Этот протокол может быть использован для измерения количества антигенных участков на клеточном рецепторе интереса. Основным преимуществом этой техники является то, что она дает надежные результаты, даже для рецепторов, выраженных при низкой плотности. Этот метод позволяет оценку сокращения экспрессии эритроцитов CR1, и это такие, как болезнь Альцгеймера, системная красная волчанка, СПИД и малярия.
Этот протокол полезен для любого анализа плотности клеточных рецепторов, а также может быть применен к изучению экспрессии клеточных рецепторов с помощью флуоресцентного микроскопа. Мы рекомендуем расстояние между трубками во время распределения клеток и антител, и сопровождаться цитометрическим специалистом во время первого анализа, если это возможно. Визуальная демонстрация иммуностимулятора и количественной оценки плотности по цитометрии потока имеет решающее значение для понимания того, как правильно установить параметры анализа.
Перед началом анализа добавьте 250 микролитров антикоагулированной цельной крови натрия из трубок для хранения крови в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую 20 миллилитров четырехградуса Цельсия PBS-BSA. Смешайте содержимое трубки нежной инверсией и вращайте клетки центрифугой. Используйте 10 миллилитровую пипетку, чтобы отказаться от супернатанта и тщательно повторно использовать гранулы в остаточном объеме раствора.
Добавьте 20 миллилитров холодного PBS-BSA и снова центрифугировать клетки. В конце центрифуги поместите трубку в стойку, помещенную на лед, и перенесите восемь микролитров промытых эритроцитов в 50 миллилитровую трубку, содержащую три миллилитров PBS-BSA. Затем аккуратно смешайте эритроциты, вращаясь, чтобы получить однородную подвесную клетку.
Для иммуностинерации эритроцитов тщательно перенесите 100 микролитров разбавленных эритроцитов в отдельные 1,5 миллилитровые трубки и соберите эритроциты путем центрифугации. После отказа от супернатантов, осторожно добавьте 20 микролитров 0,5 микрограмма на микролитер концентрации биотинилированных анти-CR1 J3D3 антитела в PBS-BSA, непосредственно к каждой гранулы. Добавьте 20 микролитров буфера PBS-BSA только к отрицательным контрольным клеткам с нежным смешиванием и инкубировать образцы в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия.
В конце инкубации, мыть образцы два раза с 750 микролитров свежих PBS-BSA на трубку, за стирку. После второй стирки добавьте 20 микролитров от одного до 10 разбавления стрептавидина фикоэритрона в PBS-BSA к каждой трубке с нежным смешиванием и инкубировать образцы в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть образцы дважды, как попродемонстрировано.
После второй стирки, исправить каждый образец клетки гранулы с 450 микролитров буфера фиксации во время вихря, прежде чем передавать каждый образец в отдельных пяти миллилитров круглых нижних труб до 48 часов хранения при четырех градусах по Цельсию. Чтобы проанализировать иммунотонкие эритроциты на цитометрию потока, нажмите новую кнопку эксперимента в цитометре потока и переименуй новый эксперимент. Выберите вперед рассеяния, бокового рассеяния и PE в цитометре настройки окна.
В открытом эксперименте выберите настройки цитометра настройки приложения и создайте глобальный лист, используя серые коробки и перекрестия волос для руководства оптимизацией. Когда все параметры будут установлены, загрузите незапачканную трубку управления на цитометр и запустите приобретение, оптимизируя напряжение перемотки вперед и сбоку для устранения мусора и обеспечения того, чтобы население, которому представляет интерес, было в масштабе. Далее, нарисовать ворота вокруг красных кровяных телец на вперед по сравнению с боковой участок рассеяния и отображать популяцию красных кровяных телец в точка участок PE флуоресценции.
Если положительные популяции находятся в масштабе, загрузите окрашенную контрольную трубку на цитометр и запустите приобретение. Для записи и анализа образцов, выгрузить окрашенные образца и создать вперед по сравнению с боковой рассеяния участка и PE флуоресценции гистограммы на новом глобальном листе. Загрузите первый образец на цитометр, запустите приобретение и нарисуйте ворота красных кровяных телец вокруг эритроцитов в участке рассеяния вперед по сравнению с боковой.
Отображение популяции красных кровяных телец в флуоресценции Гистограммы PE и под вкладкой статистики, выберите среднее для параметров PE флуоресценции на популяциях красных кровяных телец. В панели мониторинга приобретения выберите все события в остановох воротах и 10 000 событий для записи и нажмите на данные записи. Когда запись события завершена, удалите трубку из цитометра.
Глобальные графики листов должны выглядеть как иллюстрированные. Цитометрический анализ иммунотетроцитов из трех субъектов известных плотностей CR1 позволяет измерять средняю интенсивность флуоресценции маркировки для каждого субъекта. Построение кривой с использованием значений субъекта с известной плотностью эритроцитов CR1 позволяет эти данные быть зарегистрированы как функция средней интенсивности флуоресценции.
Сравнение линии регрессии в результате этой кривой со значениями средней интенсивности флуоресценции других субъектов позволяет определить их плотность эритроцитов CR1. Позаботьтесь о том, чтобы эритроциты и антитела были правильно распределены, поэтому кривые калибровки экспериментируемых образцов на отрицательном контроле находятся в пределах цитометра. Можно адаптировать эту процедуру для измерения других плотности клеточных рецепторов, просто путем изменения первичного антитела и / или адаптации слоев усиления.
Всякий раз, когда вы обрабатываете крови, есть риск патогенного загрязнения. Поэтому не забудьте использовать личные лабораторные практики и носить соответствующее средства индивидуальной защиты.
