Этот протокол позволяет количественно оценить площадь, периметр и форму внутриклеточной структуры по двумерным изображениям. Этот метод быстр и прост, требует только стандартных лабораторных настроек и конфокального микроскопа и использует программное обеспечение с открытым исходным кодом. Демонстрацией процедуры будет Анна Бальцерак, аспирантка из моей лаборатории.
Начните с посева четыре раза от 10 до пятой клетки в 0,5 миллилитров культуры среды на колодец в четыре хорошо коллагена одной покрытием камеры слайд для 24-часовой культуры в 37 градусов по Цельсию и пять градусов углекислого газа инкубатора. На следующее утро используйте оптический перевернутый микроскоп, чтобы проверить наличие по крайней мере 90%-ного слияния монослой и использовать конфокальный микроскоп для получения одного изображения с ломтиками. Для анализа фокусного адгезии откройте изображения в ImageJ и выберите анализ, установите масштаб, удалите масштаб и глобальную, чтобы установить шкалу изображения в пикселях.
Чтобы включить имя файла и область области, представляющие интерес в вариантах измерения, нажмите проанализировать и установить измерения и проверить область и параметры отображения этикетки. Чтобы вычесть фон, выберите процесс и вычесть фон. Установите радиус подвижного шара до 50 пикселей и проверьте раздвижной параболоид.
Чтобы определить область самой маленькой области интереса, наметьте малейшее фокусное деление и нажмите на анализ и меру для измерения области. Когда было отобрано и измерено по крайней мере 20 областей, представляющих интерес, рассчитать и сохранить среднее количество полученных результатов. Установите верхнюю границу до 25% типичной области ячейки.
Чтобы присвоить изображение двоичному, нажмите на изображение, отрегулируйте и порог, и проверьте по умолчанию, черно-белый и темный фон. Для измерения количества и областей областей, представляющих интерес, выберите анализ и анализ частиц и проверьте пиксельные единицы, отобразить результаты, четкие результаты и обобщить. Перенесите данные о срезе, подсчете и общей площади среднего размера из сводного окна в программу управления данными по выбору.
Для количественной оценки фокусного адгезии откройте макрос фокусного адгезии ImageJ и введите область самой маленькой области интереса в качестве области малейшего параметра, представляющих интерес. Установите значение порогового типа для ручного или автоматического и сохраните изменения. Затем позвоните макросу из ImageJ и выберите изображение для обработки.
Для ручного анализа формы ячейки откройте изображение в соответствующей программе обработки изображений и выберите параметры, которые будут измерены. Используйте инструмент выбора от руки, чтобы вручную разграничить границы клеток, отмеченные белками соединения выбора. Выбранные параметры будут автоматически рассчитаны для каждой ячейки.
Когда все ячейки будут изложены, выберите редактировать, выбирать и добавлять в менеджер. Следует выбрать только полностью видимые ячейки с непрерывными границами. Чтобы сделать измерение, отметьте все числа, появляющиеся в левой коробке области менеджера интересов, и нажмите меру.
Результаты будут отображаться в поле результатов и могут быть импортированы в электронную таблицу по выбору. Автоматизированный анализ клеток облегчает количественную оценку большого количества клеток. Для каждого нового типа ячейки сначала запустите макрос для установления параметров.
Когда макрос закончится, выберите границы размера ячейки. Нажмите на этикетку самых маленьких и крупнейших ячеек и нажмите меру. Установите значение самой маленькой ячейки и крупнейших переменных ячееок и сохраните изменения.
Закройте все макро окна и выберите изображение, которое будет обработано в серой шкале. Затем запустите макрос снова. Макрос предоставит таблицу результатов, которая включает индекс формы ячейки, соотношение аспектов и данные списка выбора интересов.
Здесь можно наблюдать репрезентативные изображения фокусных спайков, подсчитанных с Помощью ImageJ, включая окончательные проумерено очертания и наложения контуров фокусной адгезии с исходным изображением как для линий управления, так и для нокдауна. Как показано в этом анализе, нокдаун клетки продемонстрировали большее количество спаек на клетку, а также спайки, которые больше по размеру по сравнению с клетками линии управления. На этих снимках показаны репрезентативные области необработанных и химиотерапевтически обработанных клеточных монослой.
Клетки контура были охарактеризованы в соответствии с их значениями индекса формы клеток, например, в этом анализе, показывающем увеличение последнего ящика и выравнивание основных пиков для обработанных наркотиками клеток по сравнению с необработанными контролями. Затем для каждой клеточной культуры можно было бы сгенерировано распределение частот и кумулятивное распределение. Серомасштабная визуализация монослоев, как было продемонстрировано, позволила провести анализ и количественную оценку 512 ячеек из 12 областей зрения, показывая относительное распределение частоты индекса формы клетки.
Для работы этого протокола важно использовать изображения наилучшего качества. Правильное посев клеток, окрашивание и визуализация должны обеспечивать достаточное экспериментальное качество изображений.
