Этот протокол сочетает в себе флуоресцентную РНК-гибридизацию in situ и иммуногистохимию с использованием свежезамороженных или фиксированных препаратов мозга. Этот метод обеспечивает гибкость, демонстрируя комбинацию высокочувствительных методов гибридизации in situ и иммуногистохимии для пространственной визуализации РНК и белковых мишеней в одном и том же образце ткани. Этот метод применим для мультиплексного мечения в срезе тканей мозга, помогая исследовать пространственную организацию и функциональную значимость мРНК и белков в гетерогенных популяциях нейронов в нейронауке.
Этот протокол в основном фокусируется на этапах обработки свежезамороженных тканей и фиксированных тканей с параформальдегидом. Чтобы начать секционирование свежезамороженной ткани мозга, прикрепите ее к предварительно охлажденному патрону криостата и вырежьте корональные срезы толщиной 14 микрометров. Установите срез на предметное стекло для микроскопии.
Переместите смонтированный слайд в коробку для скольжения. Затем транспортируйте коробку в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию на сухом льду. Для фиксации тканей процеживают приготовленный раствор параформальдегида.
Остудите его до 4 градусов по Цельсию. Вытащите смонтированное предметное стекло из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов по Цельсию на сухом льду и сразу же погрузите его в предварительно охлажденный раствор параформальдегида на 15 минут, Выполните обезвоживание свежезамороженной ткани, чтобы убедиться, что предметное стекло полностью высохло. После извлечения головного мозга из транскардиально профузионной фиксированной монтировки с помощью вибрирующего микротома вырезают срезы тканей толщиной 30 микрометров.
Срезанные срезы хранить в растворе криопротектора. В день проведения анализа FISH переложите свободно плавающую секцию в 12-луночную планшет для культивирования клеток, содержащую 0,1 молярного PBS, и перемешайте его при 90-100 об/мин на вращающемся платформенном шейкере, чтобы смыть криопротектор. Затем с помощью кисти установите срез плашмя на предметное стекло для микроскопии, чтобы предотвратить отслоение во время стирки, и сушите на воздухе не менее двух часов.
С помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте гидрофобный барьер вокруг участка, в котором будут содержаться реагенты FISH. После предварительной обработки ткань инкубируют в растворе протеазы и гибридизируют с зондами RNAscope в течение двух часов в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проводят последовательные этапы амплификации и флуоресцентную иммуногистохимию.
Начните с подготовки увлажненной светозащищенной камеры для инкубации предметных стекол. На водяной бане прогрейте 50-кратный промывочный буфер и зонды до 40 градусов Цельсия в течение 10 минут. После охлаждения до комнатной температуры приготовьте один литр буфера для промывки 1X из концентрации бульона 50X.
Приготовьте зондовую смесь, как описано в текстовой рукописи. Для лечения протеиназой добавьте протеиназу 3 на срез ткани и инкубируйте его при комнатной температуре в течение 30 минут. Чтобы смыть протеиназу, осторожно погрузите предметное стекло в 0,1 молярного PBS при комнатной температуре, избегая смещения секции.
Для гибридизации добавьте зондовую смесь на срез ткани. Поместите его в увлажненную предварительно прогретую камеру. Затем выдержите его в течение двух часов при температуре 40 градусов по Цельсию.
Промойте срез ткани буфером для стирки дважды в течение двух минут. Для усиления сигнала, используя флакон-капельницу, добавьте раствор для усиления, чтобы покрыть участок ткани, и инкубируйте, как описано в тексте. Добавьте блокирующий раствор на срез ткани и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
Проведите пальцем по слайду, чтобы удалить лишний блокирующий буфер после инкубации. Теперь инкубируйте срез с первичными антителами в течение ночи при температуре 4 градуса по Цельсию. На следующий день промойте предметное стекло три раза 1X TBS.
Добавьте вторичное антитело и инкубируйте срезы в течение двух часов при комнатной температуре. Исследуйте предметное стекло под эпифлуоресцентным микроскопом, оснащенным камерой. Получение репрезентативных изображений с 20-кратным увеличением и сохранение их в виде файлов TIF.
В настоящем исследовании качество, целостность тканей и отсутствие бактериальной контаминации были подтверждены отсутствием маркировки DAPI. Маркировка с помощью положительных контрольных зондов, нацеленных на убиквитин С, пептидилпролилизомеразу В и мРНК полимеразы IIA, подтвердила целостность РНК. В свежезамороженных препаратах для дифференциации мРНК-позитивных нейронов GalR1 в пределах NTS использовали дополнительные нейрохимические маркеры.
Мембраносвязанный везикулярный транспортер был четко промаркирован. Напротив, цитоплазматические белки, такие как тирозингидроксилаза и GFP, экспрессируемые под контролем промотора PHOX2B, слабо наблюдались и описывались как флокулянты, поскольку у них не было четких очертаний. Маркировка цитоплазматической мРНК GalR1 зондом GalR1 зондом GalR1 была точечной и четко наблюдаемой.
Для подтверждения того, что качество иммуногистохимии зависит от субклеточной локализации белка, в одних и тех же срезах ткани параллельно с FISH были мечены различные ядерные и цитоплазматические белки. Цитоплазматический PHOX2B GFP имел хлопьевидный вид. В то время как сигнал ядерного белка PHOX2B был четким, что подтверждало более высокое качество иммуномечения в сочетании с FISH.
При проведении на фиксированных замороженных срезах в комбинации с FISH иммуногистохимия была достоверной независимо от субклеточной локализации. МРНК-позитивные нейроны GlyT2 располагались вентрально по отношению к NTS, а не внутри NTS. МРНК-позитивные нейроны GlyT2 и мРНК-позитивные PHOX2B не локализуются.
Субпопуляция мРНК-позитивных NTS-нейронов PHOX2B была иммунореактивной к тирозингидроксилазе, и ни одна из них не содержала мРНК GlyT2. РНК-скоп позволяет визуализировать и анализировать распределение РНК с разрешением одной молекулы в клетках и тканях. Это позволяет проводить исследования новых видов РНК, механизмов заболеваний, паттернов экспрессии генов, разнообразия нейронов и клеточных взаимодействий.
