使用 X 射线特定染色方法和纳米计算机断层扫描对软组织样本进行 3D 成像

我们的新协议实际上允许我们使用 X 射线计算机断层扫描以 3D 方式可视化蜂窝结构。我们通过用 eosin 染色组织来做到这一点，并这样使细胞质可见。除了医学应用和研究，我们还认为我们的方法可以应用于生物学，例如动物学研究或发育生物学。

该技术相对简单，非常快，也适合较大的组织样本。我们认为，我们的方法与X射线微计算机断层扫描相结合，可以集成到临床工作流程中，然后实际帮助病理学家做出更好的决策。首先固定软组织样本。

将 50 毫升离心管填充含有 9.5 毫升 4%甲醛和 0.5 毫升冰川醋酸的固定溶液。将软组织样品加入离心管，冷藏24至72小时。冷藏后用DPBS溶液清洗软组织样品一小时。

然后将样品染色，将其放入两毫升Eosin Y染色溶液中，并在水平摇板上孵育24小时。第二天，小心地将软组织样品从样品容器中取出，用纤维素纸巾去除多余的染色剂。将放在乙醇蒸汽相上方的圆锥容器中，以储存和进一步使用。

准备适当的样品架，根据手稿指示安装软组织样品，并确保紧密贴合以防止样品在 X 射线 CT 测量期间移动。一旦粘合剂变硬，样品架准备好使用，将鼠标肾脏转移到完整的离心管中，在底部保存几滴 70% 乙醇。将安装的样品放入 X 射线 CT 扫描仪中。

仔细对齐样品后，选择采集参数以获得最佳图像质量。对于提供的微 CT 数据，使用 1601 投影在 360 度以上均匀分布的 1601 投影，以 50 千伏的峰值电压和 3.5 瓦的电流获取扫描。然后使用概览扫描中的微 CT 数据选择高分辨率 CT 扫描感兴趣的区域。

使用手术刀和立体显微镜将软组织样本切成大约 0.5 毫米边缘长度的非常小的碎片，以制备大量感兴趣的软组织样本。如果使用鼠标肾脏，则沿最长轴将它切成两半。服用一半，准备不同的解剖区域，如肾皮质和肾脑。

将小块转移到新的培养皿中进行脱水。根据手稿方向使用一系列乙醇溶液对样品进行脱水，执行每个脱水步骤一小时。将脱水样品转移到微孔胶囊中并关闭。

使样品与100%乙醇保持接触。然后临界点干燥小组织件。一旦组织样本准备好，将它们放在一个新的培养皿中，然后储存在干燥器中，然后进一步使用。

将组织件安装到适当的样品支架上，确保紧密贴合。对于小鼠肾脏，使用立体显微镜将碎片超粘到样品架上。仔细对齐样品后，选择采集参数以获得最佳成像质量。

对于呈现的 nano-CT 数据，以 60 千伏的峰值电压获取投影，1599 个投影均匀分布在 360 度以上，体受到大约 400 纳米的体美大小。该协议用于小鼠肾脏微观组织结构的三:低分辨率微CT测量允许对整个器官进行概述，并有助于识别高分辨率测量感兴趣的体积。

同一小鼠肾脏用于获取高分辨率微CT数据。实现了解剖结构的更详细视图，如皮层、外层和内梅杜拉等。兴趣渲染量显示梅杜拉区域和通过容器的虚拟部分。

纳米CT用于获取细胞水平上肾脏样本的详细视图。从整个小鼠肾脏获得的一小块组织被用来成像亨勒环的厚上升四肢，体骨大小约为400纳米。进行了一项比较研究，以确保纳米CT与历史学完全兼容。

多模式成像方法证实了通过这两种方法获得的结果。在孵化步骤中，样品完全被染色溶液包围至关重要。此外，在进行 CT X 射线成像时，最重要的事实是确保数据采集期间的样品稳定性。

使用我们的协议分析的软组织样本可以使用标准组织学技术（如反污血氧素）进一步分析。我们的染色协议将大大有助于推进3D X射线组织学。医学研究将特别受益于这种无损的三维成像技术。