Макропиноцитоз является эндоцитарным путем, который важен для различных клеточных процессов, включая метаболизм рака. Этот протокол позволяет количественно оценить степень макропиноцитоза в клетках in vitro. Автоматизация направлена на максимизацию воспроизводимости, производительности и сокращение экспериментальных вариаций.
Кроме того, флуоресцентная микроскопия позволяет визуально осмотреть образец для определения экспериментального качества и оценки дополнительных характеристик макропиносом. Демонстрировать процедуру со мной будет Ческа Мари Галапате, научный сотрудник моей лаборатории. Для 24-луночной пластины с форматом крышки используйте щипцы, чтобы захватить один крышку из этаноловой ванны.
Прижмите крышку к внутренней стенке пластины, чтобы удалить избыток этанола, и поместите крышку плоско на дно колодца. После того, как этанол испарится, дважды промыть крышку DPBS, затем засеять клетки поверх крышки, добавив 500 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку. Поместите клетки в клеточный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом до тех пор, пока слияние клеток не достигнет 60-80% в день перед маркировкой макропиносом.
За день до маркировки макропиносом замените среду в лунках 500 микролитрами предварительно нагретых безсывороточных сред и поместите клетки в инкубатор на 16-24 часа. Для формата микропластины с 96 лунками начните с переноса клеточной суспензии в резервуар реагента объемом 25 миллилитров. Затем, используя многоканальную пипетку, засевают 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку черной 96-луночной экранирующей микропластинкой с оптически прозрачным циклическим олефиновым или стеклянным дном.
Инкубируйте клетки до тех пор, пока слияние клеток не достигнет 60-80% за день до маркировки макропиносом. За день до маркировки макропиносом удаляют и выбрасывают среду из каждой скважины с помощью многоканального аспирационного адаптера для стандартных наконечников, прикрепленных к вакуумному насосу. В качестве альтернативы может использоваться многоканальная пипетка.
Используя резервуар реагента и многоканальную пипетку, аккуратно добавьте в каждую лунку 100 микролитров предварительно подогретой безымянной среды, затем поместите клетки в клеточный инкубатор на 16-24 часа. Для 24-луночной пластины с закрытым форматом замените среду в лунках 200 микролитрами безсывороточных сред флуорофорами высокомолекулярным декстраном и поместите клетки в клеточный инкубатор на 30 минут. После инкубации аспирируйте среду и аккуратно, но быстро вымойте клетки пять раз ледяным PBS, используя предварительно охлажденную бутылку для мытья.
Крепко встряхивайте тарелку вручную во время стирки, чтобы помочь в смещении агрегатов декстрана, которые прилипают к чехлам. Далее фиксируют клетки, добавляя 350 микролитров 3,7% формальдегида и инкубируя в течение 20 минут, затем аспирируют раствор для фиксации и дважды промывают клетки PBS. Окрашивание ядер 350 микролитрами DAPI в PBS.
Через 20 минут аспирировать раствор DAPI и трижды промыть клетки PBS. Прикрепите силиконовые изоляторы бок о бок на предметном стекле микроскопа, чтобы получить равномерное расстояние и воспроизводимую локализацию крышек, необходимых для автоматизации визуализации. Затем для каждого крышки добавьте каплю упрочняющего флуоресцентного монтажного носителя на предметное стекло микроскопа в открытом пространстве изолятора.
Возьмите крышку с помощью щипцов и удалите лишний PBS, осторожно постукивая по боковой стороне чехлов на безворсовой салфетке. Затем поместите крышку вверх ногами на каплю монтажного носителя и осторожно коснитесь крышки с помощью закрытых щипцов, чтобы удалить пузырьки с монтажного носителя. Храните слайды в темной среде и дайте монтажной среде высохнуть при комнатной температуре, обычно занимая от 16 до 24 часов.
Перед визуализацией извлеките изоляторы из слайда микроскопа. После того, как слайды будут уравновешены до комнатной температуры, очистите крышки с помощью аппликатора с хлопковым наконечником, смачиваемого очистителем стекла без аммиака. Впоследствии используйте чистый аппликатор с хлопковым наконечником, смаченный 70% этанолом, чтобы очистить крышку и оставить ее сухой.
Для формата 96-луночной микропластины после аспирации скважин, как было продемонстрировано ранее, добавьте в лунки 40 микролитров свободных от сыворотки среды с флуорофорно-меченым высокомолекулярным декстраном, а затем инкубируйте клетки в клеточном инкубаторе в течение 30 минут. После инкубации отбросьте среду в микропластинке, вручную щелкнув пластиной вверх ногами в пустой пятилитровой стакан, затем дважды промойте ячейки и микропластинку, медленно погружая пластину вертикально под небольшим углом в двухлитровой стакан, наполненный ледяным PBS, и впоследствии выбрасывая PBS в микропластинку, щелкнув пластину вверх ногами в пятилитровой стакан. После последней промывки PBS зафиксируйте ячейки, добавив 100 микролитров 3,7% формальдегида в PBS в каждую скважину, используя резервуар реагента 25 миллилитров и многоканальную пипетку.
После 20-минутной инкубации при комнатной температуре удалите фиксирующий раствор и промыть клетки PBS с помощью метода погружения и фликсинга. После второй промывки PBS окрашивают ядра 100 микролитрами DAPI в PBS на лунку. Через 20 минут трижды промойте клетки ледяным PBS, как показано ранее.
Удалите все остатки PBS, нажав на микропластинку вверх ногами на безворсовую салфетку. Затем добавьте 100 микролитров свежего PBS в каждую скважину, используя резервуар реагента 25 миллилитров и многоканальную пипетку. Перед визуализацией дайте пластине уравновеситься до комнатной температуры, затем вытрите пластину клеточной культуры насухо безворсовой салфеткой.
Кроме того, храните пластину, закрытую от света, при четырех градусах Цельсия в течение одной недели. Для автоматизированной визуализации макропиносом создайте протокол автоматизации для получения изображений с воздушным объективом 40X в канале длин волны флуорофора декстрана и DAPI. Затем оптимизируйте настройки экспозиции, используя образец, который, по прогнозам, будет иметь самый высокий уровень макропиноцитоза, чтобы избежать чрезмерного воздействия, которое может привести к насыщению сигнала и потере данных интенсивности.
Используйте настройки фокусировки, которые легко и последовательно находят образец для получения высококачественных изображений. Получите несколько изображений по каждой скважине или крышке, чтобы учесть изменчивость образца и получить точное представление образца. Чтобы определить макропиноцитарный индекс, вычтите фон для DAPI и соответствующего изображения декстрана, применив соответствующую функцию, часто называемую функцией катящегося шара.
Отрегулируйте настройки таким образом, чтобы фоновый шум был сведен к минимуму с минимальным эффектом вычитания на сигнал DAPI и декстрана. Затем, используя поле с высоким декстрановым сигналом, определите настройки сигнала интенсивности, часто называемые пороговой функцией, чтобы выбрать ядра, а затем определите минимальную настройку сигнала интенсивности, необходимую для выбора только макропиносом. Для изображения декстрана рассчитайте общую флуоресценцию в пределах созданного макропиносомного выделения или используйте выделение для определения общей площади, положительной для декстрана.
Для изображения DAPI используйте выделение, чтобы определить количество ядер на изображении, чтобы отразить количество присутствующих клеток. Затем определяют макропиноцитарный индекс путем деления общей флуоресценции декстрана или площади на количество клеток, определяемое DAPI. В клетках AsPC-1 PDAK добавление EGF при 100 нанограммах на миллилитр в течение пяти минут перед добавлением декстрана активирует макропиноцитоз.
Кроме того, аутокринная активация EGF макропиноцитоза может быть вызвана лишением глутамина в течение 16-24 часов. Клетки MIA PaCa-2 демонстрируют конститутивный макропиноцитоз, который ингибируется 30-минутным лечением 75 микромолярными EIPA или двухчасовым лечением 10 микромолярной EHop-016. В эксперименте с реакцией на дозу макропиноцитарный индекс постепенно снижался при более высоких концентрациях препарата EHop-016 и EIPA, тем самым подтверждая существование конститутивного Rac1-зависимого макропиноцитоза.
Вы можете адаптировать эту процедуру для оценки макропиноцитоза других флуоресцентно помеченных грузов, таких как альбумин. Кроме того, рекомендуется оценить, способствует ли макропиноцитарное поглощение альбумина приспособленности клеток путем проведения анализов жизнеспособности клеток. Этот метод был центральным для идентификации макропиноцитарного снабжения питательными веществами в раковых и стромальных клетках, а автоматизация значительно увеличила нашу способность тестировать состояние.
