Изучение микрооквидения опухоли затруднено из-за ее сложности. Мы разработали микроокноронные микроармейки, состоящие из простых комбинаторных микроокнорониров, которые позволяют идентифицировать основные драйверы фенотипов опухолевых клеток. Основным преимуществом платформы MEMA является то, что, поскольку условия микроокноронности определены, просто определить факторы микроокноронности, которые управляют фенотипами, представляющими интерес.
Платформа MEMA широко применяется в других неракомовых системах, включая первичные клеточные штаммы и стволовые клетки. Есть ряд инженерных трюков и шагов, которые мы разработали, чтобы ускорить мокрую работу скамейки и упростить протокол. Для начала используйте сенсорный принтер для печати внеклеточной смеси матричной печати в фидуциальных пятнах на пластины из восьми колодец.
Используйте булавки диаметром 350 микрометров, расположенные в четырехразовой конфигурации печати для печати внеклеточной матрицы для микроармей микрохирургии. Блок коллагена печатается на MEMAs как сетка. Заполненные PBS скважины обеспечивают дополнительную влажность, чтобы предотвратить высыхание внеклеточной матрицы печати смеси источник пластины.
Печать массивов в восьми-хорошо пластин, как 20 столбцов на 35 строк, в общей сложности 700 пятен. После печати храните тарелки в desiccator в течение как минимум трех дней до использования. Во-первых, разработать 96-хорошо пластины макет с интервалом, что позволяет использовать многоканандовые пипетки с четырьмя раскладными наконечниками, так что лечение многих пластин MEMA может быть сделано сразу.
Затем извлекаем лиганды из морозильной камеры и оттаивают во льду в капюшоне из ламинарного потока. Кратко Флик и спина вниз каждой трубки. Используйте рекомендуемый буфер производителя, чтобы разбавить лиганды до 200-х рабочих запасов.
Pipette 10 микролитров каждого 200-времени лиганд акций в соответствующий колодец в 96-хорошо пластины. Используйте герметивную пленку, чтобы запечатать пластины и хранить их при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Сделайте лигандовые лечебные пластины партиями и захватите все метаданные для анализа ниже по течению.
Перед культивированием ячеек блокируйте MEMAs двумя миллилитров на колодец необлеваемого блокирующего буфера в течение 20 минут. Используйте Y-сплиттер с двумя трубами Pasteur, чтобы аспирировать блокирующий буфер в нескольких скважинах одновременно, а затем утроить промыть колодцы с помощью PBS. Чтобы предотвратить высыхание, оставьте окончательный объем PBS в колодцах до готовности к облицовыванию клеток.
Перед полным экспериментом MEMA оптимизируйте концентрацию посева клеток MCF7, выполняя эксперимент по титрованиям клеток. Идеальное место, как показано здесь, имеет достаточное количество ячееок для извлечения данных, но не так много, что пятно слишком стечения. В MEMA, аспирировать оставшиеся PBS и семян MCF7 клетки на 30000 до 35000 клеток на колодец в двух миллилитров посева среды.
Поместите MEMA в инкубатор при 37 градусах по Цельсию. После адгезии на ночь в инкубаторе, аспирировать среды и заменить двумя миллилитров снижение среднего роста, чтобы изолировать стимулируемое воздействие конкретных лигандов. Затем оттаивать ранее замороженную лигандовую плиту на льду.
Центрифуга размороженная пластина по 200 раз г в течение одной минуты. Передача 200 микролитров среды из каждого хорошо в MEMA культуры пластины в соответствующий колодец в лиганд лечения пластины. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать лиганд со средой, и передать эту смесь обратно в соответствующий колодец в MEMA культуры пластины.
Слегка рок вручную и вернуть MEMA пластин в инкубатор для культуры лиганд-ECM сочетание при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. После 71 часов, добавить 100 раз EdU к скважинам MEMA для окончательной концентрации 10 микромолей. Инкубировать его еще один час при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе.
После окончательной инкубации, аспирировать скважины. Исправить MEMAs в два миллилитров на колодец 2%PFA в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем аспирировать PFA из скважин.
Permeabilize с двумя миллилитров на колодец 0,1%неионные сурфактант в течение 15 минут. Аспирировать сурфактант, а затем мыть скважины с двумя миллилитров PBS и PBS-T, последовательно. После этого добавьте к каждой колодец 1,5 миллилитров реагентов реакции EdU.
Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре, качая и защищены от света. Затем утолить реакцию с 1,5 миллилитров коммерческого буфера утоления на колодец. Аспирировать снова, и мыть с PBS-T до инкубации с оптимизированной концентрации пятен или антител.
Инкубировать MEMA скважины с первичными антителами в окрашивание буфера, качания при четырех градусах по Цельсию в одночасье. После первичной инкубации антител, мыть колодцы с PBS следуют PBS-T. Добавьте вторичные антитела в 0,5 микрограмма на миллилитр DAPI, разбавленные буфером окрашивания.
Инкубировать, качая в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Вымойте скважины два раза с двумя миллилитров на скважину PBS, и оставить их в последние два миллилитров PBS. Для изображения окрашенных MEMA, поместите его на стадии микроскопа автоматизированной системы визуализации с соответствующими флуоресцентными каналами обнаружения.
Вывод полученных данных изображения в систему управления изображениями. Сегментные ячейки и рассчитать уровни интенсивности с помощью CellProfiler. В этом протоколе профили клеточного цикла связанных значений интенсивности DAPI по сравнению с ячейками из одной пластины из восьми хорошо указывают на клетки в фазе цикла G1 против G2.
Это соответствует двум содержанием nDNA в клетках на ранней стадии роста, и четыре nDNA содержание в клетках вот-вот пройти митоз. Показано влияние микрооквидения лигандов и ЭКМ как на номер клетки, так и на включение ЭдУ. Красный цвет указывает на более высокое число ячеев, а синий – на меньшее число клеток.
Многие из эффектов лиганд-управляемых, как условие ECM не сильно влияет на номер клетки или EdU положительность. Натаген 1 является явным исключением, так как наличие этой молекулы ECM подавляет связывание клеток и рост MCF7. Лиганды, такие как FGF6 и neuregulin-1 альфа увеличить количество клеток и имеют высокие показатели включения Эду, в то время как лиганды, такие как амфирегулин и неурегулин-1 SMDF подавляют связывание клеток и рост клеток.
Пример клеток MCF7, растущих на месте MEMA, обработанном альфа-неурегулином-1, показывает высокие показатели включения ЭдУ, указанные розовыми ядрами. На этом изображении зеленое пятно - это клеточная маска, а синее - DAPI. Так как полный эксперимент MEMA стоит дорого, очень важно выполнить шаги оптимизации, такие как клеточные и сывороточной титрование, до выполнения полного эксперимента.
После того, как микроокронные условия, представляющие интерес, идентифицируются с помощью платформы MEMA, специфические лиганды и внеклеточные матричные белки могут быть изучены более подробно с использованием традиционных систем 2D и 3D-культуры клеток.
