Los patógenos bacterianos utilizan factores de virulencia para colonizar diferentes nichos dentro del organismo huésped. Estamos trabajando para comprender cómo los patógenos bacterianos detectan señales ambientales específicas en los tejidos del huésped para regular la expresión del factor de virulencia. El patógeno humano Yersinia pseudotuberculosis utiliza el factor de virulencia del sistema de secreción de tipo tres para inyectar proteínas efectoras en las células huésped.
El sistema de secreción de tipo tres permite a las bacterias subvertir los mecanismos de defensa del huésped y colonizar los tejidos del huésped. Sin embargo, la expresión del sistema de secreción de Yersinia tipo III es metabólicamente onerosa, por lo que la expresión de los genes del sistema de secreción de tipo tres está estrictamente regulada en respuesta a señales ambientales como la temperatura. Nuestras publicaciones previas mostraron que la expresión del sistema de secreción de Yersinia Tipo III está controlada por la disponibilidad de hierro y la tensión de oxígeno a través de un factor de transcripción llamado ISCR.
Estos hallazgos son significativos porque Yersinia coloniza tejidos huéspedes que varían en su contenido de hierro y tensión de oxígeno. Por ejemplo, el lumen intestinal contiene suficiente hierro para el crecimiento de Yersinia, pero tiene una baja tensión de oxígeno. Por el contrario, los tejidos como la sangre tienen una disponibilidad de hierro muy baja pero una tensión de oxígeno más alta.
Nuestro método nos permite cultivar Yersinia en condiciones de cultivo que varían en la cantidad de hierro y oxígeno disponibles, para estudiar cómo estas señales ambientales afectan la expresión del sistema de secreción tipo tres. Este método nos ayudará a determinar el mecanismo molecular por el cual la disponibilidad de hierro y oxígeno controla la expresión del sistema de secreción tipo tres, y nos ayudará a comprender cómo esto controla el resultado de la infección por Yersinia. Para empezar, rayar Yersinia Pseudo tuberculosis en placas de agar caldo de Lysogeny.
Incubar las placas a temperatura ambiente durante 48 horas. Una vez que se forman colonias visibles, inocular una sola colonia aislada en cuatro mililitros de medio M9. Cultive durante la noche a 26 grados centígrados con aireación a 250 RPM.
Coloque una cubeta que contenga el cultivo en un espectrómetro, luego diluya el cultivo en 14 mililitros de medios M9 quelatados estériles sin suplementación con hierro para lograr un valor OD600 de 0,1. Coloque los matraces en un agitador a 26 grados centígrados e incube durante ocho horas. Una vez completada la incubación, use el cultivo para iniciar tres cultivos nuevos; dos para el crecimiento anaeróbico y uno para el crecimiento aeróbico.
Para el cultivo aeróbico, diluir el cultivo hasta un valor de OD600 de 0,1 en 14 mililitros de medios M9 quelados estériles sin suplementación con hierro. Luego, cultivo con aireación a 26 grados centígrados durante 12 horas. Para el cultivo anaeróbico, diluir el cultivo en 14 mililitros de medio M9 quelado estéril en dos tubos de vidrio lavados con ácido.
En el primer tubo, agregue sulfato de hierro esterilizado con filtro hasta una concentración final de un miligramo por litro. En el segundo tubo, agregue sulfato de hierro para obtener una concentración final de 0,01 miligramos por litro. Incubar ambos tubos en una cámara anaeróbica a temperatura ambiente durante 12 horas.
A continuación, inducir la actividad del sistema de secreción de tipo tres cambiando los cultivos anaeróbicos a 37 grados centígrados y continuando la incubación durante cuatro horas. A continuación, diluya los cultivos en crecimiento aeróbico hasta un valor OD600 de 0,2 añadiendo 14 mililitros de medio M9 quelado en dos matraces lavados con ácido. Añada sulfato de hierro a los matraces en las concentraciones finales requeridas.
Incubar ambos matraces con aireación a 26 grados centígrados a 250 RPM durante dos horas. Después de dos horas, cambie los cultivos a 37 grados Celsius con aireación a 250 RPM durante cuatro horas para inducir la actividad del sistema de secreción tipo tres. Después de inducir el sistema de secreción tipo tres en Yersinia pseudotuberculosis, se transfieren volúmenes normalizados de este cultivo incubado en tubos de 15 mililitros.
Añadir cuatro microlitros de albúmina sérica bovina a cada tubo como control de la precipitación de proteínas. Centrifugar los cultivos a 3.200 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Filtre el sobrenadante en un tubo nuevo de 15 mililitros utilizando un filtro de PVDF de 0,22 micras conectado a una jeringa.
A continuación, añadir ácido tricloroacético equivalente al 10% del volumen del sobrenadante. Agita los tubos vigorosamente durante un minuto. Incubar los tubos en hielo en una cámara frigorífica a cuatro grados centígrados durante la noche.
A continuación, agregue dos mililitros de cada muestra a un tubo de dos mililitros, luego centrifugue a 21.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante con un accesorio de vacío. Repita el pipeteo de dos mililitros de muestra en el mismo tubo, centrifugar y aspirar el sobrenadante.
Consolide las reacciones de precipitación en un solo tubo de dos mililitros. Lavar los pellets con un mililitro de acetona 100% helada seguido de centrifugación y aspiración de sobrenadante. Después de retirar el sobrenadante por última vez, seque el pellet en el banco durante una hora.
La proteína precipitada debe verse como una neblina a lo largo del costado del tubo. Luego, vuelva a suspender cada pellet en 50 microlitros de solución F-S-B-DTT. Vórtice a fondo durante un minuto.
A continuación, hierva las muestras en un bloque de calor a 95 grados centígrados durante 15 minutos. Luego, centrifugar brevemente a velocidad máxima a temperatura ambiente. Cargue 15 microlitros de cada muestra anaeróbica y 10 microlitros de cada muestra aeróbica en un gel SDS-PAGE al 12,5 % para su análisis.
Una vez completada la ejecución del gel, use la tinción de plata para visualizar las proteínas en el gel. Para comenzar, coloque un gel SDS-PAGE que contenga muestras aeróbicas separadas de Yersinia pseudotuberculosis en un sistema de imágenes. En el software, seleccione las bandas que representan la proteína efectora del sistema de secreción tipo tres, YopE, en todos los pocillos.
Establezca la banda YopE de referencia en la muestra adecuada. Exporte los valores de cuantificación relativos calculados por software para todas las bandas de YopE. A continuación, seleccione todas las bandas de BSA en todos los pozos.
Asegúrese de que la banda BSA de referencia coincida con la muestra de la banda YopE de referencia. Exporte los valores de cuantificación relativos para todas las bandas BSA. Divida el valor de YopE por el valor de BSA para cada condición para producir resultados normalizados.
El gel SDS-PAGE teñido de plata reveló que en las muestras anaeróbicas, había 38 veces más YopE en las muestras con bajo contenido de hierro en comparación con las muestras con alto contenido de hierro. En las muestras aeróbicas, estas proteínas se secretaron en cantidades casi similares.
