Este protocolo pode ser usado para medir o número de sítios antigênicos no receptor celular de interesse. A principal vantagem dessa técnica é que ela produz resultados robustos, mesmo para receptores expressos em baixa densidade. Este método permite a avaliação da redução da expressão do eritrócito CR1 e isso é como Alzheimer, lúpus eritematoso sistêmico, AIDS e malária.
Este protocolo é útil para qualquer análise da densidade do receptor celular e também pode ser aplicado ao estudo da expressão do receptor celular por microscópio de fluorescência. Recomendamos espaçamento dos tubos durante a distribuição de células e anticorpos, e ser acompanhado por um especialista citométrico durante a primeira análise, se possível. A demonstração visual da quantificação de imunostaining e densidade por citometria de fluxo é fundamental para entender como definir adequadamente os parâmetros de análise.
Antes de iniciar a análise, adicione 250 microliters de sódio EDTA anticoagulado sangue inteiro de tubos de armazenamento de sangue em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de quatro graus Celsius PBS-BSA. Misture o conteúdo do tubo por uma inversão suave e gire as células por centrifugação. Use uma pipeta de 10 mililitros para descartar o supernaspe e resuspenque cuidadosamente a pelota no volume residual da solução.
Adicione 20 mililitros de PBS-BSA frio e centrifugar as células novamente. No final da centrifugação, coloque o tubo em um rack, colocado no gelo e transfira oito microliters dos eritrócitos lavados em um tubo de 50 mililitros contendo três mililitros de PBS-BSA. Em seguida, misture os eritrócitos suavemente girando para obter uma suspensão celular homogênea.
Para imunostaining eritrócito, transfira cuidadosamente 100 microlitadores dos eritrócitos diluídos em tubos individuais de 1,5 mililitro e colete os glóbulos vermelhos por centrifugação. Depois de descartar os supernantes, adicione cuidadosamente 20 microlitadores de uma concentração de 0,5 microgramas por microlitra de anticorpo anti-CR1 J3D3 biotiningado em PBS-BSA, diretamente a cada pelota. Adicione 20 microliters de tampão PBS-BSA sozinho às células de controle negativas com mistura suave e incubar as amostras por 45 minutos a quatro graus Celsius.
Ao final da incubação, lave as amostras duas vezes com 750 microliters de PBS-BSA frescos por tubo, por lavagem. Após a segunda lavagem, adicione 20 microlitadores de uma diluição de 1 a 10 de ficoerythrina streptavidina em PBS-BSA a cada tubo com mistura suave, e incubar as amostras por 45 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as amostras duas vezes, como demonstrado.
Após a segunda lavagem, fixe cada pelota de amostra de célula com 450 microliters de tampão de fixação durante o vórtice, antes de transferir cada amostra para tubos de fundo redondos individuais de cinco mililitros por até 48 horas de armazenamento a quatro graus Celsius. Para analisar os eritrócitos imunossuídos para citometria de fluxo, clique no novo botão de experimento no citômetro de fluxo e renomeie o novo experimento. Selecione dispersão para a frente, dispersão lateral e PE na janela de configurações do cítômetro.
No experimento aberto, selecione as configurações do aplicativo de configurações de cytómetro e crie uma planilha global, usando as caixas cinzas e os cabelos cruzados para orientar a otimização. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, carregue o tubo de controle não manchado no citômetro e execute a aquisição, otimizando as tensões de dispersão para frente e lateral para eliminar detritos e garantir que a população de interesse esteja em escala. Em seguida, desenhe um portão em torno das células vermelhas do gráfico de dispersão dianteira versus lateral e mostre a população de glóbulos vermelhos no gráfico de pontos da fluorescência de PE.
Se as populações positivas estiverem em escala, carregue o tubo de controle manchado no citômetro e execute a aquisição. Para registrar e analisar amostras, descarregue a amostra manchada e crie um gráfico de dispersão para frente versus lado e um histograma de fluorescência de PE em uma nova planilha global. Carregue a primeira amostra no citômetro, execute a aquisição e desenhe um portão de glóbulos vermelhos ao redor dos eritrócitos no gráfico de dispersão dianteira versus lateral.
Exibir a população de glóbulos vermelhos no histograma de fluorescência de PE e sob a guia estatística, selecione a média para os parâmetros de fluorescência de PE em populações de glóbulos vermelhos. No painel de aquisição, selecione todos os eventos no portão de parada e 10.000 eventos para gravar e clique em registrar dados. Quando a gravação do evento estiver concluída, remova o tubo do cítômetro.
As tramas globais da planilha devem parecer ilustradas. A análise citométrica de fluxo de eritrócitos imunossuados de três sujeitos de densidades cr1 conhecidas permite medir a intensidade média de fluorescência da rotulagem para cada sujeito. Traçar uma curva usando os valores do sujeito com a densidade conhecida do eritrócito CR1 permite que esses dados sejam relatados em função da intensidade média da fluorescência.
A comparação da linha de regressão resultante dessa curva aos valores da intensidade média de fluorescência dos outros sujeitos permite a determinação de sua densidade de eritrócito CR1. Tome cuidado para que os eritrócitos e anticorpos estejam devidamente distribuídos, de modo que as curvas de calibração das amostras experimentadas no controle negativo estão dentro do intervalo das configurações do citômetro. É possível adaptar este procedimento para medir outros receptores celulares de densidade, simplesmente alterando o anticorpo primário e/ou adaptando as camadas de amplificação.
Sempre que você está manuseando sangue, há o risco de contaminação de patógenos. Portanto, não deixe de usar boas práticas laboratoriais e usar os equipamentos de proteção individual adequados.
