Иммуногистохимическое окрашивание мозга мышей является широко используемым методом в исследованиях нейробиологии. Тем не менее, качество, надежность и воспроизводимость результатов гистологии мозга могут варьироваться у разных исследователей и лабораторий. Представлена устоявшаяся методология гистологических исследований мозга мышей, которая доказала свою воспроизводимость, надежность и эффективность.
Помочь в демонстрации процедуры будет доктор Чунмей Ванг, доцент из моей лаборатории После подтверждения успешной анестезии у восьми-16-недельной мыши C57 black/6J, зафиксируйте мышь на пенопластовой доске и сделайте продольный поверхностный разрез вдоль средней линии над грудной клеткой и животом, затем отодвиньте кожу в сторону, чтобы обнажить мышечную стенку грудной клетки и живота. Далее сделайте разрез в мышечном слое, чтобы обнажить печень и кишечник. Затем, используя ножницы, разрезайте грудную клетку, чтобы открыть грудную клетку и обнажить сердце и легкие.
Используя гемостатические щипцы, оттяните грудную клетку в сторону, чтобы расширить рабочую зону. Следующий. поместить перфузионную канюлю, непосредственно проникнуть в левый желудочек сердца тупой канюлей и аккуратно вставить ее в восходящую аорту. Поместите штифты вокруг соединения канюли и спаренной трубки на пенопластовой доске, чтобы закрепить канюлю на месте во время перфузии, и приступайте к разрезанию правого предсердия, чтобы обеспечить отток крови из кровообращения.
Для перфузии физиологическим раствором включите переключатель давления физиологического раствора и перфицитируйте мышь транскардиально с 40-60 миллилитрами физиологического раствора. Внимательно наблюдайте за оттоком из правого предсердия и цветом печени. Затем, чтобы перфузировать с формалином, выключите переключатель давления физиологического раствора и включите переключатель давления формалина, чтобы перфузить мышь 40 миллилитрами 10% нейтрально-буферизованного формалина.
Понаблюдайте за конечностями животного на наличие признаков тремора. Для изоляции мозга используйте ножницы, чтобы удалить голову и сделать разрез средней линии вдоль покрова, чтобы обнажить череп, а затем обрезать кожу и прикрепление мышц. Далее сделайте разрез на орбитальном гребне и поместите острый конец ножниц радужной оболочки в отверстие magnum.
Выдвигайте ножницы вдоль внутренней поверхности черепа, поддерживая давление вверх, чтобы избежать повреждения мозга. Затем осторожно удалите теменные и лобные кости и мозговые оболочки, прежде чем удалить мозг из открытого черепа. Поместите сухой лед поверх пластины регулировки высоты скользящего микротома и подождите, пока не будет виден белый иней, затем аккуратно распределите пять миллилитров 30% сахарозы поверх пластины, чтобы сформировать твердый базовый слой после замерзания сахарозы.
Затем поместите все образцы мозга горизонтально в линию поверх основания сахарозы с 500 микролитрами 30% сахарозы. После пяти-10 минут замораживания, когда мозг стал твердым и белым, обрежьте мозг до тех пор, пока не будет достигнут желаемый слой или область, затем переключитесь из режима обрезки в режим подачи и разреза ткани мозга, чтобы генерировать участки толщиной 25 микрометров. Затем подготовьте 48-луночную пластину, заполненную PBS, и отметьте пять лунок для одного мозга мыши.
Используя кисть, соберите один участок и поместите его в один колодец, затем соберите следующий участок той же мыши и поместите его во второй колодец. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будет достигнута пятая скважина, разместив секции от шести до 10 в первой-пятой скважине и так далее. Поместите клеточный ситечко в одну лунку из шестилуночной пластины клеточной культуры, заполненной PBS, и, используя кисть, перенесите одну серию участков мозга в клеточный ситечко.
Промыть эти участки в PBS, перенеся клеточный ситечко в другой колодец, заполненный PBS на шейкере. Затем переместите участки мозга из клеточного ситечка в 1,5-миллилитрную трубку, содержащую один миллилитр меченого биотином WFA, и инкубируйте на качающейся платформе со скоростью 50 оборотов в минуту в течение ночи. На следующий день промыть участки мозга PBS, как показано ранее, затем перенести срезы в трубку, содержащую один миллилитр раствора стрептавидина дневного света 488, и инкубировать в течение двух часов на качающейся платформе.
После повторного промывания участков мозга PBS, инкубируйте их в блокирующем буфере в течение двух часов с последующей инкубацией в первичном антителе в течение ночи на качающейся платформе. На следующий день, после полосканий PBS, инкубируют срезы во вторичных антителах в течение двух часов. Наполните две чашки Петри 100 миллилитрами PBS и перенесите все участки мозга из одного ситечка в первую чашку.
Выровняйте участки мозга в нейроанатомическом порядке от каудального до рострального. Затем погрузите один слайд во второе блюдо с одним концом, слегка наклоненным подставкой, и, используя тонкую кисть, аккуратно поместите секцию мозга чуть ниже интерфейса воздушного буфера на наклоненный слайд. Затем, используя передаточную пипетку, медленно и осторожно снимите буфер, чтобы понизить его уровень, пока участок мозга не окажется полностью над интерфейсом воздушного буфера.
Продолжайте повторять этот процесс до тех пор, пока не будет достигнута нижняя часть слайда и все секции не будут установлены на слайде. Для получения изображений включите сканер и компьютер, затем поместите слайды в держатель слайдов с загрузочным устройством и вставьте держатель в сканер. Откройте программное обеспечение для сканера и выберите соответствующее место хранения и профиль сканирования.
Запустите сканирование предварительного просмотра, нажав кнопку Начать предварительное сканирование. После сканирования откройте мастер обнаружения тканей и обведите по кругу области, представляющие интерес для визуализации. После выбора регионов для визуализации нажмите кнопку «Начать сканирование» и дождитесь завершения сканирования машиной.
Проверьте файл результатов и экспортируйте изображения. Здесь показаны репрезентативные флуоресцентные иммуногистохимические изображения корональных участков мозга мыши в Брегма-отрицательных 0,82 миллиметра, отображающие распределение глицинии floribunda agglutinin, аргинина вазопрессина и DAPI. Сигналы глистении флорибунда агглютинина наблюдаются в перифорнической области переднего гипоталамуса и ретикулярного ядра, тогда как сигналы аргинина вазопрессина наблюдаются в паравентрикулярном ядре.
При первом испытании этого протокола мы предлагаем выполнять его под наблюдением опытного исследователя. Протокол поможет генерировать оптимальные и последовательные гистологические результаты среди различных исследователей и лабораторий, а также послужит ориентиром для начинающих, изучающих эту технику.
