Этот протокол демонстрирует экспрессию и очищение антител и мониторинг распределения антител в опухоли и тканях в режиме реального времени. Скрининг антител с описанным протоколом поможет выбрать антитела, которые имеют ограниченное неспецифическое распределение тканей, и обогатить локализацию опухоли. Описанный метод является быстрым и рентабельным.
Другие методы, такие, как однокотонная эмиссионная компьютерная томография и позитронно-эмиссионная томография, стоят очень дорого и требуют радиоактивных и других сложных трассировщиков. Техника не ограничивается антителами, нацеленные на рак. Он может быть применен к любым другим заболеваниям, таким как болезни легких или сердца, для анализа распределения антител в организме.
Демонстрацией процедуры будет Джереми Гейтсман, ветеринарный техник из моего университета. Сырые клетки CHO в 200 миллилитров средств массовой информации, в Delong, Erlenmeyer сбит с толку колбы. Объедините пять миллилитров средств массовой информации CHO freestyle с 50 микрограммами переменной тяжелой ДНК клона и 75 микрограммами ДНК клона переменного света в 15 миллилитровой трубке.
Затем вихрь трубки. Оставьте смесь при комнатной температуре на пять минут. Добавьте 750 микролитров по 1 миллиграмму на миллилитр полиэтиленовый запас в раствор ДНК и агрессивно вихрем в течение 30 секунд.
Оставьте смесь при комнатной температуре еще на пять минут. Добавьте всю смесь в клетки CHO, вручную встряхивая колбу. Немедленно инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию при встряхивании при 130 об/мин.
На следующий день добавьте в клетки два миллилитра антикомпания 100 X и два миллилитров антибактериального раствора 100 X. Инкубировать колбы при 32 до 34 градусов по Цельсию, со тряской при 130 об/мин. Продолжить культивирование клеток в течение 10 до 11 дней, добавив 10 миллилитров триптона N1 корма, и два миллилитров 100 X глутамин дополнения на каждый пятый день.
Подсчитайте клетки на каждый третий день, чтобы убедиться, что жизнеспособность клеток остается выше 80% На день 10 или 11, урожай среды для очистки антител путем центрифугирования культуры в 3000 раз G, и четыре градуса по Цельсию в течение 40 до 60 минут. Затем отфильтруй чистый мультимедиа с помощью фильтра бутылки 0,22 микрометра. Чтобы очистить антитела, эквилибрировать белок колонки с двумя объемами столбца связывающего буфера.
Перейдите фильтрованные средства массовой информации через столбец со скоростью потока в один миллилитр в минуту. Затем вымойте столбец двумя объемами столбца связывающего буфера. Используйте пять миллилитров буфера элюции, чтобы урезать антитела в 500 фракций микролитров.
И нейтрализовать рН ссылающихся антител, добавив 10 микролитров буфера нейтрализации для фракции. Измерьте концентрацию очищенного антитела с помощью спектрофотометра с помощью протокола по умолчанию для IgG. Диализ 0,5 миллилитров антитела с помощью диализной кассеты в одном литре буфера спряжения.
Через четыре часа перенесите кассету с диализом в свежий буфер и облизой на ночь. Чтобы настроить реакцию спряжения, добавьте 0,03 микрограмма красителя IRR 800 CWU на один миллиграмм антител в общем объеме 500 микролитров. Инкубировать смесь в течение двух часов при 20 градусах по Цельсию, а затем очистить помечены конъюгирует обширный диализ против PBS.
Оцените степень маркировки путем измерения поглощения красителя 780 нанометров и поглощения белка на 280 нанометров. Для разработки ксенографов мышей аккуратно поднимите кожу животного и отделите ее от основного мышечного слоя. Медленно ввись 100 микролитров клеточной подвески под кожу с 26 калибровочных игл.
Подождите несколько секунд, прежде чем принимать иглу так, что подвал матрицы среды информировать полутвердых гель-как структура вместе с клетками под кожей, которая будет препятствовать смеси от выхода из места инъекции. Для выполнения в vivo изображений, вводить краситель помечены антитела через хвостовой вены. После анестезии мыши, проверьте на отсутствие реакции на педали рефлексы, и расширить вену, применяя теплую воду.
Используйте шприц инсулина 1cc с иглой 26 датчика для того чтобы впрыснуть 25 микрограммов обозначенного антитела в томе 100 микролитров. В качестве отрицательного контроля, этикетки и вводить неспецифические IgG изотип антитела, которые не нацелены на раковые клетки. Выполните в vivo изображения восемь, 24 и 48 часов после инъекций антител.
В программном обеспечении для визуализации щелкните инициализировать. Подтвердите, что температура стадии составляет 37 градусов по Цельсию. В панели управления на настройке флуоресценции изображения через мастера изображений, и установить возбуждение до 773 нанометров, выброс до 792 нанометров.
Перенесите анестезированной мыши в камеру визуализации. Распоимите его на поле визуализации с помощью носового конуса. Когда вы будете готовы, нажмите приобрести на панели управления для получения изображения, и нажмите кнопку автоматического разоблачения.
Сгенерированное изображение является наложением флуоресценции на фотографическое изображение с оптической флуоресценцией и плотностью, отображаемой в единицах графов или фотонов. Положительные клоны cDNA с переменными тяжелыми и переменными доменами света были подтверждены с ПЦР колонии. Здесь показаны репрезентативные результаты очищенного фарлетузумаба, запущенного на странице без сокращения и уменьшения SDS.
Тяжелые и легкие цепи произвели 50 и 25 килодальтонных полос после сокращения. Подтверждена также привязка антител к местным белкам на поверхности клетки. Флуоресцентно помеченные антитела были впрыснуты хвостовой вены, в мышей привитых с полным R1 экспрессии опухолей.
Звери жили изображения в нескольких точках времени с помощью IVIS. данные confirs селективного обогащения полного R1 и BaCa антител в опухоли. При попытке этого протокола, имейте в виду, что содержание клеток CHO имеет решающее значение для выработки антител.
И важно иметь аналогичную степень спряжения флуоресцентных красителей для конкурентной локализации опухоли. После этой процедуры, другие методы, такие как иммуногистохимия тканей и тканей или опухоли конкретных ELISA могут быть выполнены для поддержки живых мышей изображений данных.
