השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8⁺ בעכברים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח באימונולוגיה של הגידול, כולל האם יש חידוש של תאי חיסון ספציפיים לגידול מרקמות היקפיות, המעברים בין תאים חיסוניים חדשים שחודרו וכבר קיימים בתוך מיקרו-סביבה של הגידול, ותגובותיהם לאימונותרפיה. זוהי טכניקה נוחה וקלה למעקב כדי להבחין בין התאים שמקורם בפריפריה לבין תאי מערכת החיסון החודרים לגידול ולעקוב אחר השינויים הדינמיים, הפנוטיפיים והתפקודיים של תאים אלה במבחני אורך. התחל על ידי משיכת 100 מיקרוליטרים של תרחיף תא B16F10-OVA מוכן למזרק שחפת 1 מ"ל.

הקש על הקנה כדי להזיז את כל הבועות למעלה ודחף בעדינות את הבוכנה כדי להסיר בועות אוויר. לרסן את העכבר כדי לחשוף את בטנו. לחץ על הרגל האחורית השמאלית עם האצבע הקטנה כדי להדק את העור של האזור המפשעה השמאלי.

הסר את שיער העכבר מבטנו התחתונה השמאלית באמצעות מכונת גילוח חשמלית. השתמשו בכותנה ספוגה ב-75% אתנול כדי לנקות את הרביע האחורי של הבטן השמאלית. החזיקו את המזרק בזווית רדודה בין 0 ל -15 מעלות, ועם שיפוע המחט הפונה כלפי מעלה, הכנס אותו בצד הירך העליונה השמאלית.

מקדמים את המחט 0.5 עד 1 ס"מ דרך הרקמה התת עורית לאזור המפשעתי. משכו לאחור את הבוכנה לפני ההזרקה. אם יש לחץ שלילי, לדכא את הבוכנה לחלוטין ולצפות היווצרות של כיס נוזל קטן, או בולוס, ב subcutis.

הסר את המחט לאחר ביצוע ההזרקה. שחררו והחזירו את העכבר לכלוב. ביום השישי עד השמיני לאחר השתלת B16F10-OVA, מדוד את גודל הגידול בסולם ורנייה.

בחר את העכברים בקוטר של כשלושה מילימטרים או גידול בגודל שעועית מש, וחלק אותם באופן שווה ואקראי לשתי קבוצות. משכו 200 מיקרוליטרים של תרחיף תאי OT-1 למזרק אינסולין בעל 100 יחידות של 29 יחידות והסרו בועות. מניחים את העכבר בנפרד בכלוב, עם מנורת אינפרא אדום מעל הכלוב למשך 5 עד 10 דקות כדי להרחיב את וריד הזנב.

לשתק את העכבר עם מכשיר מרסן בגודל מתאים. החזיקו את הזנב כדי ליישר אותו ומרססים 75% אתנול כדי להפוך את הווריד לגלוי. החזיקו את המזרק במקביל לווריד והכניסו אותו לווריד בזווית של 0 עד 15 מעלות.

משכו מעט את הבוכנה לאחור, ואם הדם נכנס לחבית, לאט ובהתמדה להזריק את ההשעיה בקצב של לא יותר ממילילטר אחד לדקה. לאחר השלמת ההזרקה, הסר את המזרק ולחץ על אזור ההזרקה בעדינות למשך שלוש עד חמש שניות כדי לעצור את הדימום. מחזירים את העכבר לכלוב ומתבוננים בו מקרוב במשך כמה דקות לתגובות שליליות.

אם יש לו ניידות תקינה והפרשות מהאף, הניחו אותו בחזרה בחברת העכברים האחרים. 8 עד 10 ימים לאחר ההעברה המאמצת, בחרו עכברים תורמים הנושאים מסת גידול דומה בקוטר של כחמישה מילימטרים לניתוח השתלה. הניחו צלחת בגודל 100 מילימטר על 20 מיליליטר בארון בטיחות ביולוגית והוסיפו 10 מיליליטר של PBS סטרילי וקר כקרח.

לאחר המתת החסד את העכבר, לטבול אותו ב 75% אתנול במשך שלוש עד חמש דקות. הניחו את העכבר במצב שכיבה על לוח דיסקציה המכוסה בנייר סופג נקי בארון הבטיחות הביולוגית. לרסן את איברי העכבר עם מחטי דיסקציה.

חותכים את העור לאורך קו האמצע מלמעלה לפתח השופכה ועד לקסיפואיד עם מספריים. למתוח את העור לכיוון הצד השמאלי של גוף העכבר עם פינצטה ולרסן את העור עם מחטי דיסקציה. לבלות את הגידול, תוך שמירה על הקפסולה שלו שלמה ככל האפשר.

בזהירות ובעדינות להסיר את רקמת החיבור ליד הגידול עם מספריים כירורגיים, ולאחר מכן למקם את רקמת הגידול בצלחת המכילה PBS סטרילי, קר כקרח להשתלה הבאה. השתמשו במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש. לגלח את האגף השמאלי של העכבר עם מכונת גילוח חשמלית, ולאחר מכן למרוח קרם depilatory כדי להסיר את השיער הנותר.

מניחים את העכבר בתוך ארון הבטיחות הביולוגית במצב נוטה על לוח דיסקציה המכוסה בנייר סופג נקי, כאשר הציר האנכי של העכבר מקביל לראשו הימני של הנסיין וראשו בצד ימין של הנסיין. לשפשף את העור של האזור המגולח עם כותנה ספוגה פובידון-יוד. הרימו את העור בנקודת האמצע שבין מפרקי הירך של העכבר עם פינצטה כירורגית.

השתמש במספריים כדי ליצור כריתה אנכית באורך חמישה מילימטרים ולהרחיב את החתך באופן רוסטרלי לאורך קו האמצע הגבי לכ-10 עד 15 מילימטרים. בצע ניתוח חד על ידי החדרת הקצות הסגורים של המספריים לתוך החתך ולאחר מכן פתיחה כדי להפריד את הצפק של האגף השמאלי מהעור והרקמה הרכה. בצע דיסקציה חדה מספר פעמים כדי ליצור כיס עור באגף השמאלי.

הפקידו את מסת הגידול הדחוסה, השלמה, שמקורה בתורמים, בכיס. סגור את החתך על ידי תפר מופרע, באמצעות שניים או שלושה תפרים עבור כל חתך. יש לחטא את העור סביב החתך בכותנה ספוגה בפובידון-יוד.

מניחים את העכבר במצב לרוחב בכלוב נקי וחם. עקוב אחריו ברציפות עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות הסטרנלית. מתן buprenorphine תת עורית במינון של 0.1 מיליגרם לכל קילוגרם של משקל הגוף כל שמונה שעות, בסך הכל שלוש מנות.

החזירו את המושתל לחברתם של בעלי חיים אחרים רק לאחר שהחלים לחלוטין. באמצעות ציטומטריה של זרימה, שתי אוכלוסיות של תאי T ספציפיים לאנטיגן של CD44-negative ו-CD8-חיוביים ל-CD8 זוהו בקלות במיקרו-סביבה של הגידול, כולל CD45.1-חיובי-תורמים שמקורם בתורמים ו-CD45.1-שליליים ו-CD45.2-חיוביים שמקורם בגידול-מסתננים לתאי T חיוביים ל-CD8. ביום השני לאחר ההשתלה, היו כ-83% מתאי T חיוביים ל-CD8 ספציפיים לאנטיגן שמקורם בתורמים בתוך הגידול המושתל, יותר דומיננטיים ממקביליהם שמקורם במקבל.

שיעור תאי ה-OT-1 שמקורם במקבל היה גבוה בשלב המאוחר של הגידול, ועבר את תאי ה-OT-1 הטבועים בגידול שמקורם בתורם. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי כדי לבצע דיסקציה עדינה במהלך השתלת גידול תת עורית כדי למנוע פציעות על הרקמות הסובבות, במיוחד בצומת הלימפה הגרעינית.