Este protocolo permite quantificação da área, perímetro e forma de estrutura intracelular a partir de sua imagem bidimensional. Esta técnica é rápida e fácil, requer apenas configurações de laboratório padrão e um microscópio confocal e usa software de código aberto. Demonstrando o procedimento será Anna Balcerak, uma estudante de doutorado do meu laboratório.
Comece semeando quatro vezes 10 a cinco células em 0,5 mililitros de cultura média por poço em um deslizamento de câmara revestido de colágeno de quatro poços para uma cultura de 24 horas em uma incubadora de 37 graus Celsius e cinco graus de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, use um microscópio óptico invertido para verificar a presença de pelo menos 90% de monocamada confluente e use um microscópio confocal para obter imagens únicas de fatia Z. Para análise de adesão focal, abra as imagens no ImageJ e selecione analisar, definir escala, remover escala e global para definir a escala de imagem em pixels.
Para incluir o nome do arquivo e a área da região de interesse nas opções de medição, clique em analisar e definir medições e verificar as opções de área e etiqueta de exibição. Para subtrair o plano de fundo, selecione o processo e subtraia o plano de fundo. Defina o raio da bola rolando para 50 pixels e verifique o paraboloide deslizante.
Para determinar a área da menor região de interesse, delineie a menor adesão focal única e clique em analisar e medir a área. Quando pelo menos 20 regiões de interesse forem selecionadas e medidas, calcule e salve a média dos resultados obtidos. Defina o limite superior para 25% de uma área celular típica.
Para conferir a imagem ao binário, clique em imagem, ajuste e limiar e verifique o plano padrão, preto e branco e fundo escuro. Para medir o número e as áreas das regiões de interesse, selecione analisar e analisar partículas e verificar unidades de pixels, exibir resultados, resultados claros e resumir. Transfira os dados de tamanho médio da fatia, contagem e área total da janela de resumo para o programa de gerenciamento de dados de escolha.
Para quantificação de adesão focal, abra a adesão focal ImageJ macro e entre na área da menor região de interesse como área da menor região de parâmetro de interesse. Defina o valor do tipo de limiar para manual ou automático e salve as alterações. Em seguida, ligue para a macro do ImageJ e selecione a imagem a ser processada.
Para análise manual da forma de célula, abra uma imagem em um programa de software de processamento de imagem apropriado e selecione os parâmetros a serem medidos. Use a ferramenta de seleção à mão livre para delinear manualmente as bordas celulares como marcada pelas proteínas de junção de escolha. Os parâmetros escolhidos serão calculados automaticamente para cada célula.
Quando todas as células tiverem sido delineadas, selecione editar, selecionar e adicionar ao gerenciador. Apenas células completamente visíveis com bordas ininterruptas devem ser selecionadas. Para fazer a medição, marque todos os números que aparecem na caixa esquerda da região de gerente de interesse e clique na medida.
Os resultados aparecerão na caixa de resultados e podem ser importados para a planilha de escolha. A análise automatizada de células facilita a quantificação do grande número de células. Para cada novo tipo de célula, primeiro execute a macro para estabelecer parâmetros.
Quando a macro estiver concluída, selecione definir limites de tamanho de célula. Clique no rótulo das menores e maiores células e clique na medida. Defina o valor da menor célula e das maiores variáveis celulares e salve as alterações.
Feche todas as janelas macro e selecione a imagem a ser processada em escala de cinza. Em seguida, executar a macro novamente. A macro fornecerá uma tabela dos resultados que inclui o índice de forma celular, proporção e regiões de seleções de interesse listam dados.
Aqui, podem ser observadas imagens representativas de aderências focais contadas com ImageJ, incluindo os contornos numerados finais e as sobreposições dos contornos de adesão focal com a imagem original para as linhas de células de controle e knockdown. Como ilustrado nesta análise, as células de knockdown demonstraram um maior número de aderências por célula, bem como aderências maiores em tamanho em comparação com células de linha celular de controle. Nessas imagens, são mostradas regiões representativas de monocamadas celulares não tratadas e quimiofapeuticamente tratadas.
As células de contorno foram caracterizadas de acordo com seus valores de índice de forma celular, por exemplo, nesta análise, mostrando um aumento na última lixeira e um achatamento dos principais picos para as células tratadas com drogas em comparação com controles não tratados. Uma distribuição de frequência e distribuição cumulativa poderia então ser gerada para cada cultura celular. A imagem em escala de cinza das monocamadas como demonstrado permitiu a análise e quantificação de 512 células de 12 campos de visão revelando uma distribuição relativa da frequência do índice de forma celular.
Para que este protocolo funcione, é importante usar imagens da melhor qualidade possível. A semeadura, a coloração e a imagem adequadas devem garantir imagens de qualidade experimental suficiente.
