マウス脳のフリーフローティング免疫染色

マウス脳の免疫-検査染色は、神経科学研究で一般的に使用される技術です。しかし、脳組織学の結果の質、信頼性、再現性は、研究者や研究室によって異なる場合があります。我々は、再現性、信頼性、および効率的であることが証明されたマウス脳の組織学的研究のための確立された方法論を提示する。

手順を実証するのを助けることは、私の研究室の助教授であるチュンメイ・ワン博士で、8〜16週齢のC57ブラック/6Jマウスで麻酔に成功したことを確認した後、泡板にマウスを固定し、胸郭と腹部の上に正中線に沿って縦方向の表面的な切開を行い、皮膚を脇に移動して壁の筋肉を露出させます。次に、筋肉層を切開して肝臓と腸を露出させる。その後、はさみを使用して胸部を切って胸郭を開き、心臓と肺を露出します。

止血鉗子を使用して、胸部を脇に引っ張って作業領域を広げます。次に。灌流カニューレを配置するには、鈍いカニューレで左心室を直接貫通し、慎重に上昇大根に挿入します。カニューレと結合チューブの接続体の周りにピンを置き、発流中にカニューレを所定の位置に固定し、右心房を切断して循環からの血液の流出を可能にします。

生理食塩水を使用する場合は、生理食塩水スイッチをオンにし、40〜60ミリリットルの生理食塩水でマウスを心腔内に浸透させます。右心房からの流出と肝臓の色を注意深く観察します。次に、ホルマリンをパーフューズするには、生理食塩水圧力スイッチをオフにし、ホルマリン圧力スイッチをオンにして、マウスに10%中性緩衝ホルマリンの40ミリリットルを浸透させます。

揺れの証拠のために動物の手足を観察してください。脳を隔離するには、はさみを使用して頭を取り除き、インテグメントに沿って中間線の切開を行い、頭蓋骨を露出させ、皮膚と筋肉の付着を切り取ります。次に、軌道尾根でカットを行い、虹彩はさみの鋭い端を奥のマグナムに入れる。

頭蓋の内面に沿ってはさみを進め、脳の損傷を避けるために上圧を維持する。次に、頭頂部と前頭骨および髄膜を慎重に取り除き、開いた頭蓋骨から脳を取り除きます。スライディングミクロトームの高さ調整プレートの上にドライアイスを置き、白霜が見えるまで待ち、プレートの上に30%スクロースの5ミリリットルを慎重に広げ、スクロースが凍結した後に固体ベース層を形成する。

次に、30%スクロースの500マイクロリットルを持つスクロースベースの上に水平にすべての脳サンプルを配置します。凍結の5〜10分後、脳が硬く白くなったら、目的の層または領域に達するまで脳をトリミングし、次に、トリムモードからフィードモードに切り替え、脳組織を切り離して25マイクロメートル厚い切片を生成する。次に、PBSで満たされた48ウェルプレートを準備し、1つのマウス脳に5つの井戸をマークします。

ペイントブラシを使用して、1つのセクションを収集し、1つの井戸に配置し、同じマウスの後続のセクションを収集し、2番目の井戸に配置します。5番目のウェルに達するまで手順を繰り返し、第1~5ウェルにセクション6~10を配置します。PBSで満たされた6ウェルの細胞培養プレートの1つの井戸に細胞ストレーナーを入れ、絵筆を使用して、一連の脳切片を細胞ストレーナーに移します。

シェーカー上のPBSで満たされた別のよく細胞ストレーナーに移すことによって、PBSでこれらのセクションをすすいだ。次に、細胞ストレーナーから1ミリリットルのビオチン標識WFAを含む1.5ミリリットルのチューブに脳切片を移し、一晩で50 RPMのロッキングプラットフォームでインキュベートする。翌日、先に示したようにPBSで脳切片をすすいでから、1ミリリットルのストレプトアビジン-デイライト488溶液を含むチューブに切片を移し、ロッキングプラットフォームで2時間インキュベートする。

脳切片を再びPBSで洗い込んだ後、2時間ブロッキングバッファにインキュベートし、続いて一次抗体のインキュベーションを一晩揺るがすプラットフォームでインキュベートします。翌日、PBSリンスに続いて、二次抗体中の切片を2時間インキュベートする。PBSの100ミリリットルで2ペトリ料理を充填し、最初の料理に1ストレーナーからすべての脳セクションを転送します。

尾部から鼻の方向に神経解剖学的順序で脳のセクションを整列させます.その後、1つのスライドをスタンドでわずかに傾けた2番目の皿に沈み、細かいペイントブラシを使用して、エアバッファインターフェイスのすぐ下に静かに脳セクションを傾けたスライドに置きます。次に、移管ピペットを使用して、ゆっくりと穏やかに緩やかにバッファを取り外し、脳部が空気緩衝インターフェースの上に完全に上がるまでそのレベルを下げる。

スライドの下部に到達し、すべてのセクションがスライドに取り付けられるまで、この手順を繰り返します。イメージングの場合は、スキャナとコンピュータの電源を入れ、スライドをローディングデバイスでスライドホルダーに置き、ホルダーをスキャナーに挿入します。スキャナーのソフトウェアを開き、適切なストレージの場所とスキャンプロファイルを選択します。

プレビュー スキャンを開始する] ボタンをクリックして、プレビュー スキャンを開始します。スキャン後、組織検出ウィザードを開き、イメージング用の対象領域を丸で囲みます。イメージングのリージョンを選択したら、[スキャンの開始]ボタンをクリックし、スキャンが完了するまで待ちます。

結果ファイルを確認し、イメージをエクスポートします。ここに示されているのは、ブレグマ陰性0.82ミリメートルにおけるコロナマウス脳切片の代表的な蛍光免疫体化学画像であり、藤フロリブンダ・アググルチニン、アルギニン・バソプレシン、およびDAPIの分布を示す。藤のフロリバンダ・アググルチニンシグナルは、前視床下部および直巣核の骨膜領域で観察され、アルギニン・バソプレシンシグナルは、パラベンタリカル核で観察される。

このプロトコルを初めて試す際には、経験豊富な研究者の監督のもとで実行することをお勧めします。このプロトコルは、異なる研究者や研究室の間で最適で一貫した組織学的結果を生成するのに役立ち、この技術を学ぶ初心者のための参考となるでしょう。