Этот протокол позволяет в режиме реального времени оценить различные процессы и биохимические параметры в просвете отдельных макропиносом. Эти методы могут быть использованы для открытия лекарств в клеточной биологии макропиноцитоза. Этот протокол обеспечивает преимущество выявления гетерогенности как на клеточном, так и на органельном уровне.
За сутки до анализа семена Raw264.7 клеток при плотности в пять раз 10 до мощности клеток в 100 микролитров на лунку, в стеклянной нижней 96-луночной пластине с черными боками. В день анализа проверьте, являются ли скважины не менее чем на 70% впаденными. Затем промыть все колодцы 100 микролитрами HBSS, предварительно разопленными при 37 градусах Цельсия.
Затем добавьте 100 микролитров HBSS, содержащих 0,025 миллиграмма на миллилитр TMR, помеченных 70 килодалтон декстраном и 0,025 миллиграмма на миллилитр флуоресцеина, меченого 70 килодалтон декстраном в каждой лунке, затем инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. После того, как инкубация будет завершена, снимите пластину с инкубатора и промыте клетки шесть раз 100 микролитрами HBSS. После последней промывки добавьте в клетки 100 микролитров предварительно выгретого HBSS, затем поместите пластину на микроскоп с нагретой сценой и камерой.
После корректировки параметров возбуждения и излучения для TMR и флуоресцеина по мере необходимости, получите изображение из каждой скважины, чередующееся между двумя флуорофорами между каждой скважиной. После первого приобретения проверьте, все ли скважины остались в фокусе по всей плите, затем получите изображения каждой скважины с интервалом от одной до 15 минут в течение желаемого периода времени. Во время получения изображения отрегулируйте рН 50-миллилитровой аликвоты богатого калием раствора, буферизованный 25 миллимолярами HEPES, до 7,5 с использованием 10 молярной соляной кислоты или 10 молярного гидроксида калия по мере необходимости.
Затем отрегулируйте рН 350 миллилитровых аликвот богатого калием раствора, буферизованный 25 миллимолярами MES, до рН 6,5, рН 5,5 и рН 5,0. После завершения получения изображения удалите HBSS из 96-скважинной пластины, содержащей клетки, и добавьте богатый калием раствор при рН 7,5. Затем добавляют Нигерицин в конечной концентрации 10 мкг на миллилитр.
Поместите пластину обратно на микроскоп и получите изображения каждой скважины, используя те же настройки сбора, которые были продемонстрированы ранее. Чтобы измерить окислительные события в макропиносомах, засевает клетки RAW264.7 в 96-скважинную пластину за день до анализа, как было показано ранее. Затем в день анализа промыть все колодцы со 100 микролитрами HBSS предварительно разогнув до 37 градусов Цельсия.
Затем добавьте 100 микролитров HBSS, содержащих 0,025 миллиграмма на миллилитр TMR, помеченных 70 килодалтон декстраном и 0,025 миллиграмма на миллилитр H2DCFDA, меченого 70 килодалтон декстраном, к каждой лунке, затем инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. После снятия пластины с инкубатора промыть клетки шесть раз 100 микролитрами HBSS. После последней стирки добавьте в каждую лунку по 100 микролитров HBSS и поместите пластину на микроскоп.
После корректировки параметров возбуждения и выбросов для TMR и H2DCFDA по мере необходимости, получите изображения каждой скважины с интервалом от одной до 15 минут, как показано ранее. Чтобы измерить переваривание белка в макропиносомах, за день до анализа посеяли клетки RAW264.7, как было показано ранее. Затем в день анализа промыть все колодцы 100 микролитрами HBSS предварительно проборкой при 37 градусах Цельсия.
Затем добавьте 100 микролитров HBSS, содержащих 0,025 миллиграмма на миллилитр TMR, помеченных 70 килодалтон декстраном в 0,2 миллиграмма на миллилитр BODIPY, меченый овальбумином, в каждую лунку. Затем высиживают пластину при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. После удаления клеток из инкубатора промыть их шесть раз 100 микролитрами HBSS.
После последней промывки добавьте в каждую лунку по 100 микролитров HBSS, затем поместите пластину на микроскоп. После корректировки параметров возбуждения и излучения для TMR и BODIPY по мере необходимости, получите изображения каждой скважины с интервалом от одной до 15 минут, как показано ранее. При измерении рН, окислительных событий или деградации белка в макропиносомах динамика подкисления не может быть измерена в течение определенного периода времени, соответствующего фазе загрузки декстрана, которая изменяется в зависимости от типа используемой клетки.
При измерении рН макропиносом отношение флуоресцеина к ПМР будет постепенно уменьшаться и будет плато в течение 15 минут после приобретения. Это плато соответствует рН примерно пяти, что примерно соответствует рН лизосом. В конце каждого приобретения выполняется калибровка in situ.
Отношение флуоресцеина к TMR должно быть наибольшим в калибровочном буфере при рН 7,5 и постепенно уменьшаться по мере того, как калибровочные буферы становятся более кислыми. Это позволяет создать калибровочную кривую. При измерении окислительных событий в макропиносомах отношение H2DCFDA к TMR будет постепенно становиться все больше и, вероятно, будет плато в течение первых 20-30 минут в активированных клетках RAW264.7.
При измерении макропиносомального переваривания белка при переваривании овальбумина будет высвобождаться прогрессивно сильный флуоресцеиновый сигнал. В клетках RAW264.7 увеличение флуоресценции, высвобождаемой из переваренного BODIPY, меченого овальбумином, будет плато в течение первых 30 минут. С этой новой ролью в гомеостазе и ее недавно обнаруженной актуальностью для патологии рака, в настоящее время проводятся исследования макропиноцитоза.
Эти методы предоставили набор инструментов для изучения вклада макропиноцитоза в эти области исследований.
