Este protocolo demonstra a expressão e purificação de anticorpos e o monitoramento em tempo real da distribuição de anticorpos em tumor e tecido. Os anticorpos de triagem com o protocolo descrito ajudarão a selecionar anticorpos que tenham distribuição limitada de tecidos não específicos e enriquecer as localizações tumorais. A técnica descrita é rápida e econômica.
Outras técnicas, como tomografia computadorizada por emissão de fótons e tomografia de emissão de pósitrons, são muito caras e requerem rastreadores radioativos e outros traçadores sofisticados. A técnica não se limita ao câncer mirando anticorpos. Pode ser aplicado a qualquer outra doença, como doenças pulmonares ou cardíacas, para a análise da distribuição de anticorpos no corpo.
Demonstrando o procedimento, estará Jeremy Gatesman, um técnico veterinário da minha universidade. Células DE CHO brutas em 200 mililitros da mídia, em Delong, Erlenmeyer confundiu frascos. Combine cinco mililitros de mídia freestyle CHO com 50 microgramas de DNA de clone pesado variável, e 75 microgramas um DNA de clone de luz variável em um tubo de 15 mililitros.
Então, vórtice do tubo. Deixe a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Adicione 750 microlitadores de um miligrama por mililitro de polietilenimina à solução de DNA, e agressivamente vórtice por 30 segundos.
Deixe a mistura em temperatura ambiente por mais cinco minutos. Adicione toda a mistura às células CHO enquanto agita manualmente o frasco. Incubar imediatamente as células a 37 graus Celsius enquanto treme a 130 RPM.
No dia seguinte, adicione dois mililitros de 100 X anti-clumping agente, e dois mililitros de 100 X solução antibacteriana antimíctica para as células. Incubar os frascos a 32 a 34 graus Celsius, com agitação a 130 RPM. Continue aculturar as células por 10 a 11 dias, adicionando 10 mililitros de ração Tryptone N1, e dois mililitros de 100 X suplemento de glutamina a cada quinto dia.
Conte as células em cada três dias para garantir que a viabilidade celular permaneça acima de 80% No dia 10 ou 11, colher o meio para purificação de anticorpos, centrifugando a cultura a 3000 vezes G, e quatro graus Celsius por 40 a 60 minutos. Em seguida, filtre a mídia clara com um filtro de garrafa de 0,22 micrômetro. Para purificar os anticorpos, equilibre a proteína Uma coluna com dois volumes de coluna de tampão de ligação.
Passe a mídia filtrada através da coluna na taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Em seguida, lave a coluna com dois volumes de coluna de tampão de ligação. Use cinco mililitros de tampão de elução para elutar o anticorpo em 500 frações de microliter.
E neutralizar o pH do anticorpo alusão adicionando 10 microliters de tampão de neutralização para fração. Meça a concentração do anticorpo purificado com um espectotômetro usando o protocolo padrão para IgG. Dialyze 0,5 mililitros do anticorpo usando um de diálise em um litro de tampão de conjugação.
Depois de quatro horas, transfira o de diálise para tampão fresco e difera durante a noite. Para configurar uma reação de conjugação, adicione 0,03 microgramas de corante IRR 800 CWU por um miligrama de anticorpo em um volume total de 500 microliters. Incubar a mistura por duas horas a 20 graus Celsius, depois purificar os conjugados rotulados por diálise extensiva contra a PBS.
Estime o grau de rotulagem medindo a absorção do corante de 780 nanômetros, e a absorvância da proteína em 280 nanômetros. Para desenvolver xenógrafos de camundongos, levante suavemente a pele do animal e separe-a da camada muscular subjacente. Injete lentamente 100 microliters de suspensão celular sob a pele com uma agulha calibre 26.
Aguarde alguns segundos antes de tirar a agulha para que o meio da matriz do porão informe a estrutura semissólida semelhante a gel, juntamente com células sob a pele, o que impedirá que a mistura saia do local da injeção. Para realizar imagens in vivo, injete o anticorpo rotulado de corante através da veia da cauda. Depois de anestesiar o mouse, verifique a falta de resposta aos reflexos do pedal e dilatar a veia aplicando água morna.
Use uma seringa de insulina de 1cc com uma agulha de calibre 26 para injetar 25 microgramas do anticorpo rotulado em um volume de 100 microliters. Como um controle negativo, rotule e injete o anticorpo isótipo IgG não específico que não tenha como alvo as células cancerígenas. Realize imagens in vivo oito, 24 e 48 horas após injeções de anticorpos.
No software de imagem, clique em inicializar. Confirme que a temperatura do palco é de 37 graus Celsius. No painel de controle, configure imagens de fluorescência através do assistente de imagem, e defina a excitação para 773 nanômetros, emissão para 792 nanômetros.
Transfira o rato anestesiado para a câmara de imagens. Posicione-o no campo de imagem usando o cone do nariz. Quando estiver pronto, clique em adquirir no painel de controle para a aquisição da imagem e clique em expor automaticamente.
A imagem gerada é a sobreposição da fluorescência na imagem fotográfica com fluorescência óptica e densidade exibida em unidades de contagens ou fótons. Clones de cDNA positivos com domínios de luz variável pesada e variável foram confirmados com PCR colônia. Os resultados representativos do farletuzumabe purificado executado na página SDS não redutor e redutor são mostrados aqui.
As cadeias pesadas e leves produziram 50 e 25 faixas quilodalton após a redução. Também foi confirmada a ligação de anticorpos às proteínas nativas na superfície celular. Anticorpos fluorescentes rotulados foram injetados na veia da cauda, em camundongos enxertados com tumores expressos de R1 completos.
Os animais eram imagens vividas em vários pontos de tempo usando ivis. os dados confrem enriquecimento seletivo de anticorpos R1 e BaCa completos nos tumores. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a manutenção das células CHO é fundamental para o rendimento de anticorpos.
E é importante ter um grau semelhante de conjugação de corante fluorescente para localização competitiva do tumor. Após esse procedimento, outros métodos como a imunohistoquímica tecidual e o tecido ou tumor específico ELISA podem ser realizados para apoiar os dados de imagem de camundongos vivos.
