Dieses Protokoll demonstriert die Expression und Reinigung von Antikörpern und die Echtzeitüberwachung der Antikörperverteilung in Tumor und Gewebe. Screening-Antikörper mit beschriebenem Protokoll helfen bei der Auswahl von Antikörpern, die eine begrenzte unspezifische Gewebeverteilung haben, und bereichern Tumorlokalisierungen. Die beschriebene Technik ist schnell und kostengünstig.
Andere Techniken, wie die Computertomographie für Einzelphotonenemissionen und die Positronenemissionstomographie, sind sehr teuer und erfordern radioaktive und andere ausgeklügelte Tracer. Die Technik beschränkt sich nicht auf Krebsmedikamente. Es kann auf jede andere Krankheit angewendet werden, wie Lungen- oder Herzerkrankungen, für die Analyse der Antikörperverteilung im Körper.
Demonstrieren das Verfahren, wird Jeremy Gatesman, ein Veterinärtechniker von meiner Universität sein. Rohe CHO-Zellen in 200 Milliliter Medien, in Delong, Erlenmeyer verwirrtKolben. Kombinieren Sie fünf Milliliter CHO-Freestyle-Medien mit 50 Mikrogramm variabler schwerer Klon-DNA und 75 Mikrogramm eine variable Lichtklon-DNA in einer 15-Milliliter-Röhre.
Dann wirbeln Sie die Röhre. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Fügen Sie 750 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Polyethylenimin-Lager in die DNA-Lösung, und aggressiv wirbeln Sie es für 30 Sekunden.
Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für weitere fünf Minuten. Fügen Sie die gesamte Mischung zu den CHO-Zellen hinzu, während Sie den Kolben manuell schütteln. Sofortige Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius beim Schütteln bei 130 RPM.
Am nächsten Tag zwei Milliliter 100 X Anti-Klumpen-Mittel und zwei Milliliter 100 X antibakterielle antimykotische Lösung in die Zellen geben. Inkubieren Sie die Kolben bei 32 bis 34 Grad Celsius, mit Schütteln bei 130 U/min. Fahren Sie die Kultivierung der Zellen für 10 bis 11 Tage, Hinzufügen von 10 Milliliter Tryptone N1 Futter, und zwei Milliliter von 100 X Glutamin Ergänzung an jedem fünften Tag.
Zählen Sie die Zellen an jedem dritten Tag, um sicherzustellen, dass die Zelllebensfähigkeit über 80% bleibt Am Tag 10 oder 11, ernten Sie das Medium für die Antikörperreinigung durch Zentrifugieren der Kultur bei 3000 mal G, und vier Grad Celsius für 40 bis 60 Minuten. Filtern Sie dann die klaren Medien mit einem 0,22 Mikrometer Flaschenfilter. Um die Antikörper zu reinigen, gleicht die Protein-A-Säule mit zwei Spaltenvolumina von Bindungspufferaus.
Übergeben Sie die gefilterten Medien mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute durch die Spalte. Waschen Sie dann die Spalte mit zwei Spaltenvolumes mit Bindungspuffer. Verwenden Sie fünf Milliliter Elutionspuffer, um den Antikörper in 500 Mikroliter-Fraktionen zu verwandeln.
Und neutralisieren den pH-Wert des angedeuteten Antikörpers, indem 10 Mikroliter Neutralisationspuffer für Fraktion hinzugefügt werden. Messen Sie die Konzentration des gereinigten Antikörpers mit einem Spektralphotometer mit dem Standardprotokoll für IgG. Dialyse 0,5 Milliliter des Antikörpers mit einer Dialysekassette in einem Liter Konjugationspuffer.
Nach vier Stunden die Dialysekassette in einen frischen Puffer geben und über Nacht dialysieren. Um eine Konjugationsreaktion einzurichten, fügen Sie 0,03 Mikrogramm IRR-Farbstoff 800 CWU pro einem Milligramm Antikörper in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Inkubieren Sie die Mischung für zwei Stunden bei 20 Grad Celsius, dann reinigen Sie die markierten Konjugate durch umfangreiche Dialyse gegen PBS.
Schätzen Sie den Grad der Etikettierung, indem Sie die Absorption des Farbstoffs 780 Nanometer und die Absorption des Proteins bei 280 Nanometern messen. Um Maus-Xenographen zu entwickeln, heben Sie die Haut des Tieres sanft an und trennen Sie sie von der darunter liegenden Muskelschicht. Mit einer 26-Meter-Nadel spritzen Sie langsam 100 Mikroliter Zellsuspension unter die Haut.
Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausnehmen, damit das Kellermatrixmedium die halbfeste gelartige Struktur zusammen mit zellenförmigen Zellen unter der Haut informiert, wodurch verhindert wird, dass die Mischung aus der Injektionsstelle kommt. Um in vivo-Bildgebung durchzuführen, injizieren Sie den Farbstoff beschrifteten Antikörper über die Schwanzvene. Nach der Anästhesisierung der Maus, überprüfen Sie auf die fehlende Reaktion auf Pedalreflexe, und die Vene durch die Anwendung von warmem Wasser zu deisieren.
Verwenden Sie eine 1cc Insulinspritze mit einer 26-Messgerät-Nadel, um 25 Mikrogramm des markierten Antikörpers in einem Volumen von 100 Mikrolitern zu injizieren. Als Negativkontrolle den unspezifischen IgG-Isotyp-Antikörper, der nicht auf Krebszellen abzielt, zu kennzeichnen und zu injizieren. Führen Sie in vivo Bildgebung acht, 24 und 48 Stunden nach Antikörperinjektionen durch.
Klicken Sie in der Imaging-Software auf Initialisieren. Bestätigen Sie, dass die Stufentemperatur 37 Grad Celsius beträgt. Richten Sie im Bedienfeld die Fluoreszenz-Bildgebung über den Bildgebungsassistenten ein und stellen die Anregung auf 773 Nanometer, die Emission auf 792 Nanometer.
Übertragen Sie die anästhesierte Maus in die Bildkammer. Positionieren Sie es mit dem Nasenkegel auf dem Bildfeld. Wenn Sie bereit sind, klicken Sie auf das Bedienfeld für die Bildaufnahme auf "Erfassen", und klicken Sie auf automatische Belichtung.
Das erzeugte Bild ist die Überlagerung der Fluoreszenz auf dem fotografischen Bild mit optischer Fluoreszenz und Dichte, die in Einheiten von Zählungen oder Photonen angezeigt wird. Positive cDNA-Klone mit variablen schweren und variablen Lichtdomänen wurden mit Kolonie PCR bestätigt. Repräsentative Ergebnisse von gereinigtem Farletuzumab auf nicht-reduzierender und reduzierender SDS-Seite werden hier gezeigt.
Schwere und leichte Ketten produzierten 50 und 25 KilodaltonBänder nach reduktion. Die Bindung von Antikörpern an native Proteine in der Zelloberfläche wurde ebenfalls bestätigt. Fluoreszierend markierte Antikörper wurden Schwanzvenen in Mäuse injiziert, die mit vollen R1-exezierenden Tumoren transplantiert wurden.
Tiere wurden zu mehreren Zeitpunkten mit IVIS gelebt. die Daten konfirs selektive Anreicherung von vollständigen R1- und BaCa-Antikörpern in die Tumoren. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die Aufrechterhaltung von CHO-Zellen für die Antikörperausbeute von entscheidender Bedeutung ist.
Und es ist wichtig, einen ähnlichen Grad an fluoreszierender Farbkonjugation für eine wettbewerbsfähige Tumorlokalisierung zu haben. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Gewebeimmunhistochemie und Gewebe- oder tumorspezifische ELISA durchgeführt werden, um die bildgebenden Daten der lebenden Mäuse zu unterstützen.
