט באמצעות חיבור ואקום. חזור על פיפטינג של שני מיליליטר של דגימה לאותו צינור, צנטריפוגה, ושאף את הסופרנטנט.
אחד את תגובות המשקעים לצינור יחיד של שני מיליליטר. שטפו את הכדורים עם מיליליטר אחד של 100% אצטון קר כקרח ואחריו צנטריפוגה ושאיפת סופרנטנט. לאחר הסרת הסופרנטנט בפעם האחרונה, יבש את הגלולה על הספסל למשך שעה.
החלבון המשקע אמור להיראות כמו אובך לאורך צד הצינור. לאחר מכן, השעו מחדש כל כדור ב-50 מיקרוליטר של תמיסת F-S-B-DTT. מערבולת היטב למשך דקה אחת.
לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות על גוש חום בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה לזמן קצר במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר. טען 15 מיקרוליטר מכל דגימה אנאירובית ו-10 מיקרוליטר מכל דגימה אירובית לג'ל SDS-PAGE של 12.5% לניתוח.
לאחר השלמת ריצת הג'ל, השתמש בצביעת כסף כדי לדמיין חלבונים על הג'ל. כדי להתחיל, הנח ג'ל SDS-PAGE המכיל דגימות אירוביות מופרדות של Yersinia pseudotuberculosis במערכת הדמיה. בתוכנה, בחר את הרצועות המייצגות את חלבון אפקטור מערכת ההפרשה מסוג שלוש, YopE, על פני כל הבארות.
הגדר את רצועת ה-YopE ההתייחסות לדגימה המתאימה. ייצא את ערכי הכימות היחסיים המחושבים על ידי תוכנה עבור כל רצועות ה-YopE. לאחר מכן, בחר את כל רצועות ה-BSA בכל הבארות.
ודא שרצועת ה-BSA הייחוס תואמת את הדגימה של רצועת ה-YopE הייחוס. ייצא את ערכי הכימות היחסיים עבור כל רצועות ה- BSA. חלקו את ערך ה-YopE בערך ה-BSA עבור כל תנאי כדי להפיק תוצאות מנורמלות.
ג'ל SDS-PAGE מוכתם בכסף גילה כי בדגימות האנאירוביות, פי 38 יותר YopE היה נוכח בדגימות הברזל הנמוכות בהשוואה לדגימות הברזל הגבוהות. בדגימות האירוביות, חלבונים אלה הופרשו בכמויות כמעט דומות.
