زرع الورم لتقييم ديناميكيات الخلايا التائية CD8⁺ المتسللة للورم في الفئران

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم مناعة الورم، بما في ذلك ما إذا كان هناك تجديد للخلايا المناعية الخاصة بالورم من الأنسجة الطرفية، والتحولات بين الخلايا المناعية المخترقة حديثا والموجودة بالفعل داخل البيئة الدقيقة للورم، واستجاباتها للعلاج المناعي. هذه تقنية مريحة وسهلة المتابعة لتمييز الخلايا المشتقة من المحيط عن الخلايا المناعية المخترقة للورم وتتبع التغيرات الديناميكية والظاهرية والوظيفية لهذه الخلايا في الفحوصات الطولية. ابدأ بسحب 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا B16F10-OVA المحضر إلى حقنة درنية سعة 1 مل.

اضغط على البرميل لنقل أي فقاعات إلى الأعلى وادفع المكبس برفق لإزالة فقاعات الهواء. كبح جماح الماوس لفضح بطنه. اضغط على الساق الخلفية اليسرى بالإصبع الصغير لشد جلد المنطقة الإربية اليسرى.

قم بإزالة شعر الفأر من أسفل البطن الأيسر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. استخدم القطن المنقوع في 75٪ من الإيثانول لتنظيف الربع الخلفي من البطن الأيسر. أمسك المحقنة بزاوية ضحلة تتراوح بين 0 إلى 15 درجة ، ومع توجيه شطبة الإبرة لأعلى ، أدخلها على جانب الفخذ العلوي الأيسر.

تقدم الإبرة 0.5 إلى 1 سم من خلال الأنسجة تحت الجلد إلى المنطقة الأربية. اسحب المكبس للخلف قبل الحقن. إذا كان هناك ضغط سلبي ، فقم بخفض المكبس تماما ولاحظ تكوين جيب سائل صغير ، أو بلعة ، في تحت الجلد.

قم بإزالة الإبرة بعد إجراء الحقن. حرر الماوس وضعه مرة أخرى في القفص. في اليوم السادس إلى الثامن بعد زرع B16F10-OVA ، قم بقياس حجم الورم بمقياس أكثر دقة.

اختر الفئران التي يبلغ قطرها حوالي ثلاثة ملليمترات أو ورم بحجم حبة المونغ ، وقسمها بالتساوي وبشكل عشوائي إلى مجموعتين. اسحب 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا OT-1 إلى حقنة أنسولين 100 وحدة قياس 29 وإزالة الفقاعات. ضع الماوس بشكل منفصل في قفص ، مع مصباح الأشعة تحت الحمراء فوق القفص لمدة 5 إلى 10 دقائق لتوسيع الوريد الذيل.

شل حركة الماوس باستخدام جهاز تقييد بحجم مناسب. امسك الذيل لتصويبه ورش 75٪ من الإيثانول لجعل الوريد مرئيا. امسك المحقنة موازية للوريد وأدخلها في الوريد بزاوية من 0 إلى 15 درجة.

اسحب المكبس قليلا ، وإذا دخل الدم إلى البرميل ، فقم بحقن التعليق ببطء وثبات بمعدل لا يزيد عن ملليلتر واحد في الدقيقة. بعد اكتمال الحقن ، قم بإزالة المحقنة واضغط على منطقة الحقن بلطف لمدة ثلاث إلى خمس ثوان لوقف النزيف. أعد الماوس إلى القفص وراقبه عن كثب لبضع دقائق بحثا عن ردود الفعل السلبية.

إذا كان لديه حركة طبيعية وإفرازات أنفية ، فضعه مرة أخرى بصحبة الفئران الأخرى. بعد 8 إلى 10 أيام من النقل بالتبني، اختر الفئران المانحة التي تحمل كتلة ورم مماثلة يبلغ قطرها حوالي خمسة ملليمترات لجراحة الزرع. ضع طبقا بحجم 100 ملم × 20 ملليلتر في خزانة السلامة البيولوجية وأضف 10 ملليلتر من PBS المعقم والبارد المثلج.

بعد القتل الرحيم للماوس ، اغمره في 75٪ من الإيثانول لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ضع الماوس في وضع ضعيف على لوحة تشريح مغطاة بورق ماصة نظيف في خزانة السلامة الأحيائية. كبح جماح أطراف الماوس باستخدام إبر التشريح.

قطع الجلد على طول خط الوسط من فوق فتحة مجرى البول إلى الخناق مع مقص. قم بتمديد الجلد نحو الجانب الأيسر من جسم الفأر باستخدام ملاقط وكبح جماح الجلد باستخدام إبر التشريح. استئصال الورم ، والحفاظ على كبسولة سليمة قدر الإمكان.

قم بإزالة النسيج الضام بعناية ولطف بالقرب من الورم باستخدام مقص جراحي ، ثم ضع أنسجة الورم في الطبق الذي يحتوي على PBS معقم وبارد للزرع اللاحق. استخدم مرهم بيطري على العينين لمنعهما من التجفيف. احلق الجناح الأيسر للماوس باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية ، ثم ضع كريم مزيل للشعر لإزالة الشعر المتبقي.

ضع الماوس داخل خزانة السلامة الأحيائية في وضع عرضة على لوحة تشريح مغطاة بورق ماصة نظيف ، مع المحور الرأسي للماوس مواز ورأسه إلى الجانب الأيمن من المجرب. فرك جلد المنطقة المحلوقة بالقطن المنقوع في البوفيدون اليود. ارفع الجلد عند نقطة الوسط بين مفاصل ورك الفأر باستخدام ملاقط جراحية.

استخدم المقص لإجراء استئصال رأسي بطول خمسة ملليمترات وتمديد القطع بشكل سطحي على طول خط الوسط الظهري إلى حوالي 10 إلى 15 ملم. قم بإجراء تشريح حاد عن طريق إدخال الأطراف المغلقة للمقص في الشق ثم فتحه لفصل الصفاق من الجناح الأيسر عن الجلد والأنسجة الرخوة. قم بإجراء تشريح حاد عدة مرات لإنشاء جيب جلدي على الجناح الأيسر.

قم بإيداع كتلة الورم المغلفة والسليمة والمشتقة من المتبرع في الجيب. أغلق الشق عن طريق خياطة متقطعة ، باستخدام غرزتين أو ثلاث غرز لكل شق. تطهير الجلد حول القطع مع القطن المنقوع في البوفيدون اليود.

ضع الماوس في الموضع الجانبي في قفص نظيف ودافئ. راقبه باستمرار حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء الصارم. إدارة البوبرينورفين تحت الجلد بجرعة 0.1 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم كل ثماني ساعات ، ليصبح المجموع ثلاث جرعات.

إعادة متلقي الزرع إلى شركة الحيوانات الأخرى فقط بعد أن يتعافى تماما. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تم تحديد مجموعتين من الخلايا التائية الخاصة بمستضدات الورم السلبية CD44 و CD8 الإيجابية بسهولة في البيئة الدقيقة للورم ، بما في ذلك CD45.1 إيجابي من المتبرع المشتق و CD45.1 سلبي و CD45.2 إيجابي المتلقي المشتق من الخلايا التائية CD8 الإيجابية. في اليوم الثاني بعد الزرع ، كان هناك ما يقرب من 83٪ من الخلايا التائية الإيجابية CD8 المشتقة من المستضدات الخاصة بالمتبرع داخل الورم المزروع ، وهي أكثر شيوعا من نظيراتها المشتقة من المتلقي.

ارتفعت نسبة خلايا OT-1 المشتقة من المتلقي في المرحلة المتأخرة من تكوين الورم ، متجاوزة خلايا OT-1 المتأصلة في الورم المشتقة من المتبرع. أهم شيء يجب تذكره هو إجراء تشريح لطيف أثناء زرع الورم تحت الجلد لتجنب الإصابات على الأنسجة المحيطة ، وخاصة في العقدة الليمفاوية الحبيبية.