Macropinocytosis هو مسار الخلايا الداخلية التي هي مهمة لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك التمثيل الغذائي للسرطان. يسمح لك هذا البروتوكول بتحديد مدى ندرة الخلايا الكبيرة في الخلايا في المختبر. تهدف الأتمتة إلى زيادة قابلية التكرار والإنتاجية والحد من التباين التجريبي.
علاوة على ذلك ، يسمح لك الفحص المجهري الفلوري بفحص العينة بصريا لتحديد الجودة التجريبية وتقييم خصائص macropinosome الإضافية. ستوضح الإجراء معي تشيسكا ماري غالابات ، وهي مساعدة باحث من مختبري. بالنسبة للوحة المكونة من 24 بئرا بتنسيق coverslip ، استخدم الملقط للإمساك بغطاء واحد من حمام الإيثانول.
اضغط على الغطاء إلى الجدار الداخلي للصفيحة لإزالة الإيثانول الزائد ووضع الغطاء مسطحا في قاع البئر. بعد أن يتبخر الإيثانول ، اغسل الغطاء مرتين باستخدام DPBS ، ثم قم بزرع الخلايا الموجودة أعلى الغطاء عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر. ضع الخلايا في حاضنة خلايا 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون حتى يصل التقاء الخلايا إلى 60 إلى 80٪ في اليوم السابق لوضع العلامات على macropinosome.
في اليوم السابق لوضع العلامات على الماكروبينوسوم ، استبدل الوسائط الموجودة في الآبار ب 500 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل المسلية التي تم تسخينها مسبقا وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 16 إلى 24 ساعة. بالنسبة لتنسيق الصفائح الدقيقة المكونة من 96 بئرا ، ابدأ بنقل تعليق الخلية إلى خزان كاشف سعة 25 ملليلتر. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بزرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة فحص سوداء عالية المحتوى 96 بئرا مع أوليفين دوري واضح بصريا أو قاع زجاجي.
احتضن الخلايا حتى يصل التقاء الخلايا إلى 60 إلى 80٪ في اليوم السابق لوضع العلامات على الماكروبينوسوم. في اليوم السابق لوضع العلامات على الماكروبينوسوم، قم بإزالة الوسائط والتخلص منها من كل بئر باستخدام محول شفط متعدد القنوات للحصول على نصائح قياسية متصلة بمضخة تفريغ. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات.
باستخدام خزان كاشف وماصة متعددة القنوات ، أضف بلطف 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل المسلية المسخنة مسبقا إلى كل بئر ، ثم ضع الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 16 إلى 24 ساعة. بالنسبة للوحة المكونة من 24 بئرا ذات شكل غطاء ، استبدل الوسائط الموجودة في الآبار ب 200 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل مع ديكستران عالي الوزن الجزيئي المسمى بالفلوروفور ووضع الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بشفط الوسائط واغسل الخلايا بلطف ولكن بسرعة خمس مرات باستخدام PBS البارد باستخدام زجاجة غسيل مبردة مسبقا.
هز الطبق باليد بقوة أثناء الغسيل للمساعدة في إزاحة مجاميع الدكستران التي تصبح عالقة في الأغطية. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 350 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 3.7٪ واحتضانها لمدة 20 دقيقة ، ثم استنشق محلول التثبيت واغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين. وصمة عار النوى مع 350 ميكرولتر من DAPI في PBS.
بعد 20 دقيقة ، قم بشفط محلول DAPI واغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات. قم بلصق عوازل السيليكون جنبا إلى جنب على شريحة المجهر للحصول على تباعد متساو وتوطين قابل للتكرار للأغطية المطلوبة لأتمتة التصوير. ثم لكل غطاء ، أضف قطرة من وسائط تركيب التألق المتصلب على شريحة المجهر داخل المساحة المفتوحة للعازل.
التقط غطاء باستخدام ملقط وقم بإزالة PBS الزائد عن طريق النقر برفق على جانب الغطاء على منديل خال من الوبر. بعد ذلك ، ضع الغطاء رأسا على عقب على قطرة وسائط التركيب وانقر برفق على الغطاء باستخدام ملقط مغلق لإزالة الفقاعات من وسائط التركيب. قم بتخزين الشرائح في بيئة مظلمة واسمح لوسائط التركيب بالجفاف في درجة حرارة الغرفة، وعادة ما يستغرق الأمر من 16 إلى 24 ساعة.
قبل التصوير ، قم بإزالة العوازل من شريحة المجهر. بعد أن يتم موازنة الشرائح مع درجة حرارة الغرفة، قم بتنظيف الأغطية باستخدام قضيب ذو رأس قطني مبلل بمنظف زجاجي خال من الأمونيا. بعد ذلك ، استخدم قضيب قطني نظيف مبلل بالإيثانول بنسبة 70٪ لتنظيف الغطاء وتركه جافا.
بالنسبة لشكل الصفائح الدقيقة المكونة من 96 بئرا ، بعد شفط الآبار كما هو موضح سابقا ، أضف 40 ميكرولترا من الوسائط الخالية من المصل مع دكستران عالي الوزن الجزيئي المسمى بالفلوروفور إلى الآبار ، ثم احتضن الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، تخلص من الوسائط الموجودة في الصفيحة الدقيقة عن طريق تحريك اللوحة يدويا رأسا على عقب في كوب فارغ سعة خمسة لترات ، ثم شطف الخلايا والصفيحة الدقيقة مرتين عن طريق غمر اللوحة ببطء عموديا بزاوية طفيفة في كوب سعة لترين مملوء ب PBS بارد بالثلج ثم التخلص من PBS في الصفيحة الدقيقة عن طريق تحريك اللوحة رأسا على عقب في الوعاء سعة خمسة لترات. بعد شطف PBS الأخير ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 3.7٪ من الفورمالديهايد في PBS إلى كل بئر باستخدام خزان كاشف 25 ملليلتر وماصة متعددة القنوات.
بعد حضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول التثبيت واغسل الخلايا باستخدام تقنية الغمر والنقر. بعد غسل PBS الثاني ، قم بتلطيخ النوى ب 100 ميكرولتر من DAPI في PBS لكل بئر. بعد 20 دقيقة ، اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS البارد كما هو موضح سابقا.
قم بإزالة أي PBS متبقية عن طريق النقر على اللوحة الدقيقة رأسا على عقب على مسح خال من الوبر. ثم أضف 100 ميكرولتر من PBS الطازج إلى كل بئر باستخدام خزان كاشف 25 ملليلتر وماصة متعددة القنوات. قبل التصوير ، دع اللوحة تتوازن مع درجة حرارة الغرفة ، ثم امسح لوحة زراعة الخلايا الجافة بمسح خال من الوبر.
بدلا من ذلك ، قم بتخزين اللوحة المغطاة بعيدا عن الضوء عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. للتصوير الآلي للماكروبينوسوم ، قم بإنشاء بروتوكول أتمتة للحصول على الصور ذات هدف جوي 40X في قناة الطول الموجي لفلوروفور ديكستران و DAPI. بعد ذلك ، قم بتحسين إعدادات التعرض باستخدام عينة من المتوقع أن تحتوي على أعلى مستوى من ندرة الخلايا الكبيرة لتجنب التعرض المفرط ، مما قد يؤدي إلى تشبع الإشارة وفقدان بيانات الكثافة.
استخدم إعدادات التركيز البؤري التي تحدد موقع العينة بسهولة وثبات لإنتاج صور عالية الجودة. احصل على صور متعددة عبر كل بئر أو غطاء لمراعاة تباين العينة والحصول على تمثيل دقيق للعينة. لتحديد مؤشر الخلايا الكبيرة، اطرح خلفية DAPI وصورة dextran المقابلة عن طريق تطبيق الدالة المناسبة، والتي تسمى في كثير من الأحيان دالة الكرة المتداولة.
اضبط الإعدادات بحيث يتم تقليل ضوضاء الخلفية إلى الحد الأدنى من تأثير الطرح أو بدون تأثير طرح على إشارة DAPI و dextran. بعد ذلك ، باستخدام حقل به إشارة ديكستران عالية ، حدد إعدادات إشارة الشدة ، التي تسمى في كثير من الأحيان دالة العتبة ، لتحديد النوى ، ثم حدد إعداد إشارة الحد الأدنى للكثافة المطلوب لتحديد الماكروبينوسومات فقط. بالنسبة لصورة الدكستران، احسب إجمالي التألق ضمن تحديد macropinosome الذي تم إنشاؤه أو استخدم التحديد لتحديد المساحة الإجمالية الموجبة للدكستران.
بالنسبة لصورة DAPI، استخدم التحديد لتحديد عدد النوى في الصورة لتعكس عدد الخلايا الموجودة. ثم حدد مؤشر الخلايا الكبيرة عن طريق قسمة إجمالي فلورة الدكستران أو المساحة على عدد الخلايا التي تحددها DAPI. في خلايا AsPC-1 PDAK ، فإن إضافة EGF عند 100 نانوغرام لكل ملليلتر لمدة خمس دقائق قبل إضافة الدكستران ينشط زيادة عدد الخلايا الكبيرة.
علاوة على ذلك ، يمكن أن يحدث تنشيط EGF الأوتوقراطي لندرة الخلايا الكبيرة عن طريق الحرمان من الجلوتامين لمدة 16 إلى 24 ساعة. تظهر خلايا MIA PaCa-2 ندرة الخلايا الكبيرة التأسيسية التي يتم تثبيطها عن طريق العلاج لمدة 30 دقيقة مع 75 ميكرومولار EIPA أو علاج لمدة ساعتين مع 10 ميكرومولار EHop-016. في تجربة الاستجابة للجرعة، انخفض مؤشر الخلايا الكبيرة تدريجيا عند تركيزات دوائية أعلى من EHop-016 و EIPA، مما يؤكد وجود زيادة عدد الخلايا الكبيرة المعتمدة على Rac1.
يمكنك تكييف هذا الإجراء لتقييم ندرة الخلايا الكبيرة للبضائع الأخرى الموسومة بالفلورسنت مثل الألبومين. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بتقييم ما إذا كان امتصاص الخلايا الكبيرة للألبومين يساهم في لياقة الخلايا من خلال إجراء فحوصات صلاحية الخلية. كانت هذه التقنية أساسية لتحديد إمدادات المغذيات ذات الخلايا السرطانية الكبيرة في الخلايا السرطانية واللحمية ، وقد زادت الأتمتة بشكل كبير من قدرتنا على اختبار الحالة.
