Наш новый протокол фактически позволяет нам визуализировать клеточные структуры в 3D с помощью рентгеновской компьютерной томографии. И мы делаем это, окрашивая ткани эозином и таким образом делая цитоплазму видимой. Помимо медицинских применений и исследований, мы также считаем, что наш метод может быть применен в биологии, как, например, зоологические исследования или биологии развития.
Техника относительно проста, очень быстра, а также подходит для больших образцов тканей. Мы считаем, что наш подход в сочетании с рентгеновской микро-компьютерной томографии могут быть интегрированы в клинический рабочий процесс, а затем на самом деле помочь патологоанатомам принимать более обоснованные решения. Начните с фиксации образцов мягких тканей.
Заполните 50 миллилитровую центрифугу трубкой с фиксаторным раствором, содержащим 9,5 миллилитров 4%формальдегида и 0,5 миллилитров ледниковой уксусной кислоты. Добавьте образец мягких тканей в трубку центрифуги и охладьте его в течение 24-72 часов. После охлаждения промыть образец мягких тканей раствором DPBS в течение одного часа.
Затем испачкайте образец, поместив его в два миллилитров раствора окрашивания Eosin Y и инкубировать его на горизонтальной тарелке встряхивания в течение 24 часов. На следующий день тщательно вынешь образец мягких тканей из образца контейнера и удалите излишки окрашивания целлюлозно-бумажной ткани. Поместите его в конический контейнер над фазой пара этанола для хранения и дальнейшего использования.
Подготовь соответствующий держатель образца, чтобы смонтировать образец мягких тканей в соответствии с рукописными указаниями и обеспечить плотную посадку, чтобы предотвратить перемещение образца во время рентгеновских измерений КТ. После того, как клей затвердел и держатель образца готов к использованию, перенесите почку мыши в нетронутую центрифугу, которая содержит несколько капель 70% этанола в нижней части. Поместите установленный образец в рентгеновский компьютерный томограф.
После тщательного выравнивания образца выберите параметры приобретения для наилучшего качества изображения. Для представленных данных микроКТ, приобрести сканирование на пиковом напряжении 50 киловольт и ток 3,5 Вт с использованием 1601 прогнозы равномерно распределены более 360 градусов. Затем используйте данные микроКТ из обзорной проверки, чтобы выбрать область, интересную для КТ высокого разрешения.
Подготовьте объемы, представляющие интерес для образца мягких тканей, разрезая его на очень маленькие кусочки длиной около 0,5 миллиметра с помощью скальпеля и стерео микроскопа. При использовании мыши почки, разрезать его на две половины вдоль самой длинной оси. Возьмите половину и подготовить различные анатомические области, такие как почечная кора и почечная медулла.
Перенесите мелкие кусочки в новую чашку Петри для обезвоживания. Обезвоживать образцы с помощью ряда решений этанола в соответствии с рукописными направлениями, выполняя каждый шаг обезвоживания в течение одного часа. Перенесите обезвоженные образцы в микропорозную капсулу и закройте ее.
Держите образцы в контакте со 100%этанолом во все времена. Затем критическая точка высушить мелкие кусочки ткани. После того, как образцы тканей подготовлены, держать их в новой чашке Петри хранится в desiccator до дальнейшего использования.
Намонтировать части ткани к соответствующему держателю образца обеспечивая плотную пригонку. Для мыши почки суперклей кусочки образца держателя с помощью стерео микроскопа. После тщательного выравнивания образца выберите параметры приобретения для наилучшего качества изображения.
Для представленных данных нано-КТ, приобрести прогнозы на пиковом напряжении 60 киловольт с 1599 прогнозов поровну распределены более 360 градусов и voxel размером около 400 нанометров. Этот протокол использовался для 3D-визуализации микроскопических тканевых структур почки мыши. Измерения микроКТ с низким разрешением позволили проконтмить весь орган и помогли определить объемы, представляющие интерес для измерений с высоким разрешением.
Та же почка мыши использовалась для получения микроКТ высокого разрешения. Более детальное представление анатомических структур, таких как кора, внешняя медулла, и внутренняя медулла среди других достигается. Объем рендеринга интереса показывает область medulla и фактически раздел через сосуд.
Нано-КТ использовался для получения детального просмотра образца почек на клеточном уровне. Небольшой кусочек ткани, полученный из всей почки мыши, был использован для изображения толстых восходящих конечностей петли Хенле с размером вокселя около 400 нанометров. Сравнительное исследование было проведено для обеспечения того, чтобы нано-КТ полностью совместим с гистопатологией.
Мультимодальный подход к визуализации подтвердил результаты, полученные с помощью обоих методов. Во время инкубации очень важно, чтобы образец полностью окружен раствором окрашивания. Кроме того, при выполнении КТ рентгеновской визуализации, наиболее важным фактом является обеспечение стабильности выборки во время сбора данных.
Образцы мягких тканей, которые были проанализированы с помощью нашего протокола, могут быть дополнительно проанализированы с помощью стандартной гистологической техники, такой как противоуступление гематоксилина. Наш протокол окрашивания будет в значительной степени способствовать продвижению 3D рентгеновской гистологии. Медицинские исследования будут особенно выгоду от этой неразрушающей 3D-изображения техники.
