Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в иммунологии опухолей, в том числе о том, происходит ли пополнение опухолеспецифических иммунных клеток из периферических тканей, переходы между недавно инфильтрированными и уже существующими иммунными клетками в микроокружении опухоли и их ответы на иммунотерапию. Это удобный и простой в использовании метод, чтобы отличить периферийные клетки от инфильтрированных опухолью иммунных клеток и отслеживать динамические, фенотипические и функциональные изменения этих клеток в продольных анализах. Начните с извлечения 100 микролитров подготовленной клеточной суспензии B16F10-OVA в туберкулиновый шприц объемом 1 мл.
Постучите по бочке, чтобы переместить пузырьки наверх, и осторожно нажмите на поршень, чтобы удалить пузырьки воздуха. Удерживайте мышь, чтобы обнажить ее брюшко. Прижмите мизинцем левую заднюю ногу, чтобы подтянуть кожу левой паховой области.
Удалите волосы мыши с левой нижней части живота с помощью электробритвы. Используйте хлопок, смоченный в 75% этаноле, чтобы очистить задний квадрант левого живота. Держите шприц под небольшим углом от 0 до 15 градусов и, повернув скос иглы вверх, вставьте его сбоку левой верхней части бедра.
Продвиньте иглу от 0,5 до 1 сантиметра через подкожную клетчатку в паховую область. Оттяните плунжер перед впрыском. Если есть отрицательное давление, полностью нажмите на поршень и наблюдайте за образованием небольшого кармана жидкости или болюса в подкожной клетчатке.
Извлеките иглу после того, как инъекция будет проведена. Отпустите и поместите мышь обратно в клетку. На шестой-восьмой день после имплантации B16F10-OVA измерьте размер опухоли по шкале Вернье.
Выберите мышей с диаметром около трех миллиметров или опухолью размером с боб мунг и разделите их поровну и случайным образом на две группы. Извлеките 200 микролитров клеточной суспензии OT-1 в 100-единицный инсулиновый шприц 29-го калибра и удалите пузырьки. Поместите мышь отдельно в клетку, с инфракрасной лампой над клеткой на 5-10 минут, чтобы расширить хвостовую вену.
Обездвижите мышь с помощью удерживающего устройства соответствующего размера. Держите хвост, чтобы выпрямить его, и распылите 75% этанола, чтобы сделать вену видимой. Держите шприц параллельно вене и вставьте его в вену под углом от 0 до 15 градусов.
Отодвиньте поршень немного назад, и если кровь попадет в ствол, медленно и неуклонно впрыскивайте суспензию со скоростью не более одного миллилитра в минуту. После того, как инъекция завершена, извлеките шприц и осторожно надавите на область инъекции в течение трех-пяти секунд, чтобы остановить кровотечение. Верните мышь в клетку и внимательно наблюдайте за ней в течение нескольких минут на предмет побочных реакций.
Если он имеет нормальную подвижность и выделения из носа, поместите его обратно в компанию других мышей. Через 8-10 дней после усыновления отбирайте донорских мышей с сопоставимой массой опухоли диаметром примерно пять миллиметров для трансплантационной хирургии. Поместите тарелку размером 100 миллиметров на 20 миллилитров в шкаф для биобезопасности и добавьте 10 миллилитров стерильного, ледяного PBS.
После усыпления мыши погрузите ее в 75% этанол на три-пять минут. Поместите мышь в положение лежа на спине на рассечении, покрытом чистой абсорбирующей бумагой в шкафу для биобезопасности. Удерживайте конечности мыши с помощью рассеченных игл.
Срежьте ножницами кожу вдоль средней линии сверху уретрального отверстия до мечевидного. Растяните кожу по направлению к левой стороне тела мыши пинцетом и удерживайте кожу иглами для рассечения. Иссечь опухоль, сохранив ее капсулу как можно более неповрежденной.
Аккуратно и аккуратно удалить соединительную ткань возле опухоли хирургическими ножницами, затем поместить опухолевую ткань в блюдо, содержащее стерильный, ледяной PBS для последующей трансплантации. Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить их пересыхание. Побрейте левый бок мыши электробритвой, затем нанесите крем для депиляции, чтобы удалить оставшиеся волосы.
Поместите мышь внутрь шкафа биобезопасности в положение лежа на рассеченной доске, покрытой чистой абсорбирующей бумагой, с вертикальной осью мыши параллельно, а ее головой - с правой стороны экспериментатора. Протрите кожу бритого участка хлопком, пропитанным повидоном-йодом. Поднимите кожу в средней точке между тазобедренными суставами мыши хирургическим пинцетом.
Используйте ножницы, чтобы сделать вертикальное иссечение длиной пять миллиметров и расширить разрез рострально вдоль спинной средней линии примерно до 10-15 миллиметров. Выполните резкое рассечение, вставив закрытые кончики ножниц в разрез, а затем открыв, чтобы отделить брюшину левого фланга от кожи и мягких тканей. Выполните резкое рассечение несколько раз, чтобы сформировать кожный карман на левом фланге.
Поместите инкапсулированную, неповрежденную, донорскую опухолевую массу в карман. Закройте разрез прерванным швом, используя два или три шва для каждого разреза. Продезинфицируйте кожу вокруг разреза хлопком, смоченным в повидоне-йоде.
Поместите мышь в боковое положение в чистую и теплую клетку. Наблюдайте за ним непрерывно, пока он не придет в достаточное сознание, чтобы поддерживать стернальное равновесие. Вводят бупренорфин подкожно в дозе 0,1 миллиграмма на килограмм массы тела каждые восемь часов, в общей сложности три приема.
Возвращать реципиента трансплантата компании других животных только после того, как он полностью выздоровеет. С помощью проточной цитометрии две популяции CD44-отрицательных и CD8-положительных опухолевых антиген-специфических Т-клеток были легко идентифицированы в микроокружении опухоли, включая CD45.1-положительные донорские и CD45.1-отрицательные и CD45.2-положительные реципиент-инфильтрирующие опухоль CD8-положительные Т-клетки. На второй день после трансплантации было примерно 83% донорских антиген-специфических CD8-положительных Т-клеток в трансплантированной опухоли, более преобладающих, чем их аналоги, полученные реципиентом.
Доля клеток OT-1, полученных от реципиента, была повышена на поздней стадии опухолевого генеза, превысив присущие опухоли клетки OT-1, полученные от донора. Самое главное, что нужно помнить, это то, что выполнять щадящее рассечение во время трансплантации подкожной опухоли, чтобы избежать травм на окружающих тканях, особенно в зернистых лимфатических узлах.
