Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Anzahl der antigenen Stellen auf zellulären Rezeptor von Interesse zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie robuste Ergebnisse produziert, auch für Rezeptoren, die bei geringer Dichte ausgedrückt werden. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Reduktion der CR1-Erythrozytenexpression und dies ist wie Alzheimer, systemischer Lupus erythematodes, AIDS und Malaria.
Dieses Protokoll ist nützlich für jede Analyse der Zellrezeptordichte und kann auch auf die Untersuchung der Zellrezeptorexpression mittels Fluoreszenzmikroskop angewendet werden. Wir empfehlen, die Rohre während der Zell- und Antikörperverteilung abzugrenzen und bei der ersten Analyse möglichst von einem zytometrischen Spezialisten begleitet zu werden. Die visuelle Demonstration der Immunostainierung und Dichtequantifizierung durch Durchflusszytometrie ist entscheidend für das Verständnis, wie die Analyseparameter richtig eingestellt werden.
Vor Beginn der Analyse 250 Mikroliter Natrium EDTA antikoaguliertes Vollblut aus Blutspeicherröhrchen in eine 50 Milliliter konische Röhre mit 20 Milliliter n.V. PBS-BSA. Mischen Sie den Rohrinhalt durch sanfte Inversion und drehen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Verwenden Sie eine 10 Milliliter Pipette, um den Überstand zu entsorgen und das Pellet im Restvolumen der Lösung vorsichtig wieder aufzuhängen.
Fügen Sie 20 Milliliter kalte PBS-BSA hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen wieder. Am Ende der Zentrifugation das Rohr in ein Rack legen, auf Eis legen und acht Mikroliter der gewaschenen Erythrozyten in ein 50-Milliliter-Rohr mit drei MilliliterPBS-BSA übertragen. Dann mischen Sie die Erythrozyten sanft durch Spinnen, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.
Für Erythrozyten-Immunostainierung 100 Mikroliter der verdünnten Erythrozyten sorgfältig in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen und die roten Blutkörperchen durch Zentrifugation sammeln. Nach dem Wegwerfen der Überstandmittel 20 Mikroliter einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter biotinylierter Anti-CR1 J3D3-Antikörper in PBS-BSA direkt in jedes Pellet geben. Fügen Sie 20 Mikroliter PBS-BSA-Puffer allein zu den negativen Kontrollzellen mit sanfter Mischung hinzu und inkubieren Sie die Proben 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation die Proben zweimal mit 750 Mikrolitern frischer PBS-BSA pro Tube pro Waschmittel waschen. Nach der zweiten Wäsche 20 Mikroliter einer bis 10 Verdünnung von Streptavidin-Phycoerythrin in PBS-BSA zu jedem Rohr mit sanfter Mischung hinzufügen und die Proben 45 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Proben am Ende der Inkubation zweimal, wie gezeigt.
Nach der zweiten Wäsche, fixieren Sie jedes Zellprobenpellet mit 450 Mikroliter Fixationspuffer während des Wirbelns, bevor Sie jede Probe in einzelne fünf Milliliter runde Bodenröhren für bis zu 48 Stunden Lagerung bei vier Grad Celsius übertragen. Um die immunbefleckten Erythrozyten für die Durchflusszytometrie zu analysieren, klicken Sie auf die neue Experimentschaltfläche im Durchflusszytometer, und benennen Sie das neue Experiment um. Wählen Sie vorwärts gestreut, Seitenstreuung und PE im Fenster Zytometer-Einstellungen.
Wählen Sie im offenen Experiment die Anwendungseinstellungen für die Zytometereinstellungen aus, und erstellen Sie ein globales Arbeitsblatt, indem Sie die grauen Felder und Querhaare verwenden, um die Optimierung zu steuern. Wenn alle Parameter eingestellt sind, laden Sie das ungefärbte Steuerrohr auf das Zytometer und führen Sie die Erfassung aus, wodurch die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen optimiert werden, um Schmutz zu beseitigen und sicherzustellen, dass die Bevölkerung von Interesse auf der Skala liegt. Als nächstes zeichnen Sie ein Tor um die roten Blutkörperchen auf dem vorderen gegen seiteStreudiagramm und zeigen die Population der roten Blutkörperchen im Punktdiagramm der PE-Fluoreszenz an.
Wenn die positiven Populationen auf der Skala sind, laden Sie das gebeizte Steuerrohr auf das Zytometer und führen Sie die Erfassung aus. Um Proben aufzuzeichnen und zu analysieren, entladen Sie die gebeizte Probe und erstellen Sie ein vorwärts- versus seitenseitiges Streudiagramm und ein PE-Fluoreszenzhistogramm auf einem neuen globalen Arbeitsblatt. Laden Sie die erste Probe auf das Zytometer, führen Sie die Erfassung durch und zeichnen Sie ein rotes Blutkörperchentor um die Erythrozyten im vorwärts- oder seitlichen Streudiagramm.
Zeigen Sie die Population der roten Blutkörperchen im PE-Fluoreszenz-Histogramm an, und wählen Sie unter der Registerkarte Statistik den Mittelwert für die PE-Fluoreszenzparameter für rote Blutkörperchen aus. Wählen Sie im Erfassungsdashboard alle Ereignisse im Stoppgate und 10.000 Ereignisse aus, die aufzeichnet werden sollen, und klicken Sie auf Datensatzdaten. Wenn die Ereignisaufzeichnung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Rohr aus dem Zytometer.
Die globalen Arbeitsblattdiagramme sollten wie dargestellt aussehen. Die zytometrische Durchflussanalyse von immunbefleckten Erythrozyten von drei Probanden bekannter CR1-Dichte ermöglicht die Messung der mittleren Fluoreszenzintensität der Etikettierung für jedes Probanden. Das Plotten einer Kurve unter Verwendung der Werte des Subjekts mit der bekannten Dichte von Erythrozyten CR1 ermöglicht die Erfassung dieser Daten in Abhängigkeit von der mittleren Fluoreszenzintensität.
Der Vergleich der Regressionslinie, die sich aus dieser Kurve ergibt, mit den Werten der mittleren Fluoreszenzintensität der anderen Probanden ermöglicht die Bestimmung ihrer CR1-Erythrozytendichte. Achten Sie darauf, dass die Erythrozyten und Antikörper richtig verteilt sind, so dass die Kalibrierkurven der experimentierten Proben auf der Negativkontrolle im Bereich der Zytometereinstellungen liegen. Es ist möglich, dieses Verfahren anzupassen, um andere Dichte zelluläre Rezeptoren zu messen, einfach durch Ändern des primären Antikörpers und/oder Anpassung der Amplifikationsschichten.
Wenn Sie mit Blut umgehen, besteht die Gefahr einer Kontamination durch Krankheitserreger. Achten Sie daher darauf, gute Laborpraktiken zu verwenden und die entsprechende persönliche Schutzausrüstung zu tragen.
